Метабаркодинг морского фитопланктона и фитобентоса Южно-Китайского моря как основа современного биомониторинга

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 24-44-04006

НазваниеМетабаркодинг морского фитопланктона и фитобентоса Южно-Китайского моря как основа современного биомониторинга

Руководитель Кезля Елена Михайловна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук , г Москва

Конкурс №96 - Конкурс 2024 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (VAST)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-102 - Ботаника

Ключевые слова микроводоросли, цианобактерии, биоиндикация, новые виды, база данных, метабаркодирование, мультигенная филогения, коллекция культур микроводорослей, генетические маркеры, вредные виды цветения водорослей, Южно-Китайское море

Код ГРНТИ34.29.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Изменение климата, участившиеся случаи вредоносных цветений указывают на необходимость разработки и внедрения быстрых и простых методик экологического мониторинга. В настоящее время подходы метабаркодирования активно внедряются в программы рутинного биомониторинга в ряде стран. Однако, несмотря на многообещающие перспективы этого метода, остается много нерешенных проблем. Географически акватории России и Вьетнама опосредованно связаны. Режим течений Японского моря связан с притоком субтропических вод через Корейский пролив. Куросио (три его ветви - Восточно-Корейское течение, Цусимское течение и безымянная ветвь между ними) переносит тёплые и солёные воды Южно-Китайского и Восточно-Китайского морей в акваторию Японского моря. В тоже время Россия и Вьетнам связаны высоким потоком морских грузоперевозок. Поэтому биологический мониторинг является актуальной задачей в управлении водными ресурсами. Данный международный проект нацелен на решение целого ряда актуальных проблем связанных с применением современных подходов высокопроизводительного секвенирования в биомониторинге. Впервые планируется провести масштабную молекулярную паспортизацию микроводорослей и цианобактерий фитопланктона и фитобентоса Южно-Китайского в районе побережья Вьетнама. Запланирован комплексный подход, который включает создание большой региональной библиотеки штрихкодов (на основе коллекции моноклональных культур микроводорослей и цианобактерий) и метабаркодинг. Будет проведено детальное изучение морфологии всех штаммов, филогенетический анализ по нескольким маркерным генам, оценка токсического потенциала, будут определены физико-химические условия местообитания. Для многих видов моноклональные культуры будут получены впервые. Настоящий проект позволит выявить криптические и псевокриптические виды характерные для локального географического района, пересмотреть их индикаторную значимость и определить биогеографию и экологические предпочтения отдельных филогенетических линий, провести ревизию сложных для идентификации таксонов. Молекулярная паспортизация является основой для понимания эффективности наборов праймеров и таксономического разрешения баркодовых регионов. Фундаментальные знания, полученные для множества таксонов, кратно увеличат эффективность расшифровки данных метабаркодинга в биомониторинге и прогнозировании развития токсичных цветений. Данные метабаркодинга не являются количественными, т.к. учитывают число последовательностей, а не число клеток. Мы планируем провести скрининг культур микроводорослей и цианобактерий на определение числа копий баркодового генетического маркера SSU при помощи современного метода капельной цифровой ПЦР и разработать методику количественной оценки видов по данным метабаркодинга. Полученные результаты послужат эффективному применению подходов метабаркодирования в практике гидробиологических мониторинговых исследований в акватории вьетнамского побережья Южно-Китайского моря, в особенности в отслеживании распространения и развития токсичных видов микроводорослей.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В июле 2024 г. совместно с вьетнамскими коллегами проведена экспедиция вдоль побережья Южно-Китайского моря. Протяженность маршрута составила 700 км к северу от г. Нячанг (Nha Trang) до г. Куатанг (Cua Tung)(провинция Куангтри (Quang Tri). Отбор проб проводился в прибрежной части, точки отбора удалены друг от друга примерно на 50-150 км. В четырех точках для отбора проб были арендованы лодки, в этих точках образцы планктона собирали в 1-5 км от берега. В результате проведенных в 2024 г. работ для изучения разнообразия и молекулярной паспортизации микроводорослей и цианобактерий Южно-Китайского моря собраны пробы фитопланктона (45 образцов), бентоса (8), перифитона (11). Пробы обработаны, на данном этапе получено 287 штаммов диатомовых водорослей, еще 85 штаммов находятся на стадии наращивания биомассы для последующего выделения ДНК и изучения морфологии. Для всех полученных штаммов выделена ДНК, проведена амплификация и секвенирование по маркерным регионам V4 18SrDNA и rbcL. В настоящее время качественные прочтения получены для 144 штаммов. Все штаммы диатомовых водорослей изучены при помощи светового микроскопа. Проведена фотофиксация, для каждого штамма получено по 15-20 изображений и фокусировкой основных морфологических признаков важных для идентификации таксонов (всего 4879 изображений). Проведена идентификация полученных штаммов. Выявлен 121 вид, относящихся к 41 роду диатомовых водорослей, из классов Bacillariophyceae (102 вида), Coscinodiscophyceae (15), Mediophyceae (1). Наибольшее число видов относится к родам Nitzschia (15), Navicula (12), Psammodictyon (7), из родов Amphora и Halamphora найдено 7 и 6 видов соответственно, к Seminavis отнесено 4 вида, из родов Diploneis и Fragillaria по 3 вида. Остальные роды представлены не более чем двумя видами. В ходе изучения и идентификации штаммов выявлены виды предположительно новые для науки из родов Nitzschia, Psammodictyon, Astartiella. В настоящее время проведена дополнительная очистка суспензии створок этих видов для изучения на СЭМ и ТЭМ. Описание видов и анализ филогенетического положения будут сделаны в следующем году. Среди распространенных видов (выявленных в более 80% природных образцов) отмечены Coscinodiscus cf. granii, Thalassiosira cf. аllenii, Biddulphia sp, Actinocyclus sp., Psammodictyon sp. В результате анализа полученных нуклеотидных последовательностей этих видов, выявлено что штаммы Coscinodiscus cf. granii (получено всего 7 штаммов из 6 точек сбора) представляют две генетически отличные группы. На данном этапе штаммы изучены только в световой микроскоп, явные морфологические отличия не обнаружены. Для выявления морфологических отличий между этими генетическими группами необходимо детальное изучение этих штаммов при помощи СЭМ. Напротив, последовательности обоих маркеров V4 18S rDNA и rbcL штаммов Thalassiosira cf. аllenii (всего 6 штаммов из 4 точек сбора) оказались полностью идентичны, что говорит о генетической стабильности этого вида. Среди штаммов Psammodictyon sp. (получено всего 19 штаммов из 9 точек сбора) обнаружено три генетически отличные группы. Это мелкоклеточные формы (10-20 мкм длиной, 4-5 мкм шириной) и для выявления морфологических особенностей необходимо исследование при помощи СЭМ. Для некоторых редких видов, например Seminavis cf. robusta, Haslea cf. tsukamotoi, Achnanthes sр., получено по 2-3 штамма. Внутривидовая вариабельность генетических маркеров не отмечена. Понимание связей молекулярных данных с морфологическими особенностями видов, или напротив, выявление криптических видов, является основой для правильной интерпретации данных метагеномного анализа, а также для понимания причин расхождения в данных, полученных при помощи метабаркодинга и при помощи классических подходов (микроскопирование). Нами проведено изучение штаммов диатомовых водорослей выделенных из образцов эпилитона, собранных в прибрежной части г.Нячанг сотрудниками лаборатории в 2018 г. Штаммы хранились в лаборатории молекулярной систематики водных растений ИФР РАН. В результате нами описан новый род и новый вид диатомовых водорослей Stigmagloia lobbanii gen. et sp. nov. (Bacillariophyceae, Mastogloiales) (Kezlya et al., 2024, Phytotaxa 677 (1): 049–065). Новый род выделен нами из рода Mastogloia, который включает в себя в основном морские диатомовые водоросли, имеющие модифицированную и специализированную вальвокопулу, называемую партектой. Проведено морфологическое сравнение Stigmagloia lobbanii sp. nov. с близкими видами рода Mastogloia sensu lato. На основании сочетания таких признаков как форма и размер створки, плотность ареол и штрихов, ширины партектального кольца подтверждено выделение нового вида. Филогенетический анализ, проведенный нами на основе двух генов 18S rRNA and rbcL показал, что представители Mastogloia формируют самостоятельную кладу вместе с Aneumastus с высокой поддержкой узла Aneumastus/Mastogloia (PP 0,93). Причем все таксоны Aneumastus формируют хорошо поддержанную подкладу (PP 1), тогда как штаммы Mastogloia формируют отдельные линии в пределах клады Aneumastus/Mastogloia, что говорит о высокой степени их обособленности между собой. Штамм нового рода Stigmagloia lobbanii SVN638 формирует самостоятельную линию рядом с Mastogloia recta. Матрица p-расстояний показала, что S. lobbanii sp.nov. имеет низкие значения сходства с другими штаммами Mastogloia (p-distance для региона V4 SSU 67,76–91,09%, для региона rbcL 89,34–92,89% Таким образом, на основе сочетания морфологических и молекулярных данных подтверждено выделение нового рода Stigmagloia gen. nov. В настоящее время получены сырые данные метагеномного анализа 17ти образцов фитопланктона по двум маркерным регионам V4 и V9 18S rDNA. Биоинформатическая обработка и анализ данных будет сделан в начале следующего этапа проекта.

