Изменение сообществ почвенных грибов и бактерий под валежными стволами лиственных и хвойных деревьев в полидоминантном широколиственном лесу после ветровалов (метагеномный анализ)

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-24-00340

НазваниеИзменение сообществ почвенных грибов и бактерий под валежными стволами лиственных и хвойных деревьев в полидоминантном широколиственном лесу после ветровалов (метагеномный анализ)

Руководитель Ханина Лариса Геннадьевна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт прикладной математики им. М.В. Келдыша Российской академии наук" , г Москва

Конкурс №89 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-107 - Экология биосистем

Ключевые слова биоразнообразие, почвенная микробиота, грибы, бактерии, метагеномный анализ, свойства почв, валежная древесина, экология микроорганизмов, широколиственные леса, ветровал

Код ГРНТИ34.03.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Средствами метагеномного анализа предполагается оценить таксономический состав и видовое разнообразие почвенных грибов и бактерий, обитающих под валежом и в фоновых участках малонарушенного мезофитного широколиственного леса. Исследование будет проводиться в заповеднике “Калужские засеки” и его буферной зоне. Леса заповедника уникальны по своему многовидовому составу, большому возрасту деревьев, наличию на территории единичных и массовых ветровалов, расположенных в различных экотопических условиях. Почвенные грибы и бактерии в лесных экосистемах в большой мере участвуют в формировании ответной реакции лесов на увеличение содержания углекислого газа, потепление, засухи и пожары, вспышки численности вредителей и выпадение азота. Однако представления о пространственно-временной динамике почвенных микроорганизмов в настоящее время только формируются, хотя именно они важны для оценки долгосрочных последствий изменений климата и стратегий природопользования. В проекте предлагается изучение микробиома лесных почв малонарушенного широколиственного леса в связи с естественным нарушением – массовыми и единичными ветровалами. Сравнительный анализ почвенного микробиома под валежом и в фоновой почве позволит как впервые описать сообщества почвенных грибов и бактерий многовидового малонарушенного широколиственного леса, так и охарактеризовать естественные изменения в этих сообществах, имеющие четкие пространственные и временные характеристики; тем самым позволит получить новые результаты, актуальные для развития мировой и российской науки. Новизна исследования определяются как комплексным характером предложенных методов (экологии биосистем, почвоведения, микологии, микробиологии и структурной геномики), так и уникально широким набором объектов исследования. Впервые для почвенных образцов, взятых в разных экотопах под валежом восьми видов деревьев (Quercus robur, Fraxinus excelsior, Tilia cordata, Ulmus glabra, Acer platanoides, Populus tremula, Betula pendula и Picea abies) и в фоновом широколиственном лесу, будут применены методы метагеномики для сравнительного анализа разнообразия почвенной микробиоты. Будут проверяться гипотезы о влиянии лежащего ствола, его видовой принадлежности на разнообразие и состав микробиоты под валежом, а также оригинальная гипотеза о влиянии типа почвы (Arenosol, Luvisol и Phaozem по классификации WRB) в широколиственных лесах на разнообразие почвенных грибов и бактерий. Результаты по применяемым методам будут сопоставимы с результатами мировых исследований почвенного микробиома в лесных сообществах и будут дополнять их в силу оригинальности объекта исследования и проверяемых гипотез. Изучение почвенного микробиома под валежом будет дополнять результаты, полученные в текущем проекте РНФ по метабаркодингу грибного и бактериального сообществ валежной древесины 8 видов деревьев на 5 стадиях разложения. Образцы почв для метагеномного анализа по-возможности будут взяты из-под стволов, из которых были отобраны ранее образцы древесины. Тем самым будет оценена потенциальная связь между ксилобионтными и почвенными сообществами грибов и бактерий. Исследования микробиома лесных почв, сопряженные с исследованиями валежной древесины, приобретают большое значение в связи с вопросами изменения климата, сохранения разнообразия и поддержания устойчивости наземных экосистем. Выполнение проекта позволит получить новые результаты, важные для смягчения последствий изменения климата на нашей планете, для достижения целей карбонового регулирования экономики.