Генетические технологии создания моделей заболеваний, обусловленных нарушениями функционирования РНК

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 21-64-00006

НазваниеГенетические технологии создания моделей заболеваний, обусловленных нарушениями функционирования РНК

Руководитель Донцова Ольга Анатольевна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №56 - Конкурс 2021 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (генетические исследования)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова РНК, РНК-белковые комплекс, модификация РНК, сплайсинг, трансляция, минипептид, антибиотик, редактирование генома, модель заболевания, РНК болезнь

Код ГРНТИ34.15.25

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одной из приоритетных задач направления «Генетические технологии для медицины» является создание моделей заболеваний с использованием культур клеток и лабораторных животных. Создание моделей заболеваний требует понимания механизмов развития патологии, а именно генетических детерминант, обусловливающих возникновение заболевания. Настоящий проект ставит перед собой несколько задач, направленных как на создание моделей заболеваний уже известной этиологии, так и на выявление новых генетических детерминант и механизмов, лежащих в основе изменения гомеостаза клетки и, как следствие, развития патологических состояний. В проекте будет применен биоинформатический анализ генетических структур с целью выявления новых детерминант, определяющих развитие генетически обусловленных патологий, а также самые современные методы редактирования геномов, такие как инактивация и редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas9, внедрение генов с помощью транспозонов и лентивирусов, а также с помощью сайт-специфических рекомбиназ бактериофагов. Будут проведено сравнительное исследование и оптимизация нескольких методов редактирования генома. В работе, проводящейся совместно с индустриальным партнером проекта ЗАО «БИОКАД», с помощью инактивации гена фактора свертывания крови IX будет создана модель гемофилии, которую индустриальный партнер будет использовать для разработки метода генной терапии этого заболевания. В план исследований в ходе реализации настоящего проекта входят различные задачи, имеющие целью как изучение фундаментальных основ влияния структурных особенностей РНК на программы экспрессии генетической информации, так и создание моделей заболеваний с использованием лабораторных животных и культур клеток. Такой широкий подход позволит определить ключевые аспекты влияния структурных особенностей РНК на реализацию программы экспрессии генома, а также предложить подходы к направленной регуляции экспрессии как конкретных генов, так и программы экспрессии генома в целом.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Сергиев П.В., Рубцова М.П. Мал да удал. Биохимия, Т.86, №9, с.1366-13379 (год публикации - 2021)
10.31857/s0320972521090098

2. Чичерин И.В., Духалин С.В., Ханнанов Р.А., Балева М.В, Левицкий С.А., Патрушев М.В., Сергиев П.В., Каменский П.А Functional diversity of mitochondrial peptydil-tRNAhydrolase ICT1 in human cells Frontiers in Molecular Biosciences, V.8, Article 716885 (год публикации - 2021)
10.3389/fmolb.2021.716885

3. Иванов Т.М., Первушин Д.Д. Тандемные дупликации экзонов расширяют репертуар альтернативного сплайсинга Acta Naturae (год публикации - 2022)

4. Шляпина В., Корягина М., Василькова Д., Говорун В., Донцова О., Рубцова М. Human Telomerase RNA Protein Encoded by Telomerase RNA is Involved in Metabolic Responses Frontiers in Cell and Developmental Biology, V.9, Article 754611 (год публикации - 2021)
10.3389/fcell.2021.754611

5. Аверина О.А, Пермяков О.А., Григорьева О.О., Старшин А.С., Мазур А.М., Прохорчук Е.Б., Донцова О.А., Сергиев П.В. Comparative Analysis of Genome Editors Efficiency on a Model of Mice Zygotes Microinjection International Journal of Molecular Sciences, 22, 10221 (год публикации - 2021)
10.3390/ijms221910221

6. Пахомова Т., Мошарева М., Василькова Д., Зацепин Т., Донцова О., Рубцова М. Role of RNA Biogenesis Factors in the Processing and Transport of Human Telomerase RNA Biomedicines, N 6, T 10, статья № 1275 (год публикации - 2022)
10.3390/biomedicines10061275

7. Пигарева В.А., Степанова Д.А., Большакова А.В., Марина М.И., Остерман И.А., Сыбачин А.В. Hyperbranched Kaustamin as an antibacterial for surface treatment Mendeleev Communication, №32, с.561-563 (год публикации - 2022)
10.1016/j.mencom.2022.07.042

8. Плетнев Ф.И., Шуленина О., Евфратов С., Трешин В., Субач М., Серебрякова М.В., Остерман И.А., Полескова А., Богданов А.А., Донцова О.А., Коневега А.Л., Сергиев П.В. Ribosomal protein S18 acetyltransferase RimI is responsible for the acetylation of elongation factor Tu Journal of Biological Chemistry, V.298, N.5, #101914 (год публикации - 2022)
10.1016/j.jbc.2022.101914

9. Марьясина С.С., Чан Ч.-Ф., Новолаев Т.Л., Чугунова А.А., Ефимов С.В., Згода В.Г., Ивлев В.А., Донцова О.А., Сергиев П.В., Польшаков В.И. Williams-Beuren Syndrome Related Methyltransferase WBSCR27: From Structure to Possible Function Frontiers in Molecular Biosciences, V.9, N. 865743 (год публикации - 2022)
10.3389/fmolb.2022.865743

10. Аверина О.А., Лаптев И.Г., Емельянова М.А., Пермяков О.А., Марьясина С.С., Никифорова А.И., Манских В.Н., Григорьева О.О., Болихова А.К., Калабин Г.А., Донцова О.А., Сергиев П.В. Mitochondrial rRNA Methylation by Mettl15 Contributes to the Exercise and Learning Capability in Mice IJMS, N.23, 6056 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms23116056

11. Комарова Е.С., Слесарчук А.Н., Рубцова М.П., Остерман И.А., Тупикин А.Е., Пышный Д.В., Донцова О.А., Кабилов М.Р., Сергиев П.В. Flow-Seq Evaluation of Translation Driven by a Set of Natural Escherichia coli 50-UTR of Variable Length IJMS, N.23, 12293 (год публикации - 2022)
10.3390/ijms232012293

12. Малявко А.Н., Петрова О.А., Зверева М.Э., Польшаков В.И., Донцова О.А. Telomere length regulation by Rif1 protein from Hansenula polymorpha eLife, N.11, e75010 (год публикации - 2022)
10.7554/eLife.75010

13. Рубцова М.П., Донцова О.А. How Structural Features Define Biogenesis and Function of Human Telomerase RNA Primary Transcript Biomedicines, N.10, 1650 (год публикации - 2022)
10.3390/biomedicines10071650

14. Ларионова Т., Бастола С., Аксинина Т., Ануфриева К., Ванг Д., Шендер В., Андреев Д., Коваленко Т., Арапиди Г., Шнайдер П., Казакова А., Латышев Я., Татарский В., Штиль А., Моро П., Жиро Ф., Ли Ч., Ванг И., Рубцова М., Донцова О., Павлюков М. Alternative RNA splicing modulates ribosomal composition and determines the spatial phenotype of glioblastoma cells Nature Cell Biology, V.24, p.1541-1557 (год публикации - 2022)
10.1038/s41556-022-00994-w

15. Лизунова С., Цветков В., Скворцов Д., Камзеева П., Иванова О., Васильева Л., Чистов А., Беляев Е., Хрулев А., Ведехина Т., Богомазова А., Лагарькова М., Варежук А., Аралов А. Anticancer activity of G4-targeting phenoxazine derivatives in vitro Biochimie, V.201, p.43-54 (год публикации - 2022)
10.1016/j.biochi.2022.07.001

16. Спектор Д., Ерофеев А., Горелкин П., Ванеев А., Акасов Р., Ульяновский Н., Никитина В., Семкина А., Власова К., Солдатов М., Тригуб А., Скворцов Д., Финько А., Зык Н., Сахаров Д., Мажуга А., Белоглазкина Е., Красновская О. Electrochemical Detection of a Novel Pt(IV) Prodrug with the Metronidazole Axial Ligand in the Hypoxic Area Inorganic Chemistry, Т.61, с. 14705-14717 (год публикации - 2022)
10.1021/acs.inorgchem.2c02062

