Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В 2024 году в рамках выполнения проекта № 24-45-20007 разработан дизайн блока реотаксиса путем компьютерной симуляции динамики потоков и параметров, влияющих на эффективность отбора. Было предложено 5 архитектур, которые отражали различный механизм отбора клеток и были использованы для in silico моделирования с целью установления оптимальных значений скорости потока и геометрических параметров. Для одноканального типа было показано, что при использовании 2D модели различие в результатах при ламинарном течении и течении Стокса отсутствует, в то время как при использовании 3D модели оно составило около 200 мкм/с. В связи с этим в каналах проводили однофазное моделирование с ламинарным потоком. В блоках с более сложной архитектурой при моделировании однофазного и двухфазного потока выявлено расхождение в расчетной максимальной скорости, которая составила 50 мкм/с. Были подобраны для модели типа «Ловушка» скорость потока на входе (200 мкм/с) и давление в боковых резервуарах (50 Па), для модели типа «Диффузор» скорость потока с учетом оптимальной скорости сдвига в “зоне малого сдвига” (400 мкм/с), для модели типа «Лестница» скорости потока на входе для жидкости (30 мкм/с) и для сперматозоидов (7-8 мкм/с), а также оптимальные значения ширины основного канала, области реотаксиса и бокового канала. При моделировании движения сперматозоидов были установлены значения скорости сдвига в области реотаксиса в блоке типа «Ловушка» (5-10 1/с), «Лестница» (10-15 1/с) и показано, что сперматозоиды в блоке типа «Лестница» реориентируются быстрее (4-5 шагов), чем в блоке типа «Ловушка» (20-30 шагов). Был разработан дизайн прототипа блока платформы для оценки гиалуронидазной активности сперматозоидов и разработан протокола его формирования. Предварительно для повышения гидрофильности поверхности предложено покрытие полидиметилсилоксана (ПДМС), из которого изготовлен корпус блока, полиэтиленгликолем (ПЭГ). Показано, что подход “grafting to” обеспечивал снижение значения краевого угла смачивания до 38° на 4е сутки, но с устойчивой тенденцией к деградации покрытия; подход “grafting from” приводил же к получению более устойчивых покрытий, обеспечивающих значение краевого угла смачивания 17° в течение 3-4 недель. Методом ИК-спектроскопии были выявлены характеристические колебания в диапазонах 1200-1150 см-1 (С-О-С) и 2900-2850 см-1 (-О-СН3-), свидетельствующие о формирование слоя ПЭГ на поверхности ПДМС. Нанесение пленок гиалуроновой кислоты, необходимых для оценки гиалуронидазной активности, достигали 2 способами – дроп-коутинга и спин-коутинга. Второй способ показал большую эффективность и позволял сформировать сплошные пленки толщиной 1,1-1,45 мкм, характеризующиеся шероховатостью в сухом состоянии в диапазоне 376-386 нм. Определение ответа клеток на хемоаттрактанты было осуществлено в блоке хемотаксиса, созданного на основе микрофлюидных миксеров Y-формы, позволяющих формировать градиент концентраций веществ, с предварительным in silico моделированием их распределения в канале.При проведении in vitro экспериментов установлено, что введение 10 и 100 нМ прогестерона приводило к перемещению сперматозоидов в сторону канала с более высокой концентрацией хемоаттрактанта, что подтверждается данными трекинга движения сперматозоидов (67-75% подвижных сперматозоидов, достигших целевой области разделения демонстрировали перемещение по отношению к градиенту концентрации прогестерона). При использовании окситоцина в качестве хемоаттрактанта выявлена меньшая селективность перемещения сперматозоидов в целевую область (50-70% сперматозоидов, демонстрирующих смещение в сторону целