Аннотация результатов, полученных в 2024 году
Проект направлен на разработку гибридных флуоресцентных и ГКР сенсоров для мониторинга эффективности лекарственных препаратов, используемых в традиционной китайской медицине, а также исследования механизма действия этих препаратов для лечения последствий инсульта. В рамках проекта, были синтезированы ГКР-наносенсоры, представляющие из себя золотые наночастицы различной формы: сферической размером, сфероиды, наностержни и звездоподобные наночастицы. Спектры экстинкции синтезированых наночастиц были измерены на спектрофотометре. Для определения какой тип из синтезированных наночастиц более эффективен в качестве ГКР-зонда, были проведены измерения с использованием тестовой КР краски, родамина 6Ж. Наиболее эффективными оказались наночастицы нанозвед и наностержней. Коэффициент усиления для них составили 5.3×107 и 1.2×107 соответственно. Был разработан протокол и получены композитные наноструктуры, MoS2@Au с использованием лазерной абляции и фрагментации. Согласно данным ПЭМ, гибрид представляет собой чешуйки MoS2 длиной порядка микрон, которые декорированы частицами Au, размер которых варьируется в диапазоне 7-30 нм. Полученные НЧ были охарактеризованы с использованием линейной спектроскопии. Спектр MoS2@Au показывает полосы поглощения на 388 нм и 520 нм. Для оценки эффективности изготовленных наноструктур в качестве ГКР сенсоров была использована стандартная для КР активная краска родамин 6Ж. Для измерений использовался КР микроскоп, с длиной волны возбуждающего излучения 532 нм. Предел детектирования родамина на ГКР-сенсоре на основе MoS2@Au составил 10-8 М и коэффициент усиления 0.23×105. Используя метод лазерной абляции, были получены гибридные нано-зонды, обладающих одновременно флуоресцентными и ГКР свойствами. Было синтезировано несколько видов гибридных наночастиц ZnS:M (M=Cu, Ag, Au), представляющих собой НЧ ZnS с диаметрами 40-50 нм, декорированные наночастицами :М, с размерами 3-7 нм. Исследуемые наночастицы ZnS:M демонстрируют наличие экситонной полосы фотолюминесценции в диапазоне 400-500 нм, а также широкое плечо в диапазоне 600-700 нм связанное с рекомбинацией носителей, захваченных на поверхностные дефектные состояния, образованные в результате внедрения металлов в структуру наночастиц. Для демонстрации эффективности изготовленных наноструктур в качестве ГКР сенсоров была использована стандартная для КР активная краска родамин 6Ж. Лимит детектирования для изготовленных НЧ составлял 10-8 М. Был проведен анализ цитотоксичности изготовленных гибридных флуоресцентных и ГКР-активных зондов ZnS@Au, для определения возможности использования их в живых клетках. Клеточная выживаемость была измерена с использованием Alamar Blue. Измерения клеточной выживаемости показывают, что для здоровых клеток (фибробластов, L929) токсичность около 10% возникает только на максимальной концентрации (100 мкг/мл), для культуры рака яичника (SKOV-3) токсичность около 10% возникает уже на минимальной концентрации (0.098 мкг/мл), доходя примерно до 60% на максимальной (100 мкг/мл). Были проведены эксперименты по разработке подхода к усилению сигнала КР от срезов тканей мозга и срезов церебральных органоидов при помощи ГКР с лазерным возбуждением 633 и 785 нм. Вначале были получены тестовые КР-спектры от фиксированных коронарных срезов мозга мышей для определения характерных пиков КР. Эксперименты проводили на коронарных срезах мозга мышей линии C57BL/6 в возрасте 6-8 месяцев, приготовленных традиционным способом. Исследовали срезы мозга мышей, находящихся на нормальной диете и диете с повышенным содержанием жиров в течение 2 месяцев, что, предположительно, могло повлиять на белок-липидный состав клеток мозга. Было показано, что КР позволяет увидеть повышенное содержание липидов в срезах мозга мышей, находящихся на высоко-жировой диете. Наиболее интенсивные пики на спектре, связаны с колебаниями фенилаланинового остатка в белках, связей в липидах и пептидных связей в белках. Меньшей интенсивностью обладают пики с положениями максимумов холестерина, фосфатидилхолина, фосфолипиды в гош и транс-конфигурациях, колебания С-С, С-Н связей в липидах и белках, пептидной связи в белках. Сдвиг максимумов всех указанных пиков происходит при изменении белок-липидного окружения, появлении или исчезновения водородных связей, конформационных изменениях липидных структур и др. Были проведены измерения ГКР-спектров от срезов церебральных органоидов, помещенных на разработанные ГКР наноструктуры. Для ГКР-визуализации и пространственного распределения маркеров в клетке, были разработаны ГКР подложки. Подложки предварительно были протестированы на тестовых КР красителях, таких как Родамин 6Ж и кристаллический фиолетовый с концентрациями 10-7 м/л для обоих случаев. Измерения проводились для двух длин волн возбуждения 532 нм и 633 нм, Коэффициент усиления для подложек составил 1.7×105. Было проведено ГКР картирование срезов тканей и получено ГКР изображения с субклеточным разрешением в срезах тканей. Пространственное кодирование информации о местоположении РНК и захват мРНК in situ были выполнены для получения in situ данных пространственного транскриптома на уровне отдельных клеток на срезах образцов. Проводили картирование образцов и затем строили ГКР-карту с использованием лазера 633 нм, показывающую интенсивность сигнала ГКР от поверхности клеток органоидов. Полученные ГКР-карты сопоставляли с изображениями срезов органоидов, полученных путем гематоксилино-эозинового окрашивания клеток (окрашивание на ядра и цитоплазму интактных клеток) и с пространственно-распределенными результатами транскриптомного анализа мРНК в отдельных клетках среза органоида (single-cell transcriptomics). Было показано, что разработанные ГКР наноструктуры дают усиление от аминокислотных остатков фенилаланина и треонина мембран клеток церебральных органоидов. ГКР-карты, зарегистрированных от поверхности органоидов, показывают интенсивные и неоднородные по поверхности среза органоида сигналы ГКР, соответствующие неравномерному распределению белков с разным содержанием указанных аминокислотных остатков. Было показано, что полученные ГКР-карты можно сопоставлять с изображениями срезов органоидов после окрашивания гематоксилином и эозином, показывающими целые и поврежденные клетки, а также с результатами распределенного транскриптомного анализа мРНК в отдельных клетках. Такая “многоканальная” визуализация позволяет получать комплексную информацию от клеток: особенности конформации белков и липидов, микроокружения различных аминокислот, в частности, фенилаланина, с гистологическими особенностями клеток и клеточным транскриптомом, позволяющим оценить пул молекул мРНК, содержащихся в клетках. Такой методический подходя является крайне важным и перспективным для дальнейших исследований механизмов развития патологий в нервной системе.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
Проект направлен на разработку инновационных подходов к поиску новых лекарственных средств для лечения инсульта на основе компонентов традиционной китайской медицины (ТКМ) с использованием передовых методов биовизуализации и трехмерных моделей мозга (церебральных органоидов). В 2025 году (второй год выполнения проекта) научным коллективом были достигнуты значительные результаты в области разработки новых типов биосенсоров и их применения для анализа клеточных функций и скрининга биологически активных веществ. Ключевым достижением стала разработка и успешная оптимизация инновационных биосовместимых наноструктур с подходящими для морфологии клеток и органелл профилями для спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), обладающих эффектом "дальнодействия". В отличие от стандартных ГКР-сенсоров, разработанные структуры позволяют регистрировать молекулярные "отпечатки пальцев" на расстоянии ,более 10 нанометров от своей поверхности. Это открывает уникальную возможность для неинвазивного исследования процессов внутри живых клеток, в частности, в критически важных примембранных областях, без повреждения клетки. Так же была разработана новая стратегия создания высокопроизводительных ГКР-платформ для анализа одиночных клеток. Использование изогнутых поверхностей, в частности, реплик лепестков анютиных глазок, позволило получить материалы с уникальной многоуровневой архитектурой. Введен прогностический критерий — коэффициент сложности поверхности (α > 20), который определяет способность топографии к адгезии клеток. Синергия субмикронной сложности и клеточно-совместимых микронных полостей обеспечивает эффективную иммобилизацию эритроцитов и сильное взаимодействие с плазмонными наночастицами, что дополнительно усиливает ГКР-сигнал в 2–7 раз. Разработанный подход предлагает масштабируемый и экономичный путь для проектирования продвинутых биоинтерфейсов для клеточной диагностики. Вторым важным направлением стала разработка комплексной технологии мультимодальной визуализации на субклеточном уровне. Были созданы гибридные зонды, сочетающие флуоресцентные свойства и ГКР-активность, что позволяет одновременно отслеживать морфологию клеточных органелл (в частности, митохондрий) и анализировать их функциональное состояние, включая уровень активных форм кислорода и энергетических молекул (NAD+). На основе этих технологий была разработана методика скрининга активных соединений из лекарственных трав ТКМ (Salvia Miltiorrhizae и Chuanxiong Rhizoma), направленных на регуляцию функции митохондрий, повреждение которых играет ключевую роль в развитии инсульта. Значительным успехом стала валидация разработанных аналитических платформ на моделях церебральных органоидов. Коллективом было проведено масштабное исследование механизмов нейротоксичности, результаты которого опубликованы в престижном международном журнале Engineering (Q1). С помощью интегрированного анализа удалось расшифровать ключевой молекулярный механизм повреждения нейронов, связанный с гиперактивацией сигнального пути mTOR вследствие окислительного стресса и лизосомальной дисфункции. Это исследование подтвердило высокий потенциал использования церебральных органоидов для изучения сложных патологий мозга и поиска новых терапевтических мишеней. С использованием разработанной мультимодальной платформы было проведено детальное картирование здоровых клеток и клеток в состоянии моделируемого инсульта, выявлены ключевые биохимические изменения, происходящие при патологии. Полученные в отчетном периоде результаты вносят существенный вклад в развитие методов неинвазивной клеточной диагностики и создают современную высокотехнологичную базу для изучения механизмов действия и модернизации подходов традиционной китайской медицины в лечении социально значимых заболеваний, таких как инсульт.