Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетный период проводилась работа по изучению строения личинок дальневосточного трепанга A. japonicus и камчатского краба P. camtschaticus на разных стадиях развития. У голотурий было описано формирования мезодермальных производных при метаморфозе и сразу после оседания ювенильных особей. У краба были исследованы макроморфология пищеварительной системы и ультраструктура кишечного эпителия. Кроме того, были изучены способности к регенерации у трепанга в разном возрасте и при различных повреждениях. Показано, что трех- и шести-месячные ювенильные особи обладают сходным регенераторным потенциалом. Восстановление кишки у них после эвисцерации занимает 10-15 сут, что меньше, чем у взрослых особей. Исследованные ювенильные особи также хорошо регенерируют после поперечного разрезания и после поперечного разрезания с предварительной эвисцерацией. В последнем случае формирование кишечного эпителия у животных, вероятно, происходит за счет трансдифференцировки клеток целомического эпителия. Был проведен анализ транскриптома личинок разных стадий развития камчатского краба. Были выявлены дифференциально экспрессирующиеся гены, кодирующие ряд транскрипционных факторов и компонентов сигнальных путей. В рамках изучения патогенов, влияющих на численность промыслово-важных видов ракообразных в диких и искусственно-воспроизводимых популяциях проведен структурный и генетический анализ паразитической динофлагелляты рода Hematodinium у представителей трех видов крабов Paralithodes camtschaticus, Chionoecetes bairdi, а также Paralithodes brevipes из популяций тихоокеанского побережья Камчатки. Установлено, что макроскопические и микроскопические признаки патологии у всех инфицированных крабов были сходны. Различия в микроморфологии клеток Hematodinium, которые мы обнаружили у трех видов крабов, были связаны с жизненным циклом и физиологией паразита. Результаты генетического анализа показали, что возбудитель, обнаруженный у P. brevipes, P. camtschaticus и C. bairdi популяций тихоокеанского побережья Камчатки был таким же или очень близким к Hematodinium sp., поражающему многие виды ракообразных Северного полушария. Палочковидный вирус, вызывающий молочную болезнь у крабов-стригунов Сhionoecetes bairdi, обнаружен в клетках соединительной ткани и гемальной жидкости инфицированных особей. Охарактеризован тропизм вируса, установлена его локализация в клетках хозяина и проанализирована ультраструктура вирусных частиц. Показано, что вирус вызывает системное поражение соединительной ткани гепатопанкреаса, кишки, сердца, гонад. Из гемальной жидкости инфицированных особей выделена фракция вирусных частиц, которые будут использованы для проведения генетического анализа. Это позволит уточнить систематическую принадлежность вируса и будет способствовать разработке методов экспресс-диагностики инфекции. Чтобы оценить модификацию и накопление липидов, поступающих с пищей, был проведен анализ состава липидов и жирных кислот (ЖК) в кишечнике и стенке тела особей A. japonicus, выросших в природных условиях и выращенных в марикультурном хозяйстве, а также в кормах, используемых для выкармливания молоди трепанга. Результаты показали, что липиды кормов были богаты изо/антеизо насыщенными ЖК (НЖК), мононенасыщенными ЖК (МНЖК; в основном 18:1n-9 и 18:1n-7) и линолевой кислотой (18:2n-6). Мы показали, что культивирование в условиях дефицита пищевых полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) значительно снижает уровень общих и запасных липидов в кишечнике, изменяет состав ЖК всех тканей и увеличивает разницу в профиле ЖК между стенкой тела и кишечником. Поступающие с диетой C16-18 МНЖК были модифицированы в C20-24 МНЖК, а 18:2n-6 выступала предшественником в биосинтезе 20:4n-6. Знание этих закономерностей может облегчить выбор между подходящими кормами для оптимизации состава липидов и ЖК культивируемых особей трепангов. Изучены клеточные механизмы развития нервной системы промысловых видов двустворчатых моллюсков (японского гребешка Azumapecten farreri и спизулы сахалинской Spisula sachalinensis). Показано, что состав нейросенсорных клеток апикального органа одинаковая, а эргичность и расположение периферических нейронов – разная. Сделан вывод, что несмотря на