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Основными задачами проекта являются: (1) идентификация операционных таксономических единиц (OTU) или вариантов последовательностей ампликонов (ASV) микромицетов и бактерий в почвенных образцах, отобранных под валежом разных видов деревьев и в фоновых почвах широколиственных лесов, расположенных в экотопах флювио-гляциальных песков и покровных суглинков, (2) анализ физико-химических и общих микробиологических характеристик почв, отобранных под валежом разных видов деревьев и в фоновых почвах широколиственных лесов, расположенных на песках и суглинках и (3) оценка видового и функционального разнообразия почвенных грибов и бактерий и анализ взаимосвязей разнообразия и состава микробиоты с почвенными характеристиками и местами взятия почвенных проб (в фоновом лесу, на ветровальном участке, под валежом разных видов деревьев, в разных типах почв). Полевые исследования проводили в 2024 г. в заповеднике “Калужские засеки”. Для изучения метагенома отбор почв проводили из верхних 5 см минерального горизонта А без подстилки в стерильные пакеты стерилизованной ложкой, пакеты замораживали, транспортировку образцов до лаборатории осуществляли в кулере с хладоагентами. Во всех местах отбора проб на метагеномные исследования были также взяты образцы для анализа физических и химических свойств почвы. Отбор проводили под упавшими стволами деревьев и на площадках вне стволов в трехкратной повторности: на участке массового ветровала на песках под стволами пяти видов Quercus robur, Tilia cordata, Acer platanoides, Populus tremula и Picea abies; на участке массового ветровала на суглинках под стволами четырех видов Fraxinus excelsior, Ulmus glabra, Acer platanoides и Picea abies и на участке старовозрастного леса в двух типах почв под стволами Quercus robur. Всего для метагеномного анализа отобрано 63 почвенных образца. Из почвенных образцов выделена суммарная ДНК с использованием набора Qiagen DNAeasy PowerSoil Pro (Qiagen, Германия). Проведена амплификация фрагментов вариабельного участка ITS3-ITS4 грибов и участка V4 16S рРНК бактерий с использованием Q5 (NEB) полимеразы. Количественная оценка выделенной ДНК и измерение концентрации ампликонов проведены при помощи спектрофлуориметра Qubit с использованием наборов Qubit BR и HS 1X Assay Kit (Invitrogen, США). Полученные ампликоны будут использованы для приготовления библиотек и секвенирования на платформе Illumina MiSeq. Амплификация прошла успешно, концентрации ампликонов в целом оказались достаточны для дальнейшей подготовки библиотек. Концентрации и грибов, и бактерий были в основном значимо ниже в образцах, взятых под стволами, чем в образцах, взятых на участках, свободных от лежащих стволов. Этот предварительный вывод согласуется с результатами, полученными нами ранее для микробной активности почв (Ханина и др., 2022; Khanina et al., 2024; Смирнов и др., 2024), которая уменьшалась под стволами на суглинистых почвах. Концентрации бактерий и грибов между образцами изменялись в целом согласованно: при увеличении / уменьшении концентраций бактерий наблюдалось увеличение / уменьшение концентраций грибов. Наибольшие концентрации микроорганизмов наблюдались в дерново-подзолистых почвах на суглинках, наименьшие – в подзолах на песках. В ходе выполнения проекта проанализированы характеристики почвы на участке массового ветровала на суглинках: исследовались физические, химические и микробиологические характеристики, запасы C и N под лежащими стволами деревьев разных видов, рядом с этими стволами и в фоновом лесу вне участка массового ветровала (Khanina et al., 2024). Показано, что на покровных лессовидных суглинках содержание и запасы C, N, микробная активность (углерод микробной биомассы и микробное дыхание), влажность почвы максимальны на участке массового ветровала, свободном от лежащих стволов. Запасы C, N и микробная активность выше на ветровале, чем в фоновом лесу. При этом вид упавшего дерева не влияет на почвенные характеристики. Характеристики почвы под лежащими стволами близки к оценкам фонового леса. На участке старовозрастного леса почва разных типов (дерново-подзолистая и темногумусовая) не различалась по микробной активности, но значимо различалась по содержанию N, C, отношению C/N, содержанию подвижных форм P и К; эти характеристики были выше в темногумусовых почвах. Микробная активность почв значимо падала под валежом, также как содержание C и водородный показатель pH (Ханина и др., 2024; Смирнов и др., 2024). Результаты исследования доложены на 5 конференциях. Опубликована статья в журнале Eurasian Soil Science, статья в продолжающемся издании, один набор данных, 4 статьи в материалах конференций. Выпущен пресс-релиз о проекте «Упавшие деревья – кладовая леса» в газете Поиск (https://poisknews.ru/ekologiya/upavshie-derevya-kladovaya-lesa-sdelana-kolichestvennaya-oczenka-polzy-vetrovala/), на сайте РНФ (https://rscf.ru/news/biology/upavshie-derevya-kladovaya-lesa-uchenye-sdelali-kolichestvennuyu-otsenku-polzy-vetrovala-/?sphrase_id=273759) и других СМИ. Русско- и англоязычные страницы в интернете по проекту расположены по адресам: https://www.impb.ru/index.php?id=div/lce/24-24-00340/index https://www.impb.ru/index.php?id=div/lce/24-24-00340/index&lang=eng

