Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В аспекте проблематики настоящего исследования центральное место занимает изучение потенциального влияния новой коронавирусной инфекции COVID-19 на мужскую фертильность, основываясь на оценке различных характеристик эякулята и сперматозоидов. Образцы эякулята были получены от 126 перенесших коронавирусную инфекцию пациентов, обратившихся в отделение ВРТ ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», в возрасте 36 (IQR: 33-39) лет. Все пациенты были разделены на группы согласно времени, прошедшем после выздоровления: 0-3 месяца (n=33), 4-6 месяцев (n=31), 7-9 месяцев (n=21), 10-12 месяцев (n=14) и 13 и более месяцев (n=27). Контрольную группу составили 165 пациентов соответствующего возраста (35 (IQR: 32-39) лет) не болевшие COVID-19. Для каждого пациента был проведен стандартный спермиологический анализ согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2010 года и оценка доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК методом флуоресцентного мечения одно- и двунитевых разрывов ДНК (метод TUNEL). Пороговым значением доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК согласно рекомендациям литературы и собственным данным было принято значение 15%. В ходе выполнения данного проекта нами было обнаружено, что у пациентов, перенесших COVID-19 0-3 месяца назад, наблюдается достоверное снижение количества непрогрессивно-подвижных сперматозоидов и повышение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. Начиная с 4-го месяца после выздоровления данные параметры приходили к уровню, наблюдаемому у пациентов, составивших контрольную группу. Необходимо отметить, что в группе пациентов, перенесших COVID-19 13 и более месяцев назад, было выявлено значимое повышение концентрации сперматозоидов по сравнению с группой контроля, в то время как на протяжении года после перенесенной коронавирусной инфекции данный показатель не изменялся. Кроме того, при рассмотрении полученной выборки пациентов нами было установлено статистически достоверное увеличение процента сперматозоидов с дефектами хвоста в группах «10-12 месяцев» и «13 и более месяцев» относительно контрольных значений. На протяжении 9 месяцев после COVID-19 в эякуляте мужчин наблюдалось повышенное количество круглых клеток, к числу которых относятся клетки сперматогенеза и лейкоциты, являющиеся маркерами воспалительного процесса и основными источниками свободных радикалов, вызывающих в том числе повреждение ДНК сперматозоидов. Несмотря на обнаруженные статистически значимые различия в исследуемых параметрах при анализе уровня повреждения ДНК сперматозоидов у пациентов обнаруживается гетерогенность разбросов значений. Учитывая значительное количество факторов влияния на качество эякулята, наряду с вирусной инфекцией, для гомогенизации выборки в данном исследовании были применены дополнительные критерии исключения: прием лекарственных препаратов, витаминно-минеральных комплексов, биологически активных добавок, антиоксидантов; воздействие потенциальных репродуктивных токсинов на рабочем месте и в окружающей среде; индекс массы тела (ИМТ) ≥25; тяжелые нарушения сперматогенеза (азооспермия); заболевания мочевыделительной системы (варикоцеле, крипторхизм, простатит); наличие в анамнезе травм и оперативных вмешательств на половых органах; наличие инфекций, передающиеся половым путем; наличие хронических заболеваний. Таким образом, в группу пациентов, перенесших COVID-19, вошло 17 пациентов. Средний период выздоровления составил 5 (IQR: 4-7) месяцев. Контрольную группу составили 22 пациента соответствующего возраста, не болевшие COVID-19. Для пациентов исследуемой и контрольной групп, сформированным после применения критериев исключения, была дополнительно проведена оценка уровня окислительного повреждения макромолекул, таких как ДНК (8-гидрокси-2’-дезоксигуанозин, 8-OHdG) и белки (нитротирозин, NT). Кроме того, проводился анализ компонентов антиоксидантной системы (общая антиоксидантная способность, TAC; активность каталазы, CAT, и супероксиддисмутазы, SOD) как в семенной плазме, так и в сперматозоидах. Результаты проведенного исследования демонстрируют, что уровень повреждения ДНК сперматозоидов отрицательно коррелирует со временем восстановления после перенесенной коронавирусной инфекции. Наиболее значимые изменения были отмечены в группе мужчин с повышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов, перенесших COVID-19. Уровень TAC в семенной плазме у данной группы пациентов возрастал с течением времени после реабилитации. Стоит отметить, что заданный показатель является суммарным отражением антиоксидантного статуса и не дает представления о направленности изменений отдельных