разные механизмы ранних этапов нейрогенеза личинок двустворчатых моллюсков, общий ганглионарный план строения центральной нервной системы ювенильных и взрослых особей схож. Впервые получены уникальные данные о механизмах нейрогенеза промысловых видов двустворчатых моллюсков, которые могут быть использованы в прикладных исследованиях повышения жизнеспособности личинок в марикультурах Приморского края. Установлена топография иммунопозитивных клеток (по дофамину (DA/TH), серотонину (5-HT), ацетилхолину (Ach/ChAT)) и их отростков в оптических нейропилях, синусной железе и в области Х-органа камчатского краба. Chat- и 5-HT иммунореактивность обнаружена в амакриновых нейронах, тогда как TH иммунореактивность – в отростках тангенциальных нейронов. Впервые установлена экспрессия ChAT- и 5-HT в эндогенных клетках синусной железы, а их расположение около гемального синуса указывает на то, что они могут действовать как локальные модуляторы. Обнаруженная локализация 5-HT- и ChAT-положительных клеток в синусной железе указывает на то, что они могут действовать как локальные модуляторы объемной нейропередачи. Полученные данные позволяют предположить, что участие эндогенных клеток синусной железы в регуляции нейросекреции обеспечивается взаимодействием нескольких нейромедиаторов. В качестве демонстрации успешного получения жизнестойкой молоди промысловых крабов получено и выпущено в естественную среду обитания партия малька камчатского краба в 13000 экз. и партия малька японского мохнаторукого краба в 10000 экз. Мальки крабов выпущены на открытую морскую акваторию залива Петра Великого в районе камней Елизарова у северной границы Морского заповедника. Мальки краба выпущены как компенсация антропогенного воздействия на природные ресурсы морской акватории. В рамках проекта была проведена Первая школа молодых ученых по марикультуре: «Современная марикультура. Биологические, биохимические и молекулярно-генетические подходы» (http://www.imb.dvo.ru/index.php/ru/konferentsii-seminary/684-pervaya-shkola-molodykh-uchjonykh-po-marikulture-sostoyalas).

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В отчетный период проводилась работа по изучению регенерации кишки у дальневосточного трепанга A. japonicus и строения личинок камчатского и мохнаторукого крабов. Было показано, что у трепанга скорость и механизмы регенерации пищеварительной системы не зависят от возраста. Клеточным источником формирования кишечной выстилки являются энтероциты оставшейся части пищевода. При этом большую роль в морфогенезе играет клеточная пролиферация. У камчатского краба исследовали развитие личинок в ранний период развития и были определены этапы эмбриогенеза. Были получены личинки мохнаторукого краба и описано их строение. Была выделена РНК и синтезированы библиотеки для дальнейшего секвенирования транскриптома из личинок стадий презоэа, зоэа I, зоэа V, мегалопа и ювенил. Изучено строение и развитие нервной системы промыслового вида гребешка Azumapecten farreri. Показано неравномерное распределение серотонин- и FMRFamide-иммунореактивных клеток и нейритов во все ганглиях гребешка. Описано появление первых нейронов на стадии раннего велигера и их роль в поведении (всплытие-оседание) личинок в лабораторных условиях. Проведены физиологические эксперименты по выявлению роли серотонин- и дофаминэргических систем личинок A. farreri. Показано, что увеличение серотонина в личинках гребешка приводит к плавательной активности и всплытию личинок, в то время как активация дофаминовой системы - наоборот, к оседанию личинок. Таким образом, 2 нейромедиаторные системы являются антагонистами поведения личинок в толще воды и дают возможность регуляции поведения, скорости развития и метаморфоза личинок двустворчатых моллюсков. Получены новые данные о нейрохимической организации глазных стеблей королевского краба Paralithodes camtschaticus. В нейроэндокринном центре глазных стеблей взрослого краба иммуноцитохимически впервые обнаружены такие нейротрансмиттеры, как дофамин, серотонин и ацетилхолин. Предположено, что найденные в глазных стеблях нейротрансмиттеры могут действовать как локальные модуляторы и участвовать в синтезе и высвобождении пептидных гормонов и регуляции их секреции. Дальнейшие исследование деталей строения и нейрофизиологии