Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В экспериментах использовали растения пшеницы контрастных по чувствительности к засухе сортов: Салават Юлаев (СЮ) – чувствительный сорт и Экада-70 (Э-70) – устойчивый сорт. Подбор концентрации нитропруссида натрия (SNP – sodium nitroprusside), оптимальной в стимуляции роста растений пшеницы обоих сортов и их защите от обезвоживания осуществляли путем двух вариантов обработки: присутствие донора NO в среде прорастания и обработка вегетирующих растений. Анализ влияния присутствия в среде прорастания SNP в диапазоне концентраций от 50 до 500 мкМ с градацией в 50 мкМ показал, что максимальный рост-стимулирующий эффект донор NO проявлял в концентрации 200 мкМ. Об этом свидетельствовали данные по всхожести семян, сырой и сухой массе, линейным размерам 3-сут проростков и митотическому индексу апикальной меристемы корней. В присутствии 200 мкМ SNP всхожесть семян обоих сортов увеличивались на 15%, линейные размеры 3-сут проростков Э-70 и СЮ – в 1,5 раза, сырая масса – на 37 % и 33 %, сухая масса на – 24 % и 21 %, и митотический индекс повышался на 33 % 29 %, соответственно. Проращивание семян на растворе 200 мкМ SNP полностью предотвратило торможение роста пшеницы обоих сортов при последующем действии обезвоживания, которое моделировали 24-ч обработкой 3-сут проростков 12 %-ным ПЭГ. При описанном варианте обработки необходимо пересаживать прорастающие семена на свежий раствор донора NO каждые сутки, поскольку растворы SNP характеризуются высокой нестабильностью. Такая процедура является трудоемкой и больше подходит для модельных лабораторных опытов. Для практического применения более подходящей является обработка вегетирующих растений. В связи с чем было исследовано влияние 24 ч предобработки 3-сут растений пшеницы 200 мкМ SNP на их ростовые параметры в норме и при 24 часовом воздействии обезвоживания (ПЭГ 12 %). При этом SNP-обработка также способствовала стимуляции роста пшеницы обоих сортов, индуцируя 18 %-ное и 15 %-ное повышение сырой массы у растений Э-70 и СЮ, соответственно. Стрессовая обработка тормозила рост, вызывая 24 %-ное и 33 %-ное снижение сырой массы проростков Э-70 и СЮ, соответственно. Предобработанные SNP и подвергнутые обезвоживанию образцы отличались от NO-необработанных существенным уменьшением степени негативного действия стресса на их рост. Эти данные свидетельствуют об эффективности применения SNP в концентрации 200 мкМ в стимуляции роста двух контрастных по чувствительности к засухе сортов пшеницы и его защите при воздействии обезвоживания. Поскольку регуляция роста находится под контролем фитогормонов, проявление положительных эффектов NO на рост растений пшеницы может объясняться его влиянием на состояние их гормональный системы. Проведение иммуноферментного анализа фитогормонов, экстрагированных из одной растительной навески, позволило выявить изменения в содержании абсцизовой кислоты (АБК), индолилуксусной кислоты (ИУК) цитокининов (ЦК) в обработанных и необработанных 200 мкМ SNP проростках пшеницы двух исследованных сортов в норме и при воздействии обезвоживания (ПЭГ 12 %). Содержание СК в этих растениях анализировали с помощью ВЭЖХ. NO-обработка в течение 3 ч в растениях СЮ вызвала 12 %-ное повышение концентрации АБК, 23 %-ное – ауксинов и почти 2-кратное увеличение уровня ЦК, в проростках Э-70 к этому времени уровни АБК повышались на 10 %, ауксинов – на 27 % и ЦК – в 2,5 раза. NO-индуцированные повышенные уровни ЦК в проростках обоих сортов сохранялись в ходе 7 ч опыта. Таким образом, стимуляция роста двух сортов пшеницы под влиянием NO может быть связана с увеличением в них уровня ауксинов и цитокининов, принадлежащих к разряду активаторов растительного метаболизма. Сопоставимое в обоих сортах NO-индуцированное повышение уровня АБК может вносить важный вклад в предадаптирующее