Исследование профаговых последовательностей и анализ систем защиты от бактериофагов для метилобактерий рода Methylococcus

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-24-00454

НазваниеИсследование профаговых последовательностей и анализ систем защиты от бактериофагов для метилобактерий рода Methylococcus

Руководитель Резайкин Алексей Васильевич, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина" , Свердловская обл

Конкурс №89 - Конкурс 2023 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований малыми отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-207 - Системная биология; биоинформатика

Ключевые слова геномный анализ, бактериофаги, метанотрофы, профаги, биоинформатика, модель профаговой индукции, CRISPR, математическое моделирование, прогнозное моделирование, геномика бактерий, большие данные

Код ГРНТИ34.03.23

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Настоящий проект направлен на исследование профаговых последовательностей и анализ систем защиты от бактериофагов для метилобактерий рода Methylococcus. Основу исследованиям должен обеспечить комплексный подход: в рамках реализации задач проекта будут получены новые результаты в части (1) поиска профаговых последовательностей в геномах метилобактерий рода Methylococcus и их характеризации, (2) прогноза индукции профагов, обнаруженных в геномах метилобактерий рода Methylococcus, а также в части (3) анализа систем защиты от бактериофагов в исследуемых бактериальных геномах рода Methylococcus. Проект значим с научной точки зрения не только в контексте отдельных решаемых задач биоинформатики и моделирования, но и как комплексная проблема, требующая совместной работы исследователей из различных областей науки, включая биологические, физико-математические, компьютерные, с соответствующим синергетическим эффектом взаимодействия указанных групп исследователей при достижении основных результатов проекта. На данный момент в открытом доступе опубликовано значительное количество свежих исследований, посвященных анализу фагов биоинформатическими методами; соответственно, существует большой арсенал инструментов, предназначенных для поиска фагов в бактериальных геномах. Метанотрофные бактерии рода Methylococcus играют важнейшую роль в глобальном круговороте углерода, превращая метан в метанол и далее в продукты с высокой добавленной стоимостью. Лучшее понимание их взаимодействия с бактериофагами поможет пролить свет на их стратегии выживания, потенциальную уязвимость и экологическую роль. Результаты настоящего исследования будут способствовать дальнейшему углублению понимания геномики Methylococcus и других родственных бактерий, а также их взаимодействия с различными вирусами. Поскольку анализа фагов биоинформатическими методами для рода Methylococcus ранее не проводилось, представляет интерес проведение биоинформатического анализа профагов в публично доступных геномных сборках различных штаммов данного рода. Для анализа будут выбраны геномы хорошего качества рода Methylococcus. Анализ данных геномов позволит оценить разнообразие фагов внутри рода Methylococcus, описать метаболический потенциал выявленных фагов. Применение филогенетических методов позволит сопоставить родство фагов с родством анализируемых бактериальных геномов, таким образом выявив события горизонтального переноса, что может дать информацию о роли фагов в эволюции бактерий данного рода. Обозначая научную новизну исследований в части прогноза индукции обнаруженных профагов, следует отметить, что впервые будут сформулированы подходы интегральной оценки потенциала индукции под действием факторов внешней или внутренней среды обнаруженных в геноме прокариот профагов с учетом результатов анализа набора генов, необходимого для реализации литического цикла репродукции, а также их функционального состояния. Несмотря на то что взаимодействие между бактериофагами и их бактериальными хозяевами находится в фокусе внимания научного сообщества несколько декад, существует значительный пробел в знаниях, особенно в отношении некоторых специфических родов бактерий, таких как Methylococcus. Учитывая достижения в области секвенирования генома и биоинформатики, а также опыт команды, сочетание широких специальных знаний членов коллектива и навыков их успешного применения при работе над индивидуальными и совместными междисциплинарными проектами, будет обеспечен синергетический эффект и достижимость заявленных результатов настоящего Проекта, в частности по получению всесторонней картины защитных систем от бактериофагов рода Methylococcus.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