его компонентов. Вместе с этим, уровень NT в семенной плазме, который значительно коррелирует с исследуемыми маркерами в клеточной фракции, вероятно может рассматриваться в качестве одного из показателей функционального состояния сперматозоидов. Более того, уровень 8-OHdG в клетках не коррелировал с долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК, что может свидетельствовать о неспособности метода TUNEL выявлять окислительные повреждения нуклеотидов. На втором этапе работы планируется оценить в семенной плазме мужчин, после выздоровления от новой коронавирусной инфекции, содержание про- и противовоспалительных цитокинов, в комплексе с анализом основных параметров спермограммы, долей сперматозоидов с поврежденной ДНК и провести оценку функциональной способности сперматозоидов связываться с гиалуроновой кислотой. Логичное продолжение научного поиска позволит оценить степень влияния SARS-CoV-2 на мужскую фертильность непосредственно после клинического выздоровления и в долгосрочной перспективе посредством комплексного анализа основных параметров спермограммы, долей сперматозоидов с поврежденной ДНК, а также исследованием функциональной способности сперматозоидов в различные сроки реконвалесценции COVID-19. Практическая направленность использования полученных результатов позволит оптимизировать алгоритм обследования и персонализированной преконцепционной подготовки пар в аспекте планирования беременности естественным путем и с применением вспомогательных репродуктивных технологий. Применение передовых методов, подходов и технологий, разработанных в рамках научно-исследовательской работы, позволит индивидуализировать лечебный процесс, наметить стратегии в выборе персонифицированной медицины, основанной не только на клинических данных, но и на знаниях и достижениях эмбриологии человека, клеточной и молекулярной биологии. Междисциплинарный подход к селекции сперматозоидов, новое видение состава семенной плазмы является мощным импульсом для развития как в лечении бесплодия, так и в области социально-экономического и научного развития организаций в репродуктивной медицине. Инновации в сфере репродуктивной медицины предназначены для создания принципиально новых подходов к работе с половыми клетками человека, профилактике наследственных заболеваний, к рождению здоровых детей. Полученные в ходе реализации настоящего проекта данные были опубликованы в журнале «International Journal of Molecular Sciences» (Q1, IF=6,208), представлены на 3 конференциях, в том числе с международным участием, по результатам проекта на сайте РНФ опубликован пресс-релиз https://rscf.ru/news/release/uchenye-vyyasnili-kak-dazhe-legkoe-techenie-covid-19-snizhaet-kachestvo-spermy/# .

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
В аспекте проблематики настоящего исследования центральное место занимает изучение потенциального влияния новой коронавирусной инфекции COVID-19 на мужскую фертильность, основываясь на оценке различных характеристик эякулята, и сперматозоидов. В ходе второго года реализации проекта помимо стандартного спермиологического анализа и оценки доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК, пациентам исследуемой и контрольных групп было определено содержание противовоспалительных и провоспалительных цитокинов, а также доли сперматозоидов, связавшихся с гиалуроновой кислотой. Для анализа были отобраны 413 образцов эякулята, полученные от пациентов, предоставивших анкетные данные о возрасте, массе тела, росте, образе жизни и истории коронавирусного заболевания, и соотвествоваших критериям включения в исследование. От пациентов, перенесших коронавирусную инфекцию в период от 0 до 40 месяцев перед сдачей исследуемого образца, был получен 181 образец эякулята. Образцы были дополнительно разделены на группы в зависимости от времени после выздоровления: 0-3 месяца (n = 34), 4-6 месяцев (n = 35), 7-9 месяцев (n = 25), 10-12 месяцев (n = 20), 13 и более месяцев после COVID-19 (n = 67). Контрольную группу составили 232 пациента без коронавирусной инфекции в анамнезе. В результате исследования было показано, что доля пациентов с нормозооспермией и патозооспермией не отличается среди перенесших коронавирусную инфекцию мужчин и не имевших данное заболевание в анамнезе. Отмечено, что концентрация сперматозоидов в эякуляте мужчин, перенесших коронавирусную инфекцию 0-3 месяца назад, была снижена относительно соответствующего показателя в контрольной группе, при этом у мужчин, перенесших коронавирусную инфекцию 7-9 и 10-12 месяцев назад, концентрация сперматозоидов в эякуляте повышалась. В ходе исследования обнаружено статистически значимое увеличение концентрации круглых клеток, которые являются косвенными