Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В результате работ первого года выполнения проекта проведены изучение и оценка способности к миграции вакцинных дендритных клеток (ДК), созданы модельные системы с использованием опухолевых клеток (супернатанты клеточных культур, иммуносупрессивные факторы) в качестве источника элементов опухолевого микроокружения, блокирующих их подвижность. Показано, что максимальное воздействие на подвижность ДК оказывает IL-10, в присутствии которого пройденная дистанция сократилась в 6,5 раз с 291,75±31,07 до 44,45±1,84 мкм, длина траектории с 1423,25±105,21 до 224,25±10,76 мкм, средняя скорость движения ДК снизилась с 30,10±2,23 до 10,45±0,52 мкм/ч. Кроме того, в присутствии TGFβ1(10 нг/мл), VEGF (50 нг/мл) также значительно сокращались дистанция между началом и концом фиксации движения и длина пройденной траектории (p<0,05), но не было выявлено влияние на угол движения клеточной популяции (p>0,05). Используя иммуносупрессивные факторы (TGFβ1, IL-10, IL-8, IL-6, MICA) в качестве источника элементов опухолевого микроокружения, блокирующих подвижность ДК, и адаптированный ранее метод оценки функциональной активности Т- лимфоцитов по их способности к антигенспецифической пролиферации в ответ на взаимодействие со зрелыми ДК, разработана аутологичная модельная система (пациентка Б., 37 лет, синовиальная саркома, содержание изучаемых факторов в периферической крови: IL-10 7,27 пг/мл; IL-8 6,3 пг/мл; IL-6 0,63 пг/мл; MICA 27,04 пг/мл) и продемонстрировано блокирующее воздействие на функциональную активность ДК всех изучаемых иммуносупрессивных факторов от 5,2% до 18,9% относительно контроля пролиферативной активности клона Т-лимфоцитов 58%. Разработана лабораторная модель для изучения функциональнoй активности Т-лимфоцитов при индукции вакцинными ДК под влиянием элементов опухолевого микроокружения, которая может быть использована для контроля качества противоопухолевых клеточных вакцин, а также для мониторинга их эффективности. Для исследования цитотоксической активности эффекторных Т-лимфоцитов разработаны 2D in vitro модели, включающие аутологичные опухолевые клетки (n=18) и Т-клетки больных (n=18) со злокачественными новообразованиями (меланома кожи, саркомы), получающих ДКВ, с использованием аналитической системы xCELLigence®. Выявлено 2 типа взаимодействия с опухолевыми клетками: 1) лабораторная модель №1 – снижение клеточного индекса (CI), в сравнении с контролем культуры клеток аутологичной опухоли под влиянием активированных эффекторных Т-лимфоцитов (n=7); 2) лабораторная модель №2 – отсутствие изменений CI культуры клеток аутологичной опухоли при кокультивировании с активированными Т - клетками эффекторами (n=11) в сравнении с контролем за 72 ч наблюдения. Результаты демонстрируют цитотоксическую способность антигенспецифических Т-лимфоцитов, полученных в процессе индукции зрелыми ДК в отношении аутологичной опухоли, что обусловлено высоким содержанием терминально-дифференцированных цитотоксических Т-лимфоцитов (TEMRA), ЦТЛ продуцирующих GrB и профилем секреции цитокинов. Использование аналитической системы xCELLigence® эффективно для количественного анализа цитотоксической активности Т-лимфоцитов в отношении аутологичной опухоли и обусловлено увеличением ЦТЛ, продуцирующих GrB (p=0,04), TEMRA (p=0,03), секреции цитокинов IL-2 (р=0,0003), TNF-α (р=0,0002). Разработанная лабораторная модель позволяет проводить персонализированный мониторинг и может прогнозировать эффективность проводимого лечения ДКВ. В рамках разработки 3D in vitro модели для оценки специфического противоопухолевого эффекта ДКВ получены и охарактеризованы аутологичные сфероиды из клеточных культур. Подобраны условия формирования сфероидов для каждой клеточной культуры, определены время формирования тумороидов 5,6 (от 5 до 7 дней), размеры сфероидов 207,14х269,5 мкм, подобрана оптимальная концентрация клеток (1х104 клеток на лунку) при использовании низкоадгезивных поверхностей культуральных планшет (Corning, США). Установлено время разрушения сфероидов под воздействием Т-лимфоцитов, активированных ДК 7,3 (от 7 до 8 дней), при этом отмечено снижение жизнеспособности опухолевых клеток до 85,7% (контроль 93,5%). При оценке интеграции Т-лимфоцитов в сфероид методом проточной цитометрии обнаружено 30,8% (от 26,6 до 36,2%) в составе сфероида после его ферментативного разрушения. Разработанные трехмерные двухкомпонентные системы, позволяющие проводить оценку цитотоксической способности антигенспецифических Т-лимфоцитов, полученных в процессе индукции зрелыми ДК в отношении аутологичной опухоли, могут быть использованы для прогноза эффективности иммунотерапии на основе ДК. Разработана схема получения гомологичного клеточного продукта на основе дендритных клеток (ДК) мыши, активированных высокоиммуногенным РТА+ лизатом опухолевых клеток человека. Данная гомологичная модель дендритно-клеточной вакцины (ДКВ) получена при помощи аналогичной технологии с клеточным продуктом, разработанной коллективом НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова ранее для применения у человека. Оптимизирована и апробирована методика получения дендритных клеток мыши. В рамках выполнения Договора №22-ДИ/20 от 30 июня 2022 г. с ФГБУ " НМИЦ им. В.