На протяжении этапа 1 проекта “Исследование профаговых последовательностей и анализ систем защиты от бактериофагов для метилобактерий рода Methylococcus” выполнен значительный объем научных работ в рамках исследования профагов и систем защиты у метилобактерий рода Methylococcus. Основные результаты охватывают три аспекта: поиск профаговых последовательностей в геномах, прогноз их индукции, а также анализ систем бактериальной защиты от фагов. Для поиска профаговых последовательностей использовались десять полных неаннотированных геномов, полученных из базы данных RefSeq. Исследованный набор включал геномы шести штаммов Methylococcus capsulatus, по одному геному M. geothermalis и M. mesophilus, а также два штамма с неопределенной видовой принадлежностью. Геномы исследовались с использованием четырех взаимодополняющих биоинформатических алгоритмов: PHASTEST, Phigaro, VIBRANT и PhiSpy. Это позволило обнаружить 78 потенциальных профаговых областей. Максимальное количество регионов выявлено с помощью PhiSpy (30,8%), что подтверждает эффективность использования комплексного подхода. Размеры областей варьировали от 11 до 61 тыс. п.н., причем достоверных статистических различий между результатами различных алгоритмов выявлено не было. На следующем этапе все области подверглись объединению и фильтрации на основе критериев качества, включая минимальный размер и наличие специфических для профагов генов. Этот процесс привел к идентификации 12 профаговых областей, наиболее значимых для дальнейшего анализа. Наибольшее количество профагов содержал штамм M. mesophilus 16-5, в геноме которого профаговая ДНК составила 3,82%. Филогенетический анализ, выполненный с использованием программного пакета VICTOR, позволил установить родственные связи между профагами. На уровне рода идентифицированы четыре кластера, демонстрирующие высокую филогенетическую связанность исследованных регионов. Прогноз индукции профагов основывался на анализе их функционального состояния, выполненном с помощью программ PHASTEST и VIBRANT, а также последующей валидации результатов с использованием алгоритма CheckV. Оценка полноты геномов профагов показала, что пять из них обладают высоким потенциалом для реализации литического цикла репродукции. Полученные данные также подтвердили родственные связи между профаговыми последовательностями, что позволяет проводить более глубокий анализ их биологической значимости и эволюционной истории. Важным направлением работы стал анализ систем бактериальной защиты от фагов. С использованием программы DefenseFinder в геномах обнаружено от 8 до 17 систем защиты, включая CRISPR-Cas и системы рестрикции-модификации. Эти системы продемонстрировали значительное разнообразие как внутри одного штамма, так и между разными штаммами. В частности, уникальные системы были выявлены в геноме штамма EFPC2, что свидетельствует о возможных событиях горизонтального переноса. Дополнительный анализ, проведенный для систем CRISPR-Cas и рестрикции-модификации типа I, показал высокую консервативность этих систем в большинстве исследованных штаммов. Использование инструмента Clinker для визуализации геномного контекста позволило установить степень гомологии генов и подтвердить филогенетическую связь между штаммами. Таким образом, результаты исследования не только расширяют существующие представления о профагах и их функциональном состоянии, но и вносят вклад в понимание эволюции защитных систем бактерий. Выполненная работа подчеркивает важность комплексного подхода, объединяющего передовые методы биоинформатики и филогенетического анализа для изучения взаимодействий между фагами и бактериями и образует значимый задел для решения задач этапа 2.