17. Барановский А., Иванов Т., Грановская М., Папаценко Д., Первушин Д. Transcriptome analysis reveals high tumor heterogeneity with respect to re-activation of stemness and proliferation programs Plos ONE, V.7, N5, e0268626 (год публикации - 2022)
10.1371/journal.pone.0268626

18. Павлова Ю.А., Терещенков А.Г., Назаров П.А., Лукьянов Д.А., Скворцов Д.А., Польшаков В.И., Васильева Б.Ф., Ефременкова О.В., Каюмов М.Ю., Полескова А., Коневега А.Л., Донцова О.А., Остерман И.А., Богданов А.А., Сумбатян Н.В. Conjugates of Chloramphenicol Amine and Berberine as Antimicrobial Agents Antibiotics, N12 (1), 15 (год публикации - 2023)
10.3390/antibiotics12010015

19. Шаповалова К., Затонский Г., Грамматиков Н., Остерман И., Разумова Е., Щекотихин А., Тевяшова А. Synthesis of 600-Modified Kanamycin A Derivatives and Evaluation of Their Antibacterial Properties Pharmaceutics, 15(4); 1177 (год публикации - 2023)
10.3390/pharmaceutics15041177

20. Хайруллина З.З., Макаров Г.И., Терещенков А.Г., Буев В.С., Лукьянов Д.А., Польшаков В.И., Ташлицкий В.Н., Остерман И.А., Сумбатян Н.В. Конъюгаты десмикозина с фрагментами антимикробного пептида онкоцина: синтез, антибактериальная активность, взаимодействие с рибосомой Биохимия, 2022, том 87, вып. 7, с. 897–917 (год публикации - 2023)
10.31857/S0320972522070065

21. Аверина О.А., Пермяков О.А., Емельянова М.А., Григорьева О.О., Ловать М.Л., Егорова А.Е., Гринченко А.В., Кумейко В.В., Марей М.В., Манских В.Н., Донцова О.А., Высоких М.Ю., Сергиев П.В. Mitoregulin Contributes to Creatine Shuttling and Cardiolipin Protection in Mice Muscle IJMS, 24(8), 7589 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24087589

22. Шепелев Н., Донцова О., Рубцова М. Post-Transcriptional and Post-Translational Modifications in Telomerase Biogenesis and Recruitment to Telomeres IJMS, 24(5), 5027 (год публикации - 2023)
10.3390/ijms24055027

23. Шляпина В.Л., Донцова О.А., Рубцова М.П. ДЕЛЕЦИЯ НУКЛЕОТИДОВ 184–188 ТЕЛОМЕРАЗНОЙ РНК ЧЕЛОВЕКА НЕ ВЛИЯЕТ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ТЕЛОМЕРАЗЫ Доклады Академии Наук. Науки о жизни., T. 510, № 1, стр. 322-328 (год публикации - 2023)
10.31857/S2686738923700233

24. Лиу Ш.-В., Ядамбаа Н., Никандрова А., Остерман И., Сан Ч.-Х. Exploring the Diversity and Antibacterial Potentiality of Cultivable Actinobacteria from the Soil of the Saxaul Forest in Southern Gobi Desert in Mongolia Microorganisms, V.10, N. 989 (год публикации - 2022)
10.3390/microorganisms10050989

25. Г., Борзилов А.И., Остерман И.А., Сергиев П.В., Богданов А.А., Донцова О.А., Коневега А.Л., Овчинникова Т.В. Rumicidins are a family of mammalian hostdefense peptides plugging the 70S ribosome exit tunnel Nature Communications, V.15 N.1 e8925 (год публикации - 2024)
10.1038/s41467-024-53309-y

26. Антонова И.И., Александрова А.В., Антонов Е.А., Волынкина И.А., Лукьянов Д.А МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ГРИБЫ ПРЕДГОРНЫХ ЛЕСОВ НАЦИОНАЛЬНОГО ПАРКА БУЗЯМАП (ВЬЕТНАМ) Микология и фитопатология, Т.58, №3, с.177-194 (год публикации - 2024)
10.31857/S0026364824030017

27. Дерябин А., Моралева А., Доброчаева К., Ковалева Д., Рубцова М., Донцова О., Рубцов Ю. Human RPF1 and ESF1 in Pre-rRNA Processing and the Assembly of Pre-Ribosomal Particles: A Functional Study Cells, Т.13, №4, Р.326 (год публикации - 2024)
10.3390/cells13040326