А. Алмазова" Минздрава России (Институт экспериментальной медицины) начаты работы по изучению кинетики распределения ДК из места введения и миграции их в организме животных. Проведена разработка протокола окрашивания вакцинных дендритных клеток (человек, мышь BALB/с) с использованием прямого витального красителя индоцианина зеленого (ICG) и системы визуализации IVIS Lumina LT series III (PerkinElmer, USA) и изучена способность витального красителя ICG оставаться в течение длительного времени (96 час) в окрашенных in vitro ДК в концентрации достаточной для детектирования. Работы по изучению кинетики и миграции клеточного продукта на основе зрелых ДК будут продолжены. В результате первого года работы по проекту выполнены, подготовлен экспериментальный материал и методы для дальнейших исследований. Результаты выполнения проекта представлены на 4-х профильных конференциях. Подготовлены к публикации и опубликованы тезисы (1), принята в печать журнала "Сибирский онкологический журнал" (Scopus) статья по результатам выполненной работы по проекту в 2022 г. Ссылки о публикациях в СМИ, посвященные выполнению проекта: 1. Вакцина от рака: в Петербурге учёные спасают даже умирающих https://www.fontanka.ru/2022/09/19/71648348/ 2. Онкоиммунолог Татьяна Леонидовна Нехаева: как проходят доклинические исследования противоопухолевой вакцины https://www.niioncologii.ru/news/onkoimmunolog_tatyana_leonidovna_nekhaeva_kak_prokhodyat_doklinicheskie_issledovaniya_protivoopukhol

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Разработана лабораторная модель изучения пролиферативной активности Т-лимфоцитов при индукции вакцинными ДК под влиянием элементов опухолевого микроокружения. Проведена оценка миграционной активности вакцинных ДК с добавлением хемоаттрактанта хемокина CCL21, свидетельствующего о направлении движения вакцинных ДК непосредственно в лимфатические узлы. Показано, что вакцинные ДК, используемые в эксперименте, характеризуются высоким уровнем экспрессии молекул хемокинового рецептора (CCR7) на наружной мембране 82,02±6,01%. Изучено содержание факторов, ассоциированных с иммуносупрессией - MICA, TGFβ1, VEGF, IL6, 8, 10 (ИСФ) и IL18 в периферической крови онкологических пациентов и обнаружено, что имеются статистически значимые различия по количественному содержанию MICA, TGFβ1, VEGF, IL6, 8, IL18 между группами больных злокачественными новообразованиями и здоровых лиц. Данные факторы, содержащиеся в супернатантах культур клеток меланомы кожи, оказывают ингибирующее воздействие на миграционные свойства зрелых ДК в модельной системе in vitro. Таким образом, периферическая кровь больных солидными опухолями содержит повышенное количество факторов, ассоциированных с иммуносупрессией, что может оказывать влияние на миграционные свойства вакцинных ДК и, как следствие, на эффективность иммунотерапии ДК. Разработана аутологичная клеточная модель, которая может использоваться для оценки эффективности вакцины на основе аутологичных ДК при проведении противоопухолевой иммунотерапии. Получены трехмерные двухкомпонентные системы, позволяющие проводить оценку цитотоксической способности антигенспецифических Т-лимфоцитов, активированных зрелыми ДК в отношении аутологичной опухоли. Используя прижизненную визуализацию в клеточном имиджере и анализ методом проточной цитофлуорометрии, продемонстрирована низкая жизнеспособность опухолевых клеток в сфероидах, инкубированных с активированными Т-лимфоцитами. Использованная тест-система подтвердила эффективность вакцины на основе ДК, что совпадало с клиническими данными. Таким образом, можно полагать, что данная клеточная модель после проверки на контрастном материале (отсутствие эффективности терапии ДКВ у пациента) может использоваться для мониторинга эффективности производимых доз вакцинного препарата в ходе иммунотерапии больных солидными опухолями. Проведена разработка протокола получения гомологичного клеточного продукта на основе ДК животных, согласно аналогичной технологии получения вакцинных ДК человека, и показана сопоставимость морфологических характеристик и экспрессии дифференцировочных антигенов ДК (CD11c, CD80, CD86, CD83) животных и человека. Гомологичный клеточный продукт на основе ДК мыши характеризуется высокой экспрессией маркера дифференцировки CD83 (82,31±2,50), костимулирующих молекул CD80 (90,67±3,29), CD86 (83,69 ± 4,50), жизнеспособность вакцинных ДК не менее 90%, отсутствие признаков микробного загрязнения и эндотоксинов. Проведена апробация гомологичной модели вакцины на основе зрелых ДК мыши для изучения