королевского краба даст возможность корректировать гормонально регуляцию роста и развития, нереста и линьки у коммерчески ценных видов ракообразны. Крабы являются ценным объектом коммерческого рыболовства из-за высоких вкусовых качеств их мяса. Впервые были определены составы молекулярных видов запасных и структурных липидов в липидах ювенильных особей камчатского краба, мышечной ткани и гепатопанкреаса камчатского и мохнаторукого крабов. Большинство молекулярных видов запасных триацилглицеринов в ювенильных особях камчатского краба содержали n-3 полиненасыщенные жирные кислоты (докозагексаеновую (22:6n-3) и эйкозапентаеновую (20:5n-3) кислоты), арахидоновую кислоту (20:4n-6) и олеиновую (18:1n-9) кислоту. В составе исследованных структурных липидов (этаноламин-, инозитол-, серин- и холинглицерофосфолипидов) мышц и гепатопанкреаса камчатского и мохнаторукого крабов преобладали n-3 полиненасыщенные жирные кислоты. Липиды исследованных крабов являются богатым источником полиненасыщенных жирных кислот, которые концентрируются как в структурных фосфолипидах, так и запасаются в виде триацилглицеринов. Добавление в диету продуктов, содержащих высокие концентрации n-3 ПНЖК, будет способствовать поддержанию оптимального баланса n-3 и n-6 ПНЖК, а также служить источником необходимых для нормального функционирования нервной системы фосфолипидов. Проведен анализ генома вируса, вызывающего синдром молочной гемолимфы у промыслово-важного вида крабов стригуна Chionoecetes bairdi (BvCB ). В результате секвенирования была получена полная последовательность кольцевого генома длиной 245567 нуклеотидов. Содержание GC составило 39,97% , число открытых рамок считывания (генов) - 120. Проведено сравнение генома BvCB с геномами других палочковидных вирусов, принадлежащих к семействам Nudiviriidae и Nimaviriidae. Из 120 генов BvCB, 110 генов входили в ортогруппы, из которых 50 были консервативными для всех изученных видов сем. Nimaviriidae. На основании анализа генома вируса BvCB установлена его принадлежность к сем. Nimaviriidae - палочковидных двухцепочечных ДНК-вирусов, поражающих водных членистоногих. В составе генома выделены группы наиболее эволюционно-консервативных генов, встречающихся у всех палочковидных ДНК-вирусов, а также гены, характерные для представителей сем. Nimaviriidae. В геноме BvCB идентифицированы гены, отражающие его гомологию с WSSV, наиболее исследованным представителем сем. Nimaviriidae и одним из наиболее значимых для аквакультуры патогенов. Сравнение геномов BvCB и BvCО, показало их высокую гомологию, что подтверждает данные ультраструктурного анализа вирионов. На основании сведений о структуре генома BvCB разработаны праймеры для проведения экспресс-диагностики инфекции Отработаны оптимальные корма для откорма серого ежа на основе морской капусты. Разработана и успешно апробирована опытно-промышленная технология производства жизнестойкой молоди камчатского и японского мохнаторукого крабов. Отработана транспортировка и процедура выпуска малька краба на естественное местообитание. Исследована выживаемость и плотность поселения малька краба. Разработан алгоритм экспресс-учета численности культуры зеленой водоросли Tetraselmis sp.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Изучено личиночное развитие пищеварительной системы у краба Eriocheir japonica. Показано, что основные органы пищеварительной системы имеются уже на стадии зоэа I. С возрастом происходит постепенное усложнение пищеварительного эпителия кишки и усложнение формы гепатопанкреаса. Проведено секвенирование транскриптома краба Eriocheir japonica на разных стадиях развития (зоэа I, зоэа III. зоэа V, мегалопа, ювенильная особь). Был выявлен 351 ген транскрипционных факторов, меняющих свою экспрессию в онтогенезе. Наибольшее число дифференциально экспрессирующихся генов было на стадии зоэа I. Были выявлены гены транскрипционных факторов, уникальные для каждой изученной стадии развития. Исследованы гистопатологические изменения в тканях гепатопанкреаса камчатского краба P. camtschaticus при панцирной болезни. Установлено, что данная патология вызывается грамм-отрицательными бактериями, обладающими литической активностью и вызывающими обширный нероз тканей хозяина. Воздействие патогена на органы-мишени