Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе первого года выполнения проекта в 2022 году экспериментальные и теоретические исследования были сфокусированы на разработке газоразрядного источника плазменной струи на основе барьерного разряда, на исследовании спектров излучения и температурных полей в зоне контакта плазмы с объектом обработки, на синтезе и характеризации наноконструкций, таких как золотые наночастицы с покрытиями полиэтиленгликолем (НЧЗ+PEG) и полиэтиленимином (НЧЗ-PEI) и их интернализации раковыми клетками под воздействием холодной плазменной струи. Характеристики газоразрядного источника плазменной струи на основе барьерного разряда сравнивались с характеристиками разработанного ранее источника плазмы с центральным стержневым U-электродом. Особое внимание уделялось исследованию различных режимов распространения последовательности стримеров образующих плазменную струю в зависимости от частоты и амплитуды приложенного напряжения. Стримеры формируются внутри плазменного источника в каждом цикле синусоидального напряжения, но часть стримеров затухает на выходе из сопла так и не достигнув поверхности мишени. Эффективность обработки раковых образований зависит от частоты касания стримером поверхности опухоли, так как от этого зависит генерация химически активных частиц и воздействие электрическими полями. Впервые проведены сквозные расчеты десятков импульсов напряжения для частоты напряжения 13-50 кГц. Все известные нам научные расчетно-теоретические работы в Россия и за рубежом ограничиваются рассмотрением одного импульса напряжения из-за значительных затрат расчетного времени. В рамках выполнения проекта был модифицирован алгоритм расчета с автоматическим выбором шага по времени на основе рассчитанного изменения проводимости плазмы, что позволило в 5-10 раз сократить время расчетов. Исследования спектров излучения и расчет химических реакций был направлен на анализ состава и концентрации активных радикалов и частиц, формирующихся в процессе плазмо-стимулированных реакций в смеси гелия в окружающем воздухе у поверхности мишени. Повышение температуры поверхности при обработке плазменной струей является существенным фактором ограничивающим повышение эффективности ХПС при повышении амплитуды напряжения и частоты. Проведены экспериментальные и расчетно-теоретические исследования повышения температуры в зоне контакта плазменной струи с мишенью, построена карта допустимых режимов при работе с лабораторными животными. Предложено и протестировано два способа понижения температуры в зоне контакта а) охлаждение рабочего газа гелия с использованием жидкого азота до поступления в плазменный источник и б) обрезание рабочего напряжения до нуля при достижении максимальной амплитуды. В биологической экспериментальной части проекта Подготовлены две клеточные линии, карциномы легких человека (A549) и здоровых клеток Wi38 (фибробласты, полученные из легочной ткани) для воздействия холодной плазменной струей (ХПС). Проведен синтез наночастиц золота (НЧЗ) методом цитратного восстановления, а также синтезированы конструкции НЧЗ с полиэтиленгликолем ( PEG) и полиэтиленимином (PEI). PEG и PEI запланировано использовать в качестве якорной группы для последующей химической модификации, для введения в состав конструкции флюоресцентной метки или направляющей молекулы (аптамера). Все этапы синтеза ЗНЧ и наноконструкций проанализированы с использованием методов гель электрофореза, динамического светорассеяния (ДСР) и УФ-спектроскопии. Определены гидродинамические размеры НЧЗ-PEG и НЧЗ-PEI, которые равняются 47,3+/-25,6 нм 46,9+/-25,4 нм, соответственно, и поверхностный потенциал, -44,9+/-3,7 мВ (НЧЗ-PEG) и 41,0+/-1,6 мВ (НЧЗ-PEI). Максимумы спектров оптического поглощения всех наноконструкций приходились на 520 нм. Проведенные исследования проникновение НЧЗ -PEG-FAM в раковые клетки А549 под воздействием ХПС и при электропорации. К клеткам, растущим в лунках планшета до облучения ХПС добавляли НЧЗ-PEG, конъюгированные с флуорохромом FITC (NP-PEG-FAM). Добавление флуоресцентной метки (FAM) к наночастицам помогло определить наличие наночастиц в клетке методом спектроскопии. На основе полученных спектров излучения, обнаружено, что НЧЗ добавленные к клеткам без облучения ХПС практически не захватываются клетками, а остаются в