Публикации

1. Кезля Е.М., Глущенко А.М., Капустин Д.А., Мальцев Е.И. Доан-Нху Х., Куликовский М.С. Stigmagloia lobbanii gen. et sp. nov. (Bacillariophyceae, Mastogloiales), a new stigma-bearing diatom genus separated from Mastogloia Phytotaxa , 677 (1): 049–065 (год публикации - 2024)
https://doi.org/10.11646/phytotaxa.677.1.2

2. Миронова Э.А. , Кезля Е.М., Куликовский М.С. Эпибионтные диатомовые водоросли морских черепах, обитающих у побережья г. Нячанг (Вьетнам) Водоросли: проблемы таксономии и экологии, использование в мониторинге и биотехнологии. Материалы VII Всероссийской научной конференции с международным участием. — Владивосток: 2024. — 129 с., с. 85 (год публикации - 2024)

3. Муравьева А.В., Кезля Е.М., Глущенко А.М., Генкал С.И., Мальцев Е.И., Доан Нху Х., Нгуен Нгок Л., Хуинь Тхи Нгок Д., Куликовский М.С. Новый вид рода Divergita (Ulnariaceae) из Южно-Китайского моря: морфология и молекулярные данные Вопросы современной альгологии, Вопросы современной альгологии. 2025. № 1 (37). C. 48–50 (год публикации - 2025)
10.33624/2311-0147-2025-1(37)-48-50

4. Кезля Е.М., Капустин Д.А., Глущенко А.М., Цеплик Н.Д., Мальцев Е.И., Генкал С.И., Доан-Нху Х., Нгуен Нгок Л., Хуинь Тхи Нгок Д., Куликовский М.С. Морфологическая и генетическая вариабельность Schizostauron из Южно-Китайского моря (Вьетнам) Вопросы современной альгологии, Вопросы современной альгологии. 2025. № 1 (37). C. 38–40. (год публикации - 2025)
10.33624/2311-0147-2025-1(37)-38-40

5. Голубева А.И., Кезля Е.М., Капустин Д.А., Доан-Нху Х., Нгуен Нгок Л., Хуинь Тхи Нгок Д., Мальцев Е.И., Куликовский М.С. Новый вид Psammodictyon (Bacillariaceae) из Южно-Китайского моря (Вьетнам) Вопросы современной альгологии, ВОПРОСЫ СОВРЕМЕННОЙ АЛЬГОЛОГИИ. 2025. № 1(37), C. 21-23. (год публикации - 2025)
10.33624/2311-0147-2025-1(37)-21-23

6. Кезля Е., Капустин Д., Кривова З., Мальцев Е., Нгуйен-Нгок Л., Хуинь Т.Н.Д., Доан-Нху Х., Куликовский М. Comprehensive analysis of the diatom genus Psammodictyon from Viet Nam: new species, molecular data, and fatty acid content Frontiers in Microbiology, Frontiers in Microbiology 16: 1701605 (год публикации - 2025)
10.3389/fmicb.2025.1701605

7. Голубева А., Кезля Е., Капустин Д., Доан Нху Н., Нгуен Нгок Л., Хюнь Т.Н.Д., Мальцев Е., Куликовский M. Diversity and distribution of diatom along the Vietnamese Coast of the South China Sea based on 18S V4 and V9 rDNA metabarcoding analysis Jonathan C. Taylor & Anatoliy Levanets (Eds). 2025. 27th International Diatom Symposium. Skukuza, Kruger National Park, 3‐8 August 2025. Programme and Book of Abstracts., p. 34-35 (год публикации - 2025)

8. Капустин Д.А., Кезля Е.М., Глущенко А.М., Мальцев Е.И., Доан Нху Х., Нгуен Нгок Л., Хуинь Тхи Нгок Д., Куликовский М.С. Морфологическое и молекулярно-филогенетическое исследование Mastogloia cf. cyclops из Южно-Китайского моря (Вьетнам) Вопросы современной альгологии, Вопросы современной альгологии. 2025. № 1 (37). C. 32–34. (год публикации - 2025)
10.33624/2311-0147-2025-1(37)-32-34