28. Аверина О.А., Кузнецова С.А., Пермяков О.А., Сергиев П.В. How to Shift the Equilibrium of DNA Break Repair in Favor of Homologous Recombination Молекулярная биология, V.58, N.4, c.588-610 (год публикации - 2024)
10.1134/S0026893324700201

29. Болихова А.К., Буян А.И., Марьясина С.С., Руденко А.Ю., Чех Д.С., Мазур А.М., Прохорчук Е.Б., Донцова О.А., Сергиев П.В. Study of the RNA splicing kinetics via in vivo 5-EU labeling RNA, V.30, N.10, C.1356-1373 (год публикации - 2024)
10.1261/rna.079937.123

30. Волынкина И.А., Бычкова Е.Н., Каракчиева А.О., Тихомиров А.С., Затонский Г.В., Соловьева С.Е., Мартынов М.М., Грамматикова Н.Е., Терещенков А.Г., Полескова А., Коневега А.Л., Сергиев П.В., Донцова О.А., Остерман И.А., Щекотихин А.Е., Тевяшова А.Н. Hybrid Molecules of Azithromycin with Chloramphenicol and Metronidazole: Synthesis and Study of Antibacterial Properties Pharmaceuticals, T17, N2, p.187. (год публикации - 2024)
10.3390/ph17020187

31. Пигарева В.А., Пальцев О.С., Марина В.И., Лукьянов Д.А., Моисеенко А.В., Щелкунов Н.М., Федянини А.А., Сыбачин А.В. Ag2O-Containing Biocidal Interpolyelectrolyte Complexes on Glass Surfaces—Adhesive Properties of the Coatings Polymers, Т.15, №24, р.4690 (год публикации - 2023)
10.3390/polym15244690

32. Егоров Е.С., Кондратенко Н.Д., Аверина О.А., Пермяков О.А., Емельянова М.А., Приходько А.С., Зиновкина Л.А., Сергиев П.В., Зиновкин Р.А. A New Mouse Strain with a Mutation in the NFE2L2 (NRF2) Gene Biochemistry (Moscow), Т.88, №12, c.2375-2386 (год публикации - 2023)
10.1134/S0006297923120039

33. Аверина О.А., Кузнецова С.А., Пермяков О.А., Сергиев П.В. Current Knowledge of Base Editing and Prime Editing Молекулярная биология, V.58, N.4., C. 571-587 (год публикации - 2024)
10.1134/S0026893324700195

34. Петрова М., Маргасюк С., Воробьева М., Скворцов Д., Донцова О., Первушин Д. BRD2 and BRD3 genes independently evolved RNA structures to control unproductive splicing NAR Genomics and Bioinformatics, V.6, N1, lqad113 (год публикации - 2024)
10.1093/nargab/lqad113

Публикации

1. Сергиев П.В., Рубцова М.П. Мал да удал. Биохимия, Т.86, №9, с.1366-13379 (год публикации - 2021)
10.31857/s0320972521090098

Публикации

1. Сергиев П.В., Рубцова М.П. Мал да удал. Биохимия, Т.86, №9, с.1366-13379 (год публикации - 2021)
10.31857/s0320972521090098