действие NO к последующим неблагоприятным воздействиям, включая засуху. При стрессовой обработке (12 % ПЭГ 1, 3, 5 и 7 ч) были выявлены сильные изменения в гормональном балансе проростков обоих сортов, связанные с накоплением АБК, падением содержания ЦК и ауксинов. В растениях Э-70 наблюдалось обратимое повышение концентрации АБК, максимум которого, составившее 180 % от уровня контроля, пришелся на 3 ч обработки. Тогда как в растениях СЮ более чем двукратное повышение АБК регистрировалось к 5 ч стресса, которое оставалось почти вдвое повышенным к 7 ч опыта. К этому времени в проростках СЮ было выявлено падение концентрации ИУК и ЦК на62 % и 45 %, а в проростках Э-70 – на 49 % и 37 %, соответственно. Предобработка донором NO способствовала снижению стресс-индуцированного уровня накопления АБК, уменьшения концентрации ИУК и ЦК в проростках обоих сортов. В SNP-предобработанных растениях Э-70 содержание АБК к 3 ч стресса составило 140 % от уровня контроля, а в растениях СЮ ее содержание к 5 и 7 часам стресса составило 157 и 135 %-ное значение от уровня контроля. SNP-предобработанные проростки отличались от NO-необработанных более высоким содержанием ИУК при стрессе, хотя к концу опыта оно оставалось ниже контроля на 20% у растений Э-70 и на 28% в проростках сорта СЮ. SNP-предобработка полностью предотвратила стресс-индуцируемое снижение концентрации ЦК в проростках Э-70 и существенно снизила уровень их падения в растениях СЮ. Таким образом, растения чувствительного сорта СЮ отличались от растений устойчивого сорта Э-70 более значительными сдвигами при стрессе в содержании ФГ, связанными с накоплением АБК, снижением уровня ЦК и ауксинов, что отразилось в более выраженном торможении роста проростков СЮ при воздействии обезвоживания. SNP-обработка в норме способствовала увеличению уровня ауксинов и особенно цитокининов в проростках обоих сортов, чем можно объяснить способность NO активировать ростовые процессы пшеницы. Тогда как протекторный эффект NO на ее рост может быть обусловлен снижением амплитуды стресс-индуцируемых колебаний в содержании ФГ. Реализация положительных эффектов NO может осуществляться при его взаимодействии с салициловой кислотой (СК), о чем свидетельствуют данные ВЭЖХ об увеличении ее уровня в SNP-обработанных проростках и дополнительном накоплении СК в SNP-предобработанных и подвергнутых стрессу образцах. Защитное действие NO на растения пшеницы при воздействии дефицита влаги может быть связано с уменьшением степени окислительных повреждений. В пользу этого предположения служат данные о том, что предобработанные SNP и подвергнутые стрессу проростки отличались от NO-необработанных существенным снижением продукции супероксид-радикала (O2•−) и перекиси (H2O2), что вероятно связано с NO-индуцированным повышением активности супероксиддисмутазы (СОД), катализирующей нейтрализацию O2•−, а так же пероксидазы (ПО) и каталазы (КАТ), участвующих в обезвреживании H2O2. Сведения о 2- и 2.5-кратном увеличении концентрации малонового диальдегида (МДА) в проростках Э-70- и СЮ, соответственно, и примерно 2-кратном в обоих сортах усилении экзоосмоса электролитов к 24 часам стресса указывают на сильное повреждающее действие обезвоживания на мембранные структуры пшеницы. SNP-предобработка проростков не предотвратила, но существенно снизила уровень накопления МДА и выхода электролитов при стрессе в проростках обоих сортов, подтверждая участие NO в защите целостности клеточных мембранных структур в растениях пшеницы от окислительных повреждений при воздействии обезвоживания. Данные ОТ-ПЦР анализа и результаты иммуноблоттинга показали, что подвергнутые обезвоживанию проростки Э-70 отличались от СЮ более высоким уровнем экспрессионной активности TADHN гена дегидрина и накоплением дегидриновых белков с М.