растворе. В случае облучения ХПС, число клеток захвативших НЧЗ значительно увеличивается в течение 90 мин после облучения. Дальнейшая инкубация клеток с наночастицами не ведет к увеличению числа клеток с НЧЗ. Таким образом, облучение клеток А549 ХПС стимулирует проникновение наночастиц в клетки. Электропорацию проводили на приборе Neon™Transfection System (Thermo Fisher Scientific, США). Показано, что количество наночастиц проникающих в клетки возрастает со временем, что свидетельствует о значительном повреждении мембраны клетки. Были синтезированы НЧЗ различного размера (7 нм, 20 нм и 50 нм), проведена их физико-химическая характеризация и исследована динамика НЧЗ в различных растворах. Спектры поглощения видимого света НЧЗ записывали на спектрофотометре UV-2100 (Shimadzu, Япония). Все полученные НЧЗ характеризовали методами просвечивающей электронной микроскопией (ПЭМ) с помощью микроскопа JEM-1400 Jeol и динамического светорассеяния (ДСР) с помощью Zetasizer Nano ZS (таблица 24). Измерения дзета-потенциала в воде показали, что все суспении НЧ являются стабильными растворами. Для дальнейших исследований были выбраны НЧЗ с диаметром 20 нм, т.к. они имеют минимальный индекс полидисперсности. Проведенные измерения динамики НЧЗ в воде, PBS и 10% сыворотке показали, что величина дзета потенциала и размер НЧ увеличиваются в данном ряду растворителей. Приготовлена клеточная линия клеток рака груди BrCCh4e-134 и обработана ХПС с/без добавления наночастиц. Линия клеток BrCCh4e полученая ранее исполнителями проекта [Коваль О.А. с соавторами] [Патент РФ № 2717654. 2020] позволяет тестировать новые противоопухолевые препараты и подходы, таргетные к PSMA и/или HER2. Линию клеток BrCCh4e-134 размораживали и культивировали в стандартных условиях. Методом иммуноокрашивания и проточной цитометрии было показано, что клетки BrCCh4e-134 сохраняют экспрессию PSMA на уровне 92% и HER2 на уровне 60%. Клетки с указанными характеристиками были взяты в эксперимент по облучению ХПС в присутствии наночастиц золота, покрытых полиэтиленгликолем (AuNP-PEG). Клетки подвергали прямому облучению ХПС с амплитудой синусоидального напряжения 3,5 кВ и частотой 50/4 кГц, скорость гелия 9 л/мин. За 30 мин до облучения к клеткам добавляли AuNP-PEG (0,2 нМ). На Рис. 26 представлены средние значения выживаемости клеток полученные в МТТ тестом. Можно видеть, что клетки BrCCh4e-134 проявляют слабую чувствительность к облучению ХПС при данном режиме. Добавление AuNP-PEG не усиливает цитотоксического действия ХПС на клетки.

Аннотация результатов, полученных в 2023 году
Оптимальный выбор эффективных и биологически безопасных режимов воздействия холодной плазменной струи (ХПС) на онкологические образования имеет решающее значение в противораковой терапии на основе газоразрядной плазмы. Комбинированное воздействие ХПС в сочетании с модифицированными наночастицами золота (НЧЗ), несущими молекулы и терапевтические средства, направленные против рака, может стать следующей стратегией усиления противоопухолевых подходов на основе газоразрядной плазмы. В ходе выполнения данного проекта в физических и биологических экспериментах, а также в расчетно-теоретических исследованиях были найдены оптимальные режимы ХПС с регулярным распространением стримеров и максимальным током у поверхности объекта воздействия при температуре T<42 C, которые эффективно подавляли жизнеспособность раковых клеток. Для усиления цитотоксического эффекта, воздействие ХПС комбинировалось с добавлением наночастицы золота (НЧЗ) к клеткам. Для выполнения исследовательских работ были разработаны плазменные источники на основе контактного и барьерного разрядов, с источником однополярных импульсов, позволяющим регулировать амплитуду напряжения в диапазоне U=1–8 kV и частоту следования импульсов fU=5–40 kHz. Контактное инициирование осуществляется при расположении потенциального электрода внутри газоразрядного канала, через который прокачивается газ. При барьерном инициировании потенциальный электрод расположен снаружи канала. В экспериментах применялись разные импульсы инициирующего напряжения. Показано, что увеличение длительности возбуждающих импульсов сопровождается повышением напряжения зажигания разряда и формирования плазменной струи. Наблюдается одинаковая тенденция увеличения амплитуды