Публикации

1. Резайкин А.В., Микушин П.В., Низовцева И.Г., Чигирева А.А., Дубова В.И., Глебова А.Е. Сравнительный анализ биоинформатических алгоритмов поиска профагов в бактериальном геноме XI Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины - 2024 : сб. тез. / АНО «Инновационный центр Кольцово». - Новосибирск: ИПЦ НГУ, XI Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины - 2024 : сб. тез. / АНО «Инновационный центр Кольцово». - Новосибирск: ИПЦ НГУ, -2024. - С.75-77 (год публикации - 2024)
10.25205/978-5-4437-1691-6-36

2. Чигирева А.А., Резайкин А.В., Низовцева И.Г., Коренская А.Е. Биоинформационный анализ профагового разнообразия в геномах бактерий рода Methylococcus Сборник тезисов 28-й Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ – НАУКА XXI ВЕКА». Пущино: ФИЦ ПНЦБИ РАН, 2025. – 668 с., Биоинформационный анализ профагового разнообразия в геномах бактерий рода Methylococcus / Чигирева А.А., Резайкин А.В., Низовцева И.Г., Коренская А.Е. // Сборник тезисов 28-й Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «Биология - наука XXI века», Пущино, 21–24 апреля 2025 года. – Пущино: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук", 2025. – С. 150-151. (год публикации - 2025)

3. Чигирева А.А., Низовцева И.Г., Резайкин А.В., Стародумов И.О., Коренская А.Е. Геномный анализ бактерий рода Methylococcus на предмет систем защиты от бактериофагов Сборник тезисов IV Международной конференции «СОХРАНЕНИЕ И ПРЕУМНОЖЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ МИКРООРГАНИЗМОВ». — Москва: Издательство Перо, 2025. — 1,8 Мб. [Электронное издание], Геномный анализ бактерий рода Methylococcus на предмет систем защиты от бактериофагов / А.А. Чигирева, И.Г. Низовцева, А.В. Резайкин [и др.] // Сохранение и преумножение генетических ресурсов микроорганизмов : СБОРНИК ТЕЗИСОВ IV МЕЖДУНАРОДНОЙ КОНФЕРЕНЦИИ, Санкт-Петербург, 30 июня – 02 2025 года. – Москва: Перо, 2025. – С. 95. (год публикации - 2025)

4. Чигирева А.А., Коренская А.Е., Резайкин А.В., Стародумов И.О., Низовцева И.Г. Системы защиты от бактериофагов в геномах бактерий рода Methylococcus XII Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины — 2025 : сб. тез. / АНО «Инновационный центр Кольцово». — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2025. — 776 с., Системы защиты от бактериофагов в геномах бактерий рода Methylococcus / Чигирева А.А., Коренская А.Е., Резайкин А.В., Стародумов И.О., Низовцева И.Г. // XII Международная конференция молодых ученых: биоинформатиков, биотехнологов, биофизиков, вирусологов, молекулярных биологов и специалистов фундаментальной медицины — 2025 : сб. тез. АНО «Инновационный центр Кольцово». — Новосибирск : ИПЦ НГУ, 2025. — 776 с. (год публикации - 2025)
10.25205/978-5-4437-1843-9-32

5. Низовцева И.Г., Резайкин А.В., Коренская А.Е., Захарцев М.В., Чигирева А.А., Стародумов И.О., Чернушкин Д.В. Identification and comparative genomic analysis of prophage sequences and CRISPR‒Cas immunity in Methylococcus genomes: insights into industrial methane bioconversion Biotechnology for Biofuels and Bioproducts, Nizovtseva, I., Rezaykin, A., Korenskaia, A. et al. Identification and comparative genomic analysis of prophage sequences and CRISPR‒Cas immunity in Methylococcus genomes: insights into industrial methane bioconversion. Biotechnol. Biofuels Bioprod. 19, 21 (2026). https://doi.org/10.1186/s13068-026-02738-6 (год публикации - 2026)
10.1186/s13068-026-02738-6

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В отчетный период были полностью завершены все запланированные исследования по всем трём задачам: поиску и характеризации профагов, оценке их индукционного потенциала и анализу систем защиты от фагов, прежде всего CRISPR-Cas. По первой задаче был доведён до окончательного вида и применён к геномам бактерий рода Methylococcus многоэтапный биоинформатический конвейер поиска профагов. Конвейер объединяет результаты четырёх специализированных алгоритмов (PHASTEST, Phigaro, VIBRANT, PhiSpy) с последующей фильтрацией по длине, числу фагоспецифичных генов, оценкам качества и наличию сайтов attL/attR, а также уточнением границ профагов с помощью CheckV и попарных выравниваний ProgressiveMauve с «незараженными» референсными геномами. Это позволило получить согласованный набор из 12 хорошо охарактеризованных профаговых регионов и проверить, что их интеграция не нарушает целостность ключевых метаболических генов Methylococcus capsulatus, поскольку вставки локализуются в межгенных областях либо рядом с дублированными тРНК-локусами. В рамках второй задачи проведён детальный сравнительный анализ структуры и потенциальной функциональности выявленных профагов. На основе аннотации генов (Pharokka, PhageScope), межгеномных выравниваний (Clinker) и оценки полноты CheckV профаги были разделены на три кластера, относящиеся к классу Caudoviricetes и различающиеся предполагаемой морфологией (сифо- и миовирусы). Показано, что большинство последовательностей (9 из 12) сохраняют полный набор генов, необходимый для литического цикла: гены интегразы/транспозазы, терминазы, структурные гены головки, хвоста и базальной пластинки, а также модуль лизиса с эндолизином и спанином. Для одного профага выявлены крупные делеции, ставящие под сомнение возможность завершения литического цикла. Филогенетический анализ на основе протеомов (ViPTree) показал сходство этих элементов с ранее описанными фагами Acidithiobacillus и Burkholderia, что подчёркивает их экологическую и эволюционную значимость. По третьей задаче выполнен комплексный анализ систем защиты от бактериофагов, с акцентом на CRISPR-Cas. Показано, что исследованные штаммы Methylococcus несут, как минимум, четыре типа CRISPR-Cas-систем, при этом подтипы I-E и I-C обнаружены практически во всех геномах, а в отдельных штаммах дополнительно выявлены системы I-F и III-A. Филогенетический анализ белков Cas и сравнение структуры локусов продемонстрировали сочетание вертикального наследования консервативного «ядра» системы и эпизодов горизонтального переноса отдельных генов, прежде всего cas3 и cas5. Отдельный блок работ был посвящён анализу спейсеров CRISPR и их потенциальных мишеней. С использованием инструмента SpacePHARER сопоставлены все спейсерные последовательности с библиотекой 12 профагов Methylococcus и крупной коллекцией фаговых геномов из базы PhageScope. Построен полный перечень пар «спейсер – фаговая мишень. Показано, что наибольшее число спейсеров направлено против профагов 16-5-R1, 16-5-R2 и McNor-R1, причём положение соответствующих спейсеров в кассетах позволяет оценить относительный «возраст» эпизодов инфицирования. Всего 57 спейсеров (около 5 % от общего числа) продемонстрировали надёжные совпадения с профаговыми последовательностями, преимущественно в генах хвостовых и головных белков, а также в кластерах гипотетических вирусных белков, что даёт основания предполагать их функциональную значимость в взаимодействии «фаг – хозяин». Полученные результаты формируют целостное представление о составе и потенциальной активности профагов у метанотрофов рода Methylococcus и о многоуровневых защитных механизмах этих бактерий, что создаёт фундаментальный задел для разработки прогностических моделей профаговой индукции и для последующего использования штаммов Methylococcus capsulatus в стабильных биотехнологических процессах, включая производство микробного белка и другие направления биоэкономики.

Публикации

Возможность практического использования результатов
По результатам реализации проекта «Исследование профаговых последовательностей и анализ систем защиты от бактериофагов для метилобактерий рода Methylococcus» подтверждена высокая перспектива практического использования полученных результатов в экономике и социальной сфере. Проект сформировал научный и технологический задел в области интеграции биоинформатики, геномики и системной биологии, что соответствует переходу к передовым цифровым интеллектуальным производственным технологиям, прежде всего в биотехнологической и фармацевтической промышленности. Сформированные в ходе Проекта подходы к комплексному геномному анализу защитных механизмов бактерий рода Methylococcus, включая системы CRISPR-Cas и другие фагорезистентные механизмы, создают основу для прецизионной инженерии промышленных штаммов, в том числе Methylococcus capsulatus, с целью оптимизации процессов производства микробного белка и иных биотехнологических продуктов. Выявление уникальных и общих защитных генов всего рода, а также оценка индукционного потенциала профагов позволяют повысить надежность и предсказуемость биотехнологических процессов, минимизировать риски сбоев, связанных с активацией профагов, и тем самым улучшать системы контроля качества и биобезопасности.