м. 22 и 28 к Да. Сведения о дополнительном, индуцированным SNP-обработкой накоплении транскриптов TADHN гена в подвергнутых стрессу образцах, более выраженным в проростках Э-70, могут указывать на вовлечение дегидринов в спектр NO-контролируемых защитных реакций в растениях пшеницы разных сортов при воздействии обезвоживания.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Было проведено исследование эффектов оксида азота (NO) на растения пшеницы двух сортов, различающихся по засухоустойчивости: Экада-70 (Э-70 – устойчивый сорт) и Салават Юлаев (СЮ – чувствительный сорт), при воздействии обезвоживания. NO обработку осуществляли с применением 200 мкМ нитропруссида натрия (SNP – sodium nitroprusside), условия обезвоживания моделировали с помощью ПЭГ-8000 (12%). В экспериментах проводили гистохимическую оценку антиоксидантного действия NO, его участия в процессе лигнификации, регуляции водного режима, синтеза осмопротекторных соединений: иминокислоты пролина и белков дегидринов. В гистохимических исследованиях анализировали продукцию АФК, в частности супероксид-радикала (O₂·−) и перекиси водорода (H₂O₂), степень повреждений клеточных структур и накопление альдегидов, служащих индикатором уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ). Продукцию O₂·− и H₂O₂ оценивали в побегах с использованием нитросинего тетразолия (НСТ) и диаминбензидина (ДАБ). О нарушении целостности клеточных структур и накоплении альдегидов судили по интенсивности окрашивания корней красителем Эванса и реактивом Шиффа, соответственно. Стрессовая обработка индуцировала в обоих сортах образование O₂·− и H₂O₂, на что указывало развитие темно-синего окрашивания НСТ и коричневого окрашивания ДАБ. В корнях обоих сортов пшеницы в виде сине-голубого окрашивания красителем Эванса выявлялись области разрушения клеточных структур и в виде розового окрашивания реактивом Шиффа – места накопления альдегидов. Более высокий уровень окислительных повреждений регистрировался в проростках сорта СЮ. Донор NO не вызывал заметных изменений в интенсивности окрашивания тканей побегов и корней пшеницы, указывая на отсутствие негативного влияния SNP при его использовании в концентрации 200 мкМ. SNP-предобработка значительно снизила стресс-индуцированную генерацию O₂·−, H₂O₂, альдегидов и уровень разрушения клеточных структур в обоих сортах пшеницы, особенно Э-70, указывая на вовлечение NO в защиту пшеницы разных сортов от окислительных повреждений, возникающих при воздействии водного стресса. При гистохимической оценке отложения лигнина, было выявлено, корни контрольных растений Э-70 отличались от СЮ более высоким уровнем лигнификации. SNP-обработка отразилась в некотором усилении лигнификации в обоих сортах. Стрессовое воздействие значительно увеличило интенсивность лигнификации корней, особенно у сорта Э-70. Предобработка донором NO вызывала дополнительную стимуляцию при стрессе отложения лигнина, которая сильнее проявлялась в клеточных стенках корней сорта Э-70. Полученные данные свидетельствует о важном вкладе NO в усиление барьерных свойств клеточных стенок, которое может играть свою роль в повышении устойчивости растений пшеницы к действию обезвоживания. С целью выявления участия NO в регуляции водного режима в условиях дефицита влаги была проведен анализ интенсивности транспирации (ИТ), относительного содержания воды (ОСВ), осмотического потенциала (Ψπ) клеточного сока в проростках пшеницы двух сортов, обработанных SNP подвергнутых последующему обезвоживанию. Контрольные растения Э-70 в отличались от СЮ более высоким уровнем ИТ, что может являться отражением сортовых особенностей процессов водообмена. SNP-обработка не вызывала существенных изменений транспирационной активности. Под влиянием стресса в проростках пшеницы обоих сортов, особенно СЮ происходило сильное угнетение ИТ. SNP-предобработка снизила негативное действие обезвоживания на ИТ и