Публикации

1. Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Романов М.С., Смирнов В.Э., Иващенко К.В., Волобуев С.В., Шелякин П.В., Бессонова Т.А., Тутукина М.Н. Разложение валежа в широколиственном лесу. Скорости, динамика деструктуров, влияние на почву Вопросы геологии и комплексного изучения экосистем Восточной Азии : Седьмая Всерос. науч. конф. с междунар. участием : сб. докладов. – Благовещенск: ИГиП ДВО РАН., С. 225–227ю (год публикации - 2024)

2. Смирнов В.Э., Ханина Л.Г., Иващенко К.В., Бобровский М.В. Оценка влияния крупных лежащих стволов дуба на свойства почв на основе статистических моделей со смешанными эффектами Доклады Международной конференции “Математическая биология и биоинформатика”. Под ред. В.Д. Лахно. Пущино: ИМПБ РАН., Том 10. Статья № e52. (год публикации - 2024)
10.17537/icmbb24.54

3. Ханина Л.Г., Бобровский М.В. Loamy soils under and nearby deadwood after mass windthrow in mesic broad-leaved forest Mendeley Data, V. 1 (год публикации - 2024)
10.17632/354yks5f2d.1

4. Ханина Л.Г., Иващенко К.В., Смирнов В.Э., Бобровский М.В. Carbon and Nitrogen Stocks and Microbial Activity of the Humus Horizon of Loamy Soils after Mass Windthrow in the Broadleaved Forest of the Kaluzhskie Zaseki Nature Reserve Eurasian Soil Science, Vol. 57. No. 11. P. 1806-1818 (год публикации - 2024)
10.1134/S1064229324601720

5. Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Смирнов В.Э., Романов М.С. Динамика запасов углерода в валеже и почве после ветровалов в старовозрастном широколиственном лесу Всероссийская научная конференция, посвященная памяти академика Г.А. Заварзина «Биогенный и абиогенный циклы углерода во времени и пространстве и масштабы воздействия на них антропогенных факторов». М.: ПИН РАН. , С. 83-84. (год публикации - 2024)