тока, регистрируемого в зоне взаимодействия ХПС с объектом, при «укорочении» длительности импульсов напряжения для контактного и барьерного типа ХПС. Исследованы спектры излучения в зоне взаимодействия холодной плазменной струи, мишени – культуральной среды при различных способах инициирования ХПС. Проведено исследование нагрева диэлектрической мишени, размещенной на дополнительном заземленном электроде. Показано, уменьшение частоты следования импульсов приводит к снижению нагрева мишени и увеличению напряжения зажигания разряда для двух способов инициирования ХПС. Проведена модификация математической модели и кода 2D PlasmaNovH для моделирования а) контактного (газовый разряд между электродами) и б) барьерного разряда. Модификация заключалась в пошаговом расчете поверхностного заряда на поверхности диэлектрика, который определяет движение стримера вдоль поверхности, в изменении конфигурации электродов и в добавлении автоматического выбора шага по времени на основе анализа временного градиента и абсолютной величины скорости ионизации, что позволило уменьшить время расчета в десять-двадцать раз. На основе численного моделирования были оптимизированы параметры плазменной струи формирующейся с использованием контактного и барьерного разрядов по величине скорости ионизации и тока разряда у поверхности объекта воздействия при варьировании рабочего напряжения, частоты следования импульсов и формы импульсов. На основании полученных результатов сделаны выводы о более высокой цитотоксичности ХПС с импульсным напряжением с длиной импульсов 7 мкс (PP-7) для контактного и барьерного типа разрядов. Получены результаты расчетов плазмохимических реакций в смеси гелия и окружающего воздуха у поверхности биомишени, индуцированных плазменной струей для случая барьерного разряда с трапециевидными импульсами напряжения положительной полярности с использованием 0-мерной модели (1769 химических реакций и 98 компонент). Для сравнения цитотоксического эффекта ХПС инициируемой источниками контактного и барьерного типа, были выбраны режимы с одинаковым интегральным током у поверхности. Ранее нами было показано, ХПС контактного типа с параметрами U=4,2 кВ, f=25 кГц, PP-7 и током у поверхности I = 7-8 мА максимально подавляет жизнеспособность раковых клеток при T<42◦C. Для облучения раковых клеток с использованием ХПС барьерного типа был выбран режим, при котором I= 7-8 мА (U=4,8 кВ, f=50 кГц, PP-7). Мы сравнили действие ХПС в указанных условиях, используя клетки аденокарциномы легкого человека А549. Различий в цитотоксической активности импульсной ХПС контактного и барьерного типа обнаружено не было. Для анализа влияния наночастиц золота на цитотоксическую активность газоразрядной плазмы и динамики проникновения НЧЗ в здоровые и опухолевые клетки использовались ХПС в оптимальных режимах, полученные в эксперименте и в численном моделировании и 13 нм частиц, покрытые ПЭГ. Показано, что комбинированное воздействие ХПС оптимальных режимов снижала жизнеспособность эпителиоподобной аденокарциномы легких NCI-H23, аденокарциномы легких A549, аденокарциномы молочной железы BrCCh4e-134 и клеток увеальной меланомы uMel1. Здоровые фибробласты легкого человека Wi-38 и MRC-5, а также опухолевые клетки легкого A549 и NCI-H23 подвергали 30-60 к воздействию ХПС контактного и барьерного типа для оптимальных режимов, описанных выше. Наночастицы добавляли сразу после обработки ХПС. Различий в цитотоксической активности импульсной ХПС контактного и барьерного типа без добавления НЧЗ обнаружено не было. Усиление цитотоксической активности ХПС при добавлении НЧЗ наблюдали только для опухолевых клеток А549 (60 с) и Н-23 (30 с) при воздействии ХПС контактного типа. Показано, что добавление адресной молекулы к НЧЗ в виде антител к PSMA усиливает проникновение таких НЧЗ в PSMA-положительные клетки. Обработка опухолевых клеток ХПС стимулирует их гибель по иммуногенному типу, и добавление НЧЗ к ХПС-обработанным клеткам не влияет на активацию в них маркеров иммуногенной гибели. Показано, что комбинированное воздействие ХПС + НЧЗ на клетки А549 делает их более иммуногенными, стимулируя in vitro переход моноцитов в зрелые дендритные клетки при со-культивации с обработанными клетками А549. Опухолевые клетки А549, обработанные ХПС + НЧЗ, эффективно захватываются дендритными клетками.