кинетики и миграции клеточного препарата. Оптимизирована методика выделения лимфатических узлов и отработана процедура получения криостатных срезов лимфатических узлов и внутренних органов мышей линии BALB/C. Выбрав CFSE, как наиболее подходящий краситель, была проведена оценка распределения гомологичного клеточного продукта после однократного внутрикожного введения CFSE+ ДК. Количество CFSE+ДК в дренирующих лимфатических узлах животных опытной группы через 16 час составляет 5,3%, увеличивается к 48 час до 13,3% (p=0,028 vs 16 час), достигает максимума к 72 час 15,4% (p=0,003 vs 16 час) и снижается к 96 часам до 8,85% (p=0,086 vs 72 час). Значения флуоресценции опытной группы CFSE+ДК статистически значимо отличались по сравнению с контрольными группами (CFSE и ДК; p<0,000). Сравнительный анализ иммунофенотипа CFSE+ДК, обнаруженных в лимфатических узлах мыши, соответствует иммунофенотипу зрелых вакцинных ДК по экспрессии дифференцировочных маркеров CD11c, CD83, CD86, CCR7 (р>0,05). Используя криостатные срезы из лимфатических узлов и других внутренних органов всех групп животных, показано, что сигнал от красителя детектируется в лимфатических узлах экспериментальной группы на протяжении всего эксперимента и отсутствует в контрольных группах. CFSE+ДК визуализируются только в лимфатических узлах, являющихся целевыми органами для зрелых ДК, и отсутствуют в остальных внутренних органах экспериментальной группы. Таким образом, качественные данные, полученные с помощью конфокальной микроскопии, позволили подтвердить результаты детекции CFSE+ДК в лимфатических узлах мыши BALB/c методом проточной цитометрии. Изучение фармакологической активности вакцинных ДК проведено с использованием гомологичного клеточного продукта и перевивной животной модели веретеноклеточной саркомы мыши BALB/C (патент №2796351, 10.01.2023). По разработанному протоколу были сформированы 4 группы животных: 1К - контроль, n=12; 2ДОКС - доксорубицин, n=13; ДКВ-Л-дендритно-клеточная вакцина в лечебном режиме, n=13; ДКВ - А - дендритно-клеточная вакцина в адъювантном режиме, n=13. Для оценки эффективности гомологичного продукта на основе зрелых ДК в мышиной модели веретеноклеточной саркомы изучены выживаемость и относительный размер опухоли у мышей: 1) при оценке объема опухоли у экспериментальных животных, получавших ДКВ в адъювантном режиме, наблюдалось заметное уменьшение среднего объема опухоли. Статистически значимые различия относительно значений для контрольных животных зафиксированы на 24, 31, 38 и 41 сутки после перевивки. Терапия ДКВ в лечебном режиме продемонстрировала подавляющий эффект в отношении роста опухоли на 27, 38 и 41 сутки опыта, но без статистически значимых различий с контрольной группой. 2) при оценке торможения роста опухоли (ТРО) установлено, что терапия ДКВ в лечебном режиме на начальном этапе не давала эффекта (ТРО не превышало 5% до 24 суток после перевивки), к концу эксперимента (41 сутки после перевивки) ТРО 34%, что свидетельствует о начале развития ожидаемого фармакологического действия ДКВ. У животных, которым вводили ДКВ в адъювантном режиме, ТРО на уровне 42,5%, через 3 недели после перевивки опухоли наблюдали устойчивой эффект торможения (ТРО не опускалось ниже 50%), что превосходит эффект доксорубицина. Эффект ДКВ в адъювантном режиме сохранялся до 41 суток после перевивки опухоли, а действие доксорубицина ослабло, и, начиная с 34 суток после перевивки пропали статистически значимые различия между значениями относительного объема опухоли для группы 2ДОКС и 1К. 3) при оценке объективного ответа опухоли на терапию установлено, что введение ДКВ в лечебном режиме не оказывает статистически значимого терапевтического воздействия; ДКВ в адъювантном режиме - только у нескольких животных (n=6) выявлено прогрессирование роста опухоли, при этом уровень значимости от контрольного значения был на порядок выше, чем в группе 2ДОКС (46,14%, p=0,0052). Таким образом, применение ДК вакцины в адъювантном режиме демонстрирует явное угнетающее воздействие на развитие опухолевых узлов у экспериментальных животных. Также на основании критериев RECIST нами было рассчитано время до прогрессии опухоли. Анализ по методу Каплана-Майера (логранговый критерий) показал отсутствие статистически значимых различий между контрольной группой мышей и теми животными, которые получали или доксорубицин, или ДКВ в лечебном режиме. В то же время, оценка времени до прогрессии показала, что группа животных, которым вводили ДКВ в адьювантном режиме, получила статистически значимые преимущества по сравнению с контрольной группой (p=0,0152, logrank). В результате второго года реализации проекта все запланированные работы выполнены, все результаты получены и представлены на 5 профильных конференциях. Получен патент №2796351 от 10.01.2023 г., опубликованы 2 статьи и принята в редакцию журнала "Клеточные технологии в биологии и медицине" статья.