маркером воспалительного процесса, через 4-6 и 7-9 месяцев после перенесенной коронавирусной инфекции, с последующим снижением к контрольным значениям через 10-12 месяцев. Снижение доли морфологически нормальных сперматозоидов наблюдалось через 4-6 месяцев после перенесенной коронавирусной инфекции, однако со временем этот показатель восстанавливался. Интересно отметить, что в группе «10-12 месяцев» после СOVID-19 увеличивалась доля сперматозоидов с патологией хвоста. Анализ фрагментации ДНК сперматозоидов показал, что коронавирусная инфекция отрицательно влияла на целостность ДНК сперматозоидов, особенно в первые 0-3 месяца после выздоровления, но по прошествии 12 месяцев этот показатель возвращался к норме. Исследование содержания антиспермальных антител выявило вариации их уровня, но наивысший уровень был у пациентов, перенесших коронавирусную инфекцию менее трех месяцев назад. Эти антитела могут снижать эффективность оплодотворения и, следовательно, частоту наступления беременности, таким образом, влияние вирусной инфекции на репродуктивную функцию может проявляться через воздействие на иммунную систему пациента. После применения жестких критериев исключения с целью оценки реального вклада коронавирусной инфекции в нарушение мужской фертильности в группе перенесших COVID-19 насчитывалось 60 человек, средний период выздоровления составил 7 месяцев (IQR: 4-11). Контрольная группа состояла из 77 пациентов того же возраста, без COVID-19 в анамнезе. Результаты исследования свидетельствуют о значительном влиянии возраста пациента на негомогенность выборки и разброс данных в группах. В связи с этим, сравнительный анализ воздействия COVID-19 на параметры мужской фертильности проводился в пределах конкретных возрастных групп: группа «<35, COVID-» сравнивалась с «<35, COVID+», а группа «>35, COVID-» сравнивалась с «>35, COVID+». В результате исследования не обнаружено статистически значимых различий в показателях спермограммы мужчин после COVID-19 и теми, кто не имел коронавирусную инфекцию в анамнезе. Однако установлено увеличение количества круглых клеток у мужчин в возрасте младше 35 лет, перенесших COVID-19, что может указывать на наличие воспалительного процесса в репродуктивном тракте. В хоед исследования также оценивалось содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в семенной плазме. У мужчин в возрасте до 35 лет изменений в концентрации IL-1β, IL-10, IL-6 и TNF-α после COVID-19 не обнаружено, в то время как у пациентов в возрасте 35 лет и старше отмечено повышение уровней IL-1β и IL-10. При этом уровни IL-6 и TNF-α практически не различались между группами. Дополнительно было проведено исследование уровня общей антиоксидантной способности, нитротирозина и уровня цинка в эякуялте. У пациентов в возрасте младше 35 лет, перенесших COVID-19, отмечено снижение концентрации цинка и уменьшение содержания нитротирозина. В группе мужчин старше 35 лет после инфекции SARS-CoV-2 выявлено снижение общей антиоксидантной способности семенной плазмы. Развитие воспаления и окислительного стресса, как известно, может оказывать негативное воздействие на функциональное состояние сперматозоидов. При исследовании эякулята пациентов младше 35 лет не обнаружено существенных изменений в доле TUNEL-позитивных клеток, что указывает на отсутствие значительных повреждений ДНК сперматозоидов. Однако в группе мужчин старше 35 лет после COVID-19 отмечено существенное увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК по сравнению с контрольной группой того же возраста. В группе мужчин в возрасте младше 35 лет, перенесших коронавирусную инфекцию, наблюдается снижение способности сперматозоидов связываться с гиалуроновой кислотой (HBA) по сравнению с контрольной группой соответствующего возраста. Это может свидетельствовать о нарушениях в процессе созревания сперматозоидов у молодых пациентов с COVID-19. Эти изменения подтверждаются повышением числа круглых клеток, включая незрелые половые клетки и лейкоциты. Полученные данные позволяют говорить о долгосрочном влиянии вируса на мужскую репродуктивную функцию, что, несомненно, важно как для лечения бесплодия, так и для планирования наступления беременности в паре и естественным путем, и путем применения вспомогательных репродуктивных технологий. Обнаруженные в ходе выполнения проекта особенности влияния коронавирусной инфекции на мужское репродуктивное здоровье имеют важное значение при разработке персонализированного подхода для пар, планирующих беременность. Полученные в ходе реализации настоящего проекта результаты были опубликованы в журнале «International Journal of Molecular Sciences» (Q1, IF=5,6), представлены на 6 конференциях, в том числе с международным участием.