Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект "Создание с использованием генетических технологий и изучение новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и диетической ценностью" напрямую отвечает ключевой задаче "Н2-1-1. Получение новых линий растений с повышенной устойчивостью к болезням и вредителям, гербицидам, сложным климатическим условиям, обладающих улучшенной пищевой и технологической ценностью, увеличенным сроком хранения продукции" в рамках раздела "Н2-1. Разработка генетических технологий, применяемых в растениеводстве" направления "Н2. Генетические технологии для развития сельского хозяйства". В работе проводится модификация зерновых, зернобобовых, овощных, бахчевых, плодовых и других культур, для того чтобы менять в заданную сторону биохимический состав семян, плодов или корнеплодов, отвечая требованиям рынка диетического и функционального питания и в целом требованиям современной пищевой промышленности; изменять габитус растений с целью снижения ресурсных затрат при производстве; контролировать форму и размер плодов; увеличивать продуктивность; влиять на скорость развития растений для диверсификации будущих сортов по срокам спелости в ответ на требования к конвейерному типу производства определенных культур и на повышение адаптации к неблагоприятным условиям среды. В отчетном году для выполнения проекта создана лаборатория «Центр генетических технологий ВИР». К настоящему моменту в работу уже вовлечены 12 объектов (однодольные ячмень, кукуруза и чуфа и двудольные свекла, редис, люцерна, горох, соя, вигна, актинидия (киви), виноград, арбуз). В рамках решения общей проблемы в сфере редактирования растений – генотип-специфической зависимости способности к соматическому эмбриогенезу, ограничивающей широкое внедрение технологий редактирования в практику, – за отчетный период получены транскриптомы каллусов эмбриогенной и неэмбриогенной линий M. truncatula, что позволит далее выявить гены, ингибирующие и стимулирующие процессы каллусообразования и соматического эмбриогенеза. В работах на ячмене отобраны индивидуальные растения с различными мутациями «gain-of-function» по гену Myc2 и получены трансформанты по гену Cle3, что является основой для верификации протоколов восстановления функции генов при помощи механизма NHEJ (впервые в мире), получены трансформанты гибридов F2 GP/PLP (генотип Ant2Ant2) для дальнейшего выделения нокаутных мутантов для уточнения функций и возможного плейотропного эффекта гена Ant2 и проведен комплексный сравнительный анализ ранее полученных нокаутных линий по гену Nud и Win1. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии негативного плейотропного эффекта, обусловленного мутацией в гене Nud, приводящей к голозерности, и предполагают, что данная мутация не снижает качества зерна и его питательной ценности. Нокаут гена Nud повышает устойчивость зерна к неблагоприятным абиотическим фактором до и во время прорастания. Проведенный транскриптомный анализ позволит впервые описать на молекулярно-генетическом уровне уникальный механизм пленчатости, выработанный эволюционно только у ячменя (яркий пример конвергентной эволюции). Показано, что ген Win1 не влияет на устойчивость к листовым грибным болезням и осмотическому стрессу, но снижает радиочувствительность растений. Выделены эффективные гаплоиндукторные линии для дальнейшего использования в создании редактированных гомозиготных линий и подобраны генотипы из коллекции кукурузы ВИР для дальнейшего редактирования по генам биосинтеза крахмала, созданы генетические конструкции для нокаута генов waxy endosperm (wx) и amylase extender (ae) у кукурузы. Впервые успешно введены в культуру in vitro образцы чуфы и выявлен ген CNR1 чуфы, что позволит в дальнешем создать нокаутные линии с целью повышения продуктивности. Идентифицирован полный набор генов семейств ANT и CNR у свеклы и редиса, проведен анализ динамики их экспрессии при развитии запасающего корня, в результате определены конкретные кандидаты на роль регуляторов роста запасающего корня. На основе проведенного биохимического и молекулярно-генетического анализа выбраны гены-мишени, участвующие в биосинтезе беталаинов, для продолжения работ по созданию новых линий нетрансгенной столовой свеклы, отвечающих требованиям современной пищевой промышленности. На бобовых растениях, во-первых, глубокий анализ систем генов участвующих в клубенокообразовании у люцерны и гороха позволил выделить мишени для дальнейшего улучшения симбиотической фиксации азота с целью повышения продуктивности этих культур, во-вторых, выбраны и изучены объекты редактирования и гены-мишени для повышения содержания амилозы у коммерческих сортов гороха овощного назначения, в третьих, для решения задачи по расширению ареалов возделывания сои и вигны и улучшения пригодности к механизированной уборки вигны сделано следующее: разработаны конструкции для нокаута генов Е4 сои и TFL1 вигны, выделен и секвенирован транскриптом контрастных образцов вигны для поиска новых селекционно значимых генов-мишеней для возделывания вигны спаржевой в Приморье. По плодовым и ягодным: у актинидии (киви) идентифицированы ключевые гены биосинтеза антоцианов, сконструированы праймеры для клонирования и ресеквенирования аллельных вариантов у отобранных образцов киви с хорошей регенерационной способностью; сформирована выборка образцов винограда, отличающихся по окраске кожуры и мякоти ягоды, а также сахарокислотному индексу, разработаны конструкции для редактирования генов MybA1 и IdnDH. С целью дальнейшего ускоренного создания при помощи редактирования сортов арбуза с заданной формой плода успешно введены в культуру in vitro отобранные образцы, контрастные по данному признаку. Таким образом, как и планировалось, в первый год работы получены значимые результаты по не менее чем 10 культурам не менее чем 16 генам-мишеням, значимые для создания с использованием генетических технологий новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и пищевой ценностью. Результаты отличаются высокой степенью новизны - в проекте охвачены как новые в плане редактирования культуры, так и новые гены-мишени а также генотипы, впервые вовлекаемые в генно-инженерные исследования. Проведенные работы закладывают фундамент для масштабирования подобных работ в объеме требований современной селекции.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Настоящий проект "Создание с использованием генетических технологий и изучение новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и диетической ценностью" напрямую отвечает ключевой задаче "Н2-1-1. Получение новых линий растений с повышенной устойчивостью к болезням и вредителям, гербицидам, сложным климатическим условиям, обладающих улучшенной пищевой и технологической ценностью, увеличенным сроком хранения продукции" в рамках раздела "Н2- 1. Разработка генетических технологий, применяемых в растениеводстве" направления "Н2. Генетические технологии для развития сельского хозяйства". В работе проводится модификация зерновых, зернобобовых, овощных, бахчевых, плодовых и других культур, для того чтобы менять в заданную сторону биохимический состав семян, плодов или корнеплодов, отвечая требованиям рынка диетического и функционального питания и в целом требованиям современной пищевой промышленности; изменять габитус растений с целью снижения ресурсных затрат при производстве; контролировать форму и размер плодов; увеличивать продуктивность; влиять на скорость развития растений для диверсификации будущих сортов по срокам спелости в ответ на требования к конвейерному типу производства определенных культур и на повышение адаптации к неблагоприятным условиям среды. В рамках решения общей проблемы в сфере редактирования растений – генотип-специфической зависимости способности к соматическому эмбриогенезу, ограничивающей широкое внедрение технологий редактирования в практику, – за отчетный период на основе сравнительного транскриптомного анализа линии M. truncatula с разной эмбриогенностью создана база данных; с помощью полученной базы данных проведен поиск предполагаемых стимуляторов и репрессоров соматического эмбриогенеза, которые можно будет использовать в качестве морфогенетических регуляторов для оптимизации процессов трансформации и редактирования генома. В работах на ячмене в поколении Т3 выделено 10 гомозиготных нетрансгенных и 2 трансгенные линии ячменя с мутациями в гене Myc2. Анализ фенотипа (по окраске зерновки) показал смещение спектра в направлении фиолетовой и синей окраски в сравнении с неокрашенным зерном. Анализ мутантов Т1 по гену Cle3 выявил три растения с фиолетовой окраской оболочек зерна, которые далее по мере созревания растения приобретали черный цвет. Получены нетрансгенные растения Т2 с разнообразными гомозиготными мутациями в гене Ant2, фенотипическая оценка показала роль данного гена в накоплении антоцианов. Сравнения транскриптомов ранее полученных редактированных линий по генам Nud и Win1 выявило наиболее стабильные гены метаболизма липидов (вовлеченные в формирование, соответственно, пленчатого фенотипа и формирование кутикулярного воска), которые были выделены как будущие гены-кандидаты для исследования функции путем нокаута. Полученные сравнительные данные анализа линий ячменя, нокаутных по генам Nud и Win1 на холодоустойчивость, устойчивость к засолению и к токсическому действию ионов тяжелых металлов позволили обосновать комплекс физиологических параметров, характеризующих чувствительность/устойчивость нокаутных линий к разным стрессовым факторам, а также прогнозировать устойчивость нокаутных линий по гену Nud и Win1 к этим факторам на поздних этапах развития растений. В экспериментах на других однодольных растениях осуществлена трансфекция протопластов гаплоиндукторных линии кукурузы генетическими конструкциями для нокаута генов waxy endosperm (wx) и amylase extender (ae) (по отдельности и мультиплексный вариант) и трансфекция протопластов чуфы (Cyperus esculentus), созданы конструкции для дальнейшей трансформации с помощью агробактерий. Кроме того, впервые секвенирован и собран геном чуфы. Наличие последовательностей генома чуфы позволят ускорить поиск мишеней для изучения генетических аспектов роста и развития растений данной культуры. В части работы по свекле созданы конструкции для сверхэспрессии выявленных генов-кандидатов семейств ANT - BvANT1 и BvANT2 свеклы, проведена трансформация проростков свеклы штаммами Agrobacterium rhizogenes, несущими полученные конструкции, с целью создания композитных растений, сверхэкспрессирующих в корнях гены BvANT1 и BvANT2 - кандидаты на роль регуляторов роста запасающего корня. Разработан дизайн конструкций для редактирования гена BvDODA1, участвующего в биосинтезе бетанинов свеклы для продолжения работ по созданию новых линий нетрансгенной столовой свеклы, отвечающих требованиям современной пищевой промышленности. В части работы с растениями семейства бобовых на основе транскриптомного анализа корней гороха со сверхэкспрессией гена PsCLE13, получены данные по экспрессии генов, являющихся потенциальными корневыми мишенями системы авторегуляции клубенькообразования у бобовых растений, и изучена их возможная роли в контроле численности симбиотических клубеньков. Важно отметить, что среди генов с повышенной экспрессией в корнях были выявлены два гена – гомолога генов TOO MUCH LOVE (TML) люцерны, кодирующие F-box-белки – негативные регуляторы симбиоза. При этом в исследовании на люцерне выявлен системный характер регуляции экспрессии генов TML1 и TML2 с участием MtCLE35. Данные результаты представляют ценность для дальнейшего улучшения симбиотической фиксации азота с целью повышения продуктивности этих культур. На основе молекулярно-генетического анализа генов, участвующих в биосинтезе крахмала гороха, сконструирована нРНК для нокаута генов SBEI и SBEII с целью повышения содержания амилозы у коммерческих сортов гороха овощного назначения. Для продолжения работ, направленных в конечном счете на расширение ареалов возделывания сои и вигны и улучшения пригодности к механизированной уборке вигны осуществлена трансформация вигны и сои конструкциями для нокаута генов TFL1 и E4, соответственно; верифицированы выделившиеся ДЭГ (дифференциально экспрессирующиеся гены) по результатам проведенного ранее сравнительного транскриптомного анализа образцов вигны, контрастных по типу роста стебля в условиях повышенной влажности; среди ДЭГ определен перечень новых генов-кандидатов для дальнейшего редактирования вигны. По плодовым и ягодным: для дальнейшего редактирования образцов киви (для изменения окраски мякоти плодов) и винограда (с целью изменения окраски кожуры и мякоти ягоды, а также изменения сахарокислотного индекса) разработана серия конструкций для редактирования генов MybA1 и IdnDH с учетом аллельных отличий у сортов, которые ранее были отобраны для редактирования по хорошей регенерационной способности. С целью дальнейшего ускоренного создания при помощи редактирования сортов арбуза с заданной формой плода секвенированы и охарактеризованы аллели гена О (ClFS1) у форм арбуза с наиболее эффективной регенерацией, сконструирована нРНК для редактирования гена О. Таким образом, получены значимые результаты по не менее чем 10 культурам не менее чем 16 генам-мишеням, значимые для создания с использованием генетических технологий новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и пищевой ценностью. Результаты отличаются высокой степенью новизны - в проекте охвачены как новые в плане редактирования культуры, так и новые гены-мишени а также генотипы, впервые вовлекаемые в генно-инженерные исследования. Проведенные работы закладывают фундамент для масштабирования подобных работ в объеме требований современной селекции.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Настоящий проект "Создание с использованием генетических технологий и изучение новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и диетической ценностью" напрямую отвечает ключевой задаче "Н2-1-1. Получение новых линий растений с повышенной устойчивостью к болезням и вредителям, гербицидам, сложным климатическим условиям, обладающих улучшенной пищевой и технологической ценностью, увеличенным сроком хранения продукции" в рамках раздела "Н2- 1. Разработка генетических технологий, применяемых в растениеводстве" направления "Н2. Генетические технологии для развития сельского хозяйства". В работе проводится модификация зерновых, зернобобовых, овощных, бахчевых, плодовых и других культур, для того чтобы менять в заданную сторону биохимический состав семян, плодов или корнеплодов, отвечая требованиям рынка диетического и функционального питания и в целом требованиям современной пищевой промышленности; изменять габитус растений с целью снижения ресурсных затрат при производстве; контролировать форму и размер плодов; увеличивать продуктивность; влиять на скорость развития растений для диверсификации будущих сортов по срокам спелости в ответ на требования к конвейерному типу производства определенных культур и на повышение адаптации к неблагоприятным условиям среды. В рамках решения общей проблемы в сфере редактирования растений – генотип-специфической зависимости способности к соматическому эмбриогенезу, ограничивающей широкое внедрение технологий редактирования в практику, – за отчетный период на основе созданных конструкций для нокаута стимуляторов и репрессоров соматического эмбриогенеза были проведены трансформации эмбриогенной и неэмбриогенной линий M. truncatula, соответственно. Дальнейшая проверка создаваемых мутантов поможет валидировать факторы, которые можно будет использовать в качестве морфогенетических регуляторов для оптимизации процессов трансформации и редактирования генома. В работах на ячмене получены новые знания о молекулярно-генетических механизмах формирования признаков антоциановой окраски у злаков и впервые доказано, что редактирование на основе механизма NHEJ (non-homologous end joining) можно применять не только для нокаута генов, но и, наоборот, для восстановления функции генов (в том случае, если ранее эта функция была ранее нарушена естественной мутацией по типу сдвига рамки считывания). В экспериментах на других однодольных растениях (чуфа и гаплоиндукторные линии кукурузы) после апробации широкого спектра методов доставки редактирующих конструкций предложены наиболее перспективные подходы для работы с этими объектами. В части работы на корнеплодах (свекла, редис) показано, что созданные трансформанты со сверхэспрессией генов ANT имеют повышенные уровни экспрессии ряда генов-регуляторов активности камбия и развития запасающего корня. Для свеклы в рамках редактирования генов синтеза беталаинов получены трансформанты с таргетами для нокаута BvDODA. Подтвержденная роль генов ANT и BvDODA1 позволят рассматривать их далее как ключевые мишени для управления товарными качествами. В части работы с растениями семейства бобовых получены трансгенные корни гороха с событиями редактирования в генах PsCLE12 и PsCLE13 (для изменения клубенькообразования), и растения вигны с измененным типом роста стебля, а также трансформанты гороха и сои с редактирующими конструкциями генов биосинтеза крахмала и сроков созревания, соответственно. По плодовым и ягодным: для дальнейшего редактирования образцов киви (для изменения окраски мякоти плодов) и винограда (с целью изменения окраски кожуры и мякоти ягоды, а также изменения сахарокислотного индекса) проверены ранее разработанные конструкции для редактирования генов Myb и IdnDH. Для редактирования арбуза по гену О с целью управления формой плода арбуза осуществлена разработка векторной конструкции на основе плазмиды pKSE401. Таким образом, получены значимые результаты по не менее чем 10 культурам не менее чем 16 генам-мишеням, значимые для создания с использованием генетических технологий новых линий растений, адаптированных к меняющимся условиям окружающей среды, обладающих повышенной продуктивностью и пищевой ценностью. Результаты отличаются высокой степенью новизны - в проекте охвачены как новые в плане редактирования культуры, так и новые гены-мишени а также генотипы, впервые вовлекаемые в генно-инженерные исследования. Проведенные работы закладывают фундамент для масштабирования подобных работ в объеме требований современной селекции.