препятствует их функционированию, а инфекция носит летальный характер. Генетическая идентификация патогена на основе гена 16S rRNA показала, что бактерии, содержащиеся в тканях больных крабов, являются представителями вида Aliivibrio logei. Обнаруженная нами способность представителя рода Aliivibrio вызывать синдром панцирной болезни у камчатского краба расширяет наши представления о патогенном потенциале этих широко распространенных в морских экосистемах бактерий. Впервые определена динамика состава и содержания основных запасных липидов триацилглицеринов и структурных липидов (этаноламин-, инозитол-, серин- и холинглицерофосфолипидов) в процессе развития камчатского краба (Paralithodes camtschaticus) и японского мохнаторукого краба (Eriocheir japonica). В образцах личинок мохнаторукого краба на стадии развития зоеа IV и камчатского краба на стадии зоеа III наблюдалось полное исчезновение триацилглицеринов и существенное снижение содержания фосфолипидов, что обусловлено использованием данных липидов в качестве источника энергии и биологически активных медиаторов при интенсивном росте личинок, происходящим на этих стадиях. Снижение уровня фосфолипидов, содержащих докозагексаеновую кислоту и ее отсутствие в составе триацилглицеринов на последних этапах развития личинок крабов указывает на слабое поступление этой жирной кислоты с диетой. Было показано, что личинки камчатского краба на стадии зоеа IV и личинки мохнаторукого краба на стадии зоеа V активно накапливали триацилглицерины растительного происхождения, что связано с использованием в пищу микроводорослей в большей степени по сравнению с зоопланктоном. В ходе данного исследования были получены новые данные о динамике липидов в процессе развития крабов, которые могут быть полезны при выборе стратегии кормления личинок. Были проведены работы по исследованию модуляции серотонин- и дофаминэргической нервной системы личинок устрицы гигантской Crassostrea gigas и регуляции личиночного поведения. Было обнаружено, что в контроле с возрастом личинки тяготеют ко дну. Инкубация с метаболическим предшественником серотонина – 5-гидрокситриптофаном – приводила к увеличению количества всплывших личинок на всех исследованных стадиях развития. Ингибирование синтеза серотонина парахлорфенилаланином (пХФА) приводила, наоборот, к оседанию большинства личинок на стадиях раннего (48 часов) и позднего (6 дней) велигера. На стадии трохофоры (30 часов), наоборот, больший процент личинок всплыл. Предположительно, причиной могут быть отличные механизмы регуляции серотонинэргической системы на ранних и поздних этапах развития у двустворчатых моллюсков. После воздействия серотонина на ранней стадии развития – трохофоры – нами наблюдалось всплытие большей части личинок к поверхности воды, однако на стадии раннего и позднего велигеров реакция была отличной – большая часть личинок на данных стадиях тяготела ко дну. Это так же может быть связано с механизмами регуляции серотонинэргической системы, меняющимися с возрастом у личинок. После инкубации с дофамином всплыла значительная часть личинок, при этом на поздних стадиях они, наоборот, начинают тяготеть ко дну. Такой же эффект наблюдается и после метаболического предшественника дофамина – L-диоксифенилаланина (L-ДОФА). Причиной может быть то, что первые нейроны, содержащие дофамин, появляются только на стадии раннего велигера, вследствие чего может и изменяться реакция личинок на инкубацию с дофамином и L-ДОФА. При этом последовательная инкубация с пХФА, а затем с L-ДОФА – ингибирование синтеза серотонина и стимуляция биосинтеза дофамина - приводила к оседанию большей части личинок на всех стадиях развития – от трохофоры до позднего велигера. Исследована регенерация после поперечного разрезания у голотурии Apostichopus japonicus. Показано, что регенерация осуществляется за счет дедифференцировки клеток остатка кишки. С возрастом длительность восстановления увеличивается, однако это, видимо, связано не с падением скорости регенерации, а с увеличением линейных размеров тела и органов. Проведено исследование по влиянию плотности содержания и кормления на выживаемость и рост молоди крабов. Разработаны опытно-экспериментальные технические условия и технологическая инструкция для садкового подращивания молоди крабов.