6. Ханина Л.Г., Бобровский М.В., Смирнов В.Э. Запасы биофильных элементов в суглинистых почвах под и рядом с валежом дуба черешчатого Почва как компонент биосферы: актуальные проблемы в условиях изменений климата. Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 120-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР В.А. Ковды. Пущино: ИФХиБПП РАН., С. 42-43. (год публикации - 2024)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В первый год выполнения проекта были собраны 63 почвенных образца, из них была выделена тотальная ДНК, с использованием стандартных праймеров были амплифицированы вариабельные участки V4 16S рРНК бактерий и ITS грибов. В отчетный период были созданы библиотеки ДНК, которые были отсеквенированы в ЦКП геномики Сколтеха на Illumina MiSeq (Illumina, США). Дополнительно было определено относительное содержание бактериальной и грибной ДНК в образцах путем проведения количественной ПЦР на приборе DT-lite (ДНК-Технология, Россия). После секвенирования выполняли биоинформатический анализ сообществ грибов и бактерий. Таксономические принадлежности вариантов последовательностей ампликонов (ASV) были определены на основе референсных последовательностей из базы данных GreenGenes2 (McDonald et al., 2024) для бактерий и с помощью классификатора в базе данных UNITE (Abarenkov et al., 2024) для грибов. После даунсэмплирования в сообществе бактерий осталось 19287 уникальных ASV бактерий и 1565 ASV грибов. Рассчитывали метрики альфа и бета-разнообразия. Проверяли гипотезы, что на содержание и разнообразие почвенных микробных сообществ влияют (1) гранулометрический состав почв и биотопы, (2) массовый ветровал, включая лежащие стволы и участки вне валежа, в сравнении с фоновым лесом без валежа; (3) лежащие стволы деревьев при сравнении с участками вне валежа и (4) видовая принадлежность валежных стволов. Оценивали значимость различий относительного содержания ДНК, индексов альфа-разнообразия и состава ASV бактерий и грибов между группами образцов путем проведения анализов ANOVA и PERMANOVA. Относительное содержание ДНК бактерий было выше в образцах, взятых в суглинках, чем в образцах, взятых в песках, и наоборот, содержание ДНК грибов было выше в песках. Относительное содержание ДНК бактерий было ниже в образцах, взятых под стволами, чем в образцах, взятых на участках, свободных от лежащих стволов. Максимальное содержание ДНК бактерий наблюдали в темногумусовых почвах (Phaozems) старовозрастного леса на участках без валежа. Относительное содержание ДНК грибов было максимальным в подзолах под валежом (особенно под стволами ели) и минимальным в суглинках. Профилирование микробных сообществ при помощи секвенирования 16S рРНК показало, что изученные почвы 70-, 100- и более чем 300-летних лесов отличаются высоким обилием групп бактерий, участвующих в циклах углерода, азота, фосфора, серы, а также функционировании ризосферы. Основная группа бактерий в исследованных лесах – Alphaproteobacteria, прежде всего порядок Rhizobiales, представители которого ассоциированы с ризосферой и играют важную роль в азотном цикле. Состав доминирующих классов – преобладание Alphaproteobacteria и Verrucomicrobiae, а также Planctomycetia в песчаных почвах, – отличает почвы “Калужских засек” от большинства других исследованных лесных почв, прежде всего небольшой долей ацидобактерий и актиномицетов. Профилирование грибных сообществ путем секвенирования участка ITS показало, что заметная особенность этих сообществ в исследованных почвах – абсолютное доминирование аскомицетов при очень малом участии других филумов. В фаоземах и ретисолях преобладают сапрофиты. Эктомикоризные грибы доминируют только в фоновом лесу на подзолах, в почвах остальных сайтов на подзолах их доля также значительна, при этом преобладает Cenococcum, наиболее распространенный монотипный род микоризообразующих грибов. Наибольшее богатство грибных ASV отмечено для сообществ фаоземов, здесь же отмечено минимальное число доминирующих родов (Penicillium, Oidiodendron и Helotiales), что означает высокое внутриродовое разнообразие грибных сообществ фаоземов. По структуре сообществ, разнообразию и содержанию бактериальной и грибной ДНК наиболее существенные различия отмечены между сообществами в почвах разного гранулометрического состава: в песках (дерново-подзолы) и суглинках (ретисоли и фаоземы). Несмотря на более высокое относительное содержание ДНК грибов в песчаных почвах, в суглинистых значимо выше альфа-разнообразие сообществ и бактерий, и грибов. Результаты подтвердили гипотезу о значимом влиянии валежной древесины на микробные сообщества лесных почв. Влияние на бактериальное сообщество очень разнообразно, оно зависит как от свойств почв, так и от вида упавшего дерева. Вместе с тем, структура бактериальных сообществ по высокочастотным порядкам довольно консервативна и не сильно варьирует между сайтами в пределах биотопа. Наиболее заметны изменения в составе сообществ под валежом деревьев со специфическими свойствами древесины (Quercus robur, Picea abies, Acer platanoides). Для грибных сообществ средние значения альфа-разнообразия под валежом по сравнению с фоном оказались ниже в сгулинистых почвах и выше в песчаных почвах (хотя различия статистически не значимы). Под валежом и на участках массового ветровала без валежа наблюдали большое число уникальных таксонов, составляющих более половины общего числа определенных ASV. Наличие валежа разных видов деревьев и ветровалы, ведущие к изменению экологических условий, принципиально увеличивают бактериальное и грибное разнообразие лесных почв. Сохранение крупных древесных остатков при эксплуатации лесов способствует сохранению и поддержанию почвенного биоразнообразия. Результаты исследования доложены на трех продолжающихся национальных конференциях с международным участием – по Математическому моделированию в экологии (Экоматмод), Экологическим функциям лесных почв и Вычислительной молекулярной биологии (MCCMB). Опубликовано 3 статьи. Обновлены русско- и англоязычные страницы в интернете по проекту: https://www.impb.ru/index.php?id=div/lce/24-24-00340/index https://www.impb.ru/index.php?id=div/lce/24-24-00340/index&lang=eng

Публикации

Возможность практического использования результатов
Полученные результаты о высоком разнообразии бактерий и грибов в лесах с крупным валежом разных пород деревьев на почвах различного гранулометрического состава следует учитывать при разработке современных стратегий управления лесами. Такие стратегии должны быть направлены на поддержание долгосрочного баланса углерода и стабильного круговорота элементов в лесных экосистемах. Создание многовидовых лесных насаждений, включающих крупные древесные остатки и древостой разного возраста, способствуют повышению способности лесов к секвестрации углерода, сохранению биоразнообразия и реализации принципов низкоуглеродной экономики. При планировании лесохозяйственных мероприятий важно ограничивать удаление крупного валежа и поддерживать разновозрастную структуру древостоя, т.к. эти элементы повышают устойчивость леса к изменению климата и способствуют долгосрочному накоплению углерода.