Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Работа по проекту в отчётный период была направлена на выявление адаптационных изменений бактерий Staphylococcus aureus FDA209P вследствие воздействия субингибиторных концентраций липогликопептидного антибиотика Гауземицина А. Гауземицин А, раннее описанный как антимикробный пептид (АМП) 5812-A/C, является представителем нового семейства природных липогликопептидов, продуцируемых Streptomyces roseoflavus INA-Ac-5812. Данный АМП в экспериментах in vitro продемонстрировал высокую антибиотическую активность в отношении клинически значимых грамположительных микроорганизмов, включая устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA). Чтобы изучить резистентность к гауземицину А, в работе проведена in vitro селекция устойчивости к Гауземицину А штамма Staphylococcus aureus FDA209P. После 20 пассажей мутантный штамм характеризовался увеличением минимальной ингибирующей концентрации Гауземицина А с 2,5 до 200 мкг/мл. Приобретенная резистентность оказалась стабильной, поскольку при 17-кратном пересеве на среде без антибиотика, восстановления чувствительности к Гауземицину А не происходило. Адаптация бактерий S. aureus FDA209P к исследуемому липогликопептидному противомикробному препарату сопровождалась незначительным снижением скорости роста по сравнению с исходным штаммом. Параллельно с этим была проведена оценка чувствительности к спектру антибактериальных препаратов для оценки возможного влияния селекции устойчивости к гауземицину А на чувствительность к другим антибиотикам. Показано, что резистентный мутант S. aureus 5812R обладал перекрестной устойчивостью к даптомицину, цефазолину, тетрациклину и гентамицину, при этом чувствительность к ванкомицину, низину и рамопланину не изменилась в сравнении с диким типом. В тоже время, повысилась чувствительность штаммаS. aureus 5812R в сравнении с диким типом к антибиотику из группы фторхинолонов (ципрофлоксацину). Поскольку мишенью действия гауземицина А является цитоплазматическая мембрана, на следующем этапе работы мы оценили влияние исследуемого липогликопептида на состав жирных кислот фосфолипидов мембраны. Установлено, что цитоплазматическая мембрана S. aureus 5812R характеризовалась увеличением относительной доли насыщенных жирных кислот с антеизо-разветвленной цепью, тогда как доля жирных кислот с изо-разветвленной снизилась. Также мы оценили уровень экспрессии генетической детерминанты, ответственной за синтез кардиолипина (cls2), и обнаружили, что резистентный к гауземицину А мутант S. aureus 5812R характеризовался повышенной относительной экспрессией гена cls2 в сравнении с исходным штаммов, что может быть одним из факторов, способствующих усилению толерантности S. aureus 5812R к гауземицину, поскольку известно, что кардиолипин играет важную роль в компенсации изменений жесткости клеточной стенки и накапливается в бактериальных мембранах в условиях стрессовых воздействий. В ходе выполнения проекта мы впервые проанализировали антибактериальное действие in vitro антимикробного пептида гауземицина А при сочетании с конвенциальными антибиотиками (ципрофлоксацин, гентамицин, ампициллин, даптомицин), имеющими различные механизмы антимикробного действия в отношении грамположительных бактерий. Изучение синергетических эффектов антибактериального действия антимикробных пептидов (АМП) и конвенциальных антибиотиков является частью поиска оптимальных путей применения АМП в медицине, учитывая необходимость поиска новых подходов для борьбы с мультирезистентными бактериями. В наших исследованиях наличие синергетического эффекта выявлено для комбинации гауземицина А с ципрофлоксацином в отношении исследуемого гауземицин А-резистентного штамма S. aureus 5812R. Аддитивный эффект определен для сочетаний гауземицина А с ампициллином и гентамицином. Полученные данные свидетельствует о перспективности создания препаратов на основе АМП и использования их для лечения инфекционных заболеваний в комбинации с другими антибиотиками.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