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Выявлено 39 отличающихся белков тестикул и 20 отличающихся белков элонгированных сперматид между линиями мышей дикого типа и ΔNSUN7. Показано, что NSUN7 влияет на локализацию и элиминирование плектина из элонгированных сперматид. Не обнаружено отличий в уровне м5С РНК метилирования между образцами РНК мышей дикого типа и ΔNSUN7. Исследование физиологических проявлений нокаутирования генов Thumpd2 и Mettl4 показало, что для мышей Thumpd2-/- характерны патологические нарушения, наблюдаемые при диабете II типа, при этом мыши Mettl4-/- не проявляют такого же яркого патологического фенотипа, но у них так же зафиксированы серьезные метаболические нарушения. Анализ распределения генотипов в новых пометах мышей, несущих инактивирующие мутации в гене C12ORF65 в гетерозиготном состоянии, подтверждает эмбриональную летальность гомозиготных особей, показанную на предыдущем этапе проекта. Метилтрансферазы Mettl4 и Thumpd2 отвечают за внесение метильных групп по позициям m6Am30 в мяРНК U2 и m2G72 в мяРНК U6 соответственно. В результате анализа дифференциальной экспрессии и дифференциального сплайсинга в печени мышей нокаутных по генам указанных метилтрансфераз было показано, что исчезновение каждой из модификаций вызывает общее накопление несплайсированных интронов в РНК. Для ряда событий альтернативного сплайсинга смещение соотношения альтернативных изоформ было более заметно, при этом наибольшее количество статистически значимых изменений наблюдали для удержания интронов (IR). Описанный выше фенотип, вероятно, объясняется более медленной работой сплайсосомы, что ранее уже было показано на клетках HeLa S3. При этом накопление интронов в клетках печени, по-видимому, приводит к накоплению двухцепочечной РНК (из-за гибридизации смысловых и антисмысловых копий повторяющихся генетических элементов в интронах), что, в свою очередь, вызывает оверэкспрессию ряда генов, связанных с иммунным ответом на вирусы, содержащие двухцепочечную РНК. Клеточная локализация мяРНК U2 и U6 не зависит от статуса метилирования по позициям m6Am30 в мяРНК U2 и m2G72 в мяРНК U6. Показано влияние фактора SF3B1 на альтернативный сплайсинг пре-мРНК гена PHF20L1. Найдены регуляторные участки в гене андрогенового рецептора, предположительно образующие вторичную структуру РНК, которые влияют на альтернативный сплайсинг и/или полиаденилирование этого гена. Предсказаны 124 события альтернативного сплайсинга в 3’-нетранслируемых областях, активирующиеся при ингибировании системы NMD и имеющие потенциальные РСБ-регуляторы. Данные, полученные с помощью репортерной конструкции на основе двух люцифераз, указывают на то, что после трансляции кОРС DDX23 происходит реинициация трансляции на основной ОРС. В то же время, сдвиг рамки считывания в кОРС приводит к ее удлинению и пересечению с основной ОРС, что вызывает сильное падение эффективности трансляции основной ОРС DDX23. Последующее снижение уровня белка DDX23 негативно влияет на жизнеспособность клеточной линии человека HAP1. В ходе работы по изучению механизма действия антибиотика – боттромицина А2 – были получены следующие результаты. Применение эукариотической бесклеточной системы, полученной из клеток линии HEK293T, показало, что боттромицин А2, как и его менее активный гидролизованный аналог, отличающийся от боттромицина А2 отсутствием одной метильной группы, не влияет на процесс трансляции в клетках эукариот. Более детальное изучение механизма действия боттромицина А2 при помощи метода тоепринт-анализа показало, что эффективность действия боттромицина А2 зависит от нуклеотидной последовательности глицинового кодона и не зависит от кодона, располагающегося в P-сайте остановленной рибосомы. Также нам удалось выяснить, что боттромицин А2 ингибирует именно процесс переноса растущего пептида на Gly-тРНК, однако при этом, боттромицин А2 лишь частично блокирует продвижение рибосом по мРНК, создавая эффект «бутылочного горлышка» на глициновых кодонах и замедляя таким образом трансляцию.

Публикации

1. Сергиев П.В., Рубцова М.П. Мал да удал. Биохимия, Т.86, №9, с.1366-13379 (год публикации - 2021)
10.31857/s0320972521090098

Возможность практического использования результатов
В ходе выполнения проекта отработана и поставлена на поток методология создания моделей заболеваний на основе редактирования генома мышей. Дальнейшее развитие данной технологии позволит создавать новые платформы для понимания этиологии наследственных заболеваний с последующим включением соответствующих мутаций в диагностические панели пренатальной диагностики. Также развитие данной технологии и созданного технологического задела может быть использовано для тестирования схем терапии и разработки инновационных лекарственных препаратов на мышах с измененным геномом. Понимание особенностей сплайсинга, ассоциированных с паталогическими состояниями, такими, как рак, и выявление методов влияния на отдельные события сплайсинга, например, с помощью аналогов олигонуклеотидов, позволит приблизиться к разработке методов коррекции соответствующих патологий.