9. Юрчак М., Гогорев Р., Соколова И., Кезля Е., Доан-Нху Х., Куликовский М. Morphology of alveolate species of the genus Cocconeis (Cocconeidaceae, Bacillariophyta) with the description of Monoalveoneis gen. nov. Phytotaxa, Phytotaxa 721 (3): 201–217 (год публикации - 2025)
10.11646/phytotaxa.721.3.1

10. Кезля Е., Капустин Д., Доан-Нху Х., Нгуйен-Нгок Л., Хуинь Тхи Нго Д., Мальцев Е., Куликовский М. Psammodictyon crassum sp. nov., a new diatom species from the coastal waters of Viet Nam based on morphology and molecular data Diatom Research (год публикации - 2025)
10.1080/0269249X.2025.2577199

11. Кезля Е., Капустин Д., Доан Нху Н., Нгуен Нгок Л., Хюнь Т.Н.Д., Мальцев Е., Куликовский M. New species of Psammodictyon D.G. Mann from the South China Sea: morphology, phylogeny, and evaluation of the effectiveness of genetic markers for species delimitation Jonathan C. Taylor & Anatoliy Levanets (Eds). 2025. 27th International Diatom Symposium. Skukuza, Kruger National Park, 3‐8 August 2025. Programme and Book of Abstracts., p.49-50 (год публикации - 2025)

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году совместно с вьетнамскими коллегами проведено две экспедиции для отбора проб фитопланктона и фитобентоса Южно-Китайского моря. Первый маршрут: Нячанг (Nha Trang) – Кьензянг (Kien Giang), 850 км, в дельте р. Меконг, второй . Нячанг (Nha Trang) – Хюэ (Hue) -о. Лишон (Ly Son Island), 816 км к северу от г. Нячанг. Собрано 28 образцов на метебаркодинг, 127 обазцов для выделения культур микроводорослей и 130 образцов для изучения состава микроводорослей классическими методами. Для 20 точек сбора получены данные химического анализа содержания биогенных элементов. Обработаны сырые данные метагеномного анализа образцов фитопланктона, собранных в 2024 г. Протестировано два подхода биоинформатической обработки, выбран эффективный и достоверный протокол. Получены результаты по двум маркерным регионам (V4 и V9 18SrRNA). В результате детального изучения 13 штаммов рода Psammodictyon выделенных из разных местообитаний (планктон, эпифитон, эпилитон) в прибрежной части Южно-Китайского моря описано 7 новых для науки видов. Psammodictyon – широко распространенный род морских диатомовых водорослей со сложной таксономией и недооцененным видовым разнообразием. Мы изучили мелкоклеточные формы длиной до 30 мкм. Основными дифференцирующими признаками были форма створки, плотность ареол и фибул, наличие гиалиновых областей и вздутий, строение порового аппарата. Филогенетический анализ показал, что Psammodictyon представляет собой близкородственную монофилетическую группу. На основании результатов детального морфологического анализа некоторых таксонов рода Cocconeis предложен новый род Monoalveoneis gen. nov. Новый род характеризуется особым типом альвеол, имеющих крупные удлинённые отверстия на внешней стороне створки и небольшие отверстия на внутренней. Предложен новый тип порового аппарата – моноальвеолла. Наш анализ литературных данных по таксонам рода Cocconeis показал, что по крайней мере 11 таксонов имеют сходную структуру альвеол с Cocconeis pellucida var. pellucida. В результате предложено 11 новых комбинаций, представители рода Cocconeis имеющие моноальвеолы перенсены в новый род Monoalveoneis. При помощи световой и сканирующей электронной микроскопии подробно изучена морфология 7 штаммов Schizostauron Grunow. Филогенетический анализ проведен на основе генов 18S rRNA и rbcL. Выявлена значительная вариабельность морфометрических признаков внутри штаммов. Длина/ширина клеток в культуре варьировала в 1,5–2,2 раза. Все изученные штаммы отнесены к одному морфотипу Schizostauron trachyderma. На филогенетическом дереве штаммы формируют отдельную ветвь отличную от представителей S. trachyderma и две подклады. При этом в результате сравнения морфологических признаков на основе световой и сканирующей микроскопии не выявлено ясных отличий от вида S. trachyderma. Таким образом, изученные штаммы можно отнести к двум криптическим видам S. trachyderma на основании молекулярных данных и местообитания. Получены результаты оценки копийности 18S рРНК для 7 штаммов диатомовых водорослей (данные получены в трех повторностях для каждого штамма), включая потенциально токсичный вид Pseudo-nitzschia и распространенные Psammodiction, Helicotheca tamesis. В настоящее время идет обработка данных и подготовка публикации.

Публикации