уменьшала ее падение к 5 ч стресса примерно на 30 % и 40 % в проростках Э-70 и СЮ, соответственно. При оценке ОСВ было выявлено, что растения Э-70 характеризовались более высоким уровнем оводненности тканей. SNP-обработка в норме способствовала некоторому повышению ОСВ в обоих сортах пшеницы, что может указывать на активацию поступления влаги в ткани под влиянием NO. Воздействие стресса сильно снижало ОСВ особенно в проростках СЮ. SNP-предобработка предотвратила стресс-индуцированное падение ОСВ в проростках Э-70, и снизила его уровень в растениях СЮ. Способность растений удерживать воду внутри клетки определяется значением Ψπ клеточного сока. SNP-обработка не вызывала изменений Ψπ в обоих сортах. Стрессовая обработка значительно снизила значения Ψπ, при этом негативное влияние стресса было сильнее выражено в проростках СЮ. Показатели Ψπ SNP-обработанных и подвергнутых обезвоживанию проростков были ниже, чем в контроле, но выше чем у SNP-необработанных образцов. Таким образом, нами была выявлена важная роль NO в нормализации водного режима разных сортов пшеницы при воздействии ПЭГ-моделируемой засухи. Между исследованными сортами были выявлены различия в содержании низкомолекулярного осмолита – иминокислоты пролина. В норме проростки засухоустойчивого сорта характеризовались более высоким уровнем его накопления. Обработка проростков обоих сортов SNP в течение 24 ч вызвала в них сопоставимое повышение уровня аккумуляции пролина, что может указывать на его вовлечение в спектр предадаптирующего действия NO к последующему стрессу. Существенное увеличение концентрации пролина наблюдалось при обезвоживании, уровни которого в проростках Э-70 были выше в сравнении с сортом СЮ. Предобработка SNP способствовала дополнительной стимуляции синтеза пролина, что может вносить важный вклад в нормализацию водного режима пшеницы, о чем свидетельствуют данные по ИТ, ОСВ и осмотического потенциала в исследованных сортах, особенно Э-70. Методом иммуноблоттинга с использованием антител к высоко консервативному К-сегменту дегидринов был проведен анализ изменений в содержании этих белков в SNP-предобработанных 5-7 сут проростках, подвергнутых обезвоживанию в течение 1, 2 или 3 суток. Наиболее значимые изменения выявлялись в содержании дегидринов с М.м. 22, 28 и 55 кДа. Максимальное накопление дегидринов с М.м. 22 и 28 кДа выявлялось ко 2-м суткам стресса. Растения Э-70 характеризовались более высокими уровнями стресс-индуцированного накопления дегидринов. Значимое повышение уровня 55 кДа дегидрина наблюдалось в проростках обоих сортов к 3-м суткам стресса. Эти данные позволили предположить, что низкомолекулярные дегидрины (22 и 28 кДа) играют важную роль в защитных реакциях пшеницы обоих сортов на начальных этапах воздействия стресса, тогда как 55 кДа дегидрин может вовлекаться в развитие устойчивости к засухе в более поздние ее сроки. Обработка SNP вызвала в растениях Э-70 примерно 50 %-ное и 30 %-ное повышение уровней накопления 22 кДа и 55 кДа дегидринов, и приблизительно 75 %-ное увеличение синтеза дегидрина с М.м. 28 кДа. В проростках СЮ наибольшую чувствительность к NO-обработке также проявлял дегидрин с М.м. 28 кДа, содержание которого возрастало примерно в 1,5 раза на фоне незначительного повышения уровня 22 кДа дегидрина и отсутствия значимых сдвигов в содержании 55 кДа белка. SNP-предобработанные растения характеризовались дополнительным усилением при стрессе синтеза низкомолекулярных дегидринов, особенно 28 кДа, которое сильнее проявлялось в проростках Э-70. Полученные данные могут служить свидетельством в пользу участия 28 кДа дегидрина в NO-контролируемых защитных реакциях растений пшеницы разных сортов при воздействии обезвоживания. Свой вклад в проявление протекторного действия NO на растения пшеницы от пагубного влияния засухи может вносить дегидрин с М.м. 22 кДа.