Формирование резистентности к антимикробным препаратам — генетически обусловленный процесс, который может быть ассоциирован с мутациями генома и/или изменением уровня экспрессии генов. В связи с этим, работы, выполненные в отчетном году, были посвящены изучению молекулярных механизмов, лежащих в основе устойчивости Staphylococcus aureus FDA209P к гауземицину А. Основным методом изучения был анализ результатов полногеномного секвенирования исходного штамма S. aureus FDA209P и его изогенного мутанта S. aureus 5812R, характеризующегося устойчивостью к гауземицину А. Использован гибридный подход к сборке геномов, включающий дополнение коротких точных данных секвенирования второго поколения MiSeq (Illumina) более длинными, но менее точными данными MinION (Oxford Nanopore Technologies), позволивший получить непрерывные геномы исследуемых штаммов. Секвенированные геномы имели покрытие ×516 и ×519 для S. aureus FDA209P и S. aureus 5812R, соответственно. Собранные и аннотированные последовательности геномов депонированы в базе данных GenBank NCBI под номерами JANQDW000000000 (S. aureus FDA209) и JANPYH000000000 (S. aureus 5812R). В ходе сравнительного анализа геномов у варианта, устойчивого к гауземицину А были выявлены мутации, возможно участвующие в развитии резистентности. Так, в геноме S. aureus 5812R определена миссенс-мутация в регуляторной системе VraTSR, координирующей бактериальный ответ на нарушение синтеза клеточной стенки (ген vraT, мутация Arg124Gly). Данная мутация, вероятно, активизирует систему vraTSR, поскольку нами зафиксировано значительное увеличению уровня транскрипционной активности гена vraS у S. aureus 5812R в сравнении с S. aureus FDA209P. Мутация сдвига рамки считывания в результате делеций определена для трех генов: 1) в гене hepT (Met314fs), участвующем в биосинтезе менахинона- важного компонента цепи переноса электронов у грамположительных бактерий; 2) в глобальном регуляторе KdpE (His196fs), который являясь ДНК-связывающим белком, регулирует ряд локусов вирулентности посредством прямого связывания с промоторными областями этих генов; 3) в гене sepA (Phe116fs), ответственном за множественную устойчивость к антисептическим соединениям. Таким образом, мы можем предположить, что формирование гауземицин А- резистентного фенотипа может быть связано с мутациями в вышеуказанных генах, что согласуется с раннее проведенными исследованиями механизмов резистентности S. aureus к различным антимикробным пептидам, включая ванкомицин, далбаванцин, теиксобактин (Werth B.J. et al., 2018; Gardete S. et al., 2012; Lloyd D.G. et al., 2020). Однако, подтверждение роли описанных мутаций в формировании резистентности к гауземицину А требует дополнительных исследований. Молекулярные механизмы, контролирующие интегрированный ответ микробной клетки на стресс, вызванный антибиотиком, могут быть связаны с изменение экспрессии одного или группы генов, обеспечивающих выживание и пролиферацию клетки. Для этого были отобраны гены-кандидаты, которые потенциально могут быть вовлечены в формирование резистентности к гауземицину А и проведен анализ уровня их экспрессии. Двухкомпонентные регуляторные системы (TCS) являются основной стратегией, используемой бактериями для адаптации к меняющимся условиям среды посредством передачи сигнала. Анализ относительного уровня экспрессии генов продемонстрировал значимое увеличение транскрипции гена walK двухкомпонентной системы, играющей центральную роль в регуляции метаболизма клеточной стенки и гена vraS регуляторной системы, координирующей бактериальный ответ на нарушение синтеза клеточной стенки. Кроме того, результаты транскрипционного анализа продемонстрировали увеличение уровня экспрессии гена pgsA (фермент, катализирующий первичную реакцию биосинтеза фосфатидилглицерола бактериальной мембраны) и гена clpX (протеаза необходимая для вирулентности и выживания в условиях стресса). Таким образом, анализ профиля экспрессии отобранных генов показал, что механизмы, лежащие в основе развития резистентного к гауземицину А фенотипа включают в себя модификации в структуре бактериальной клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, которые управляются различными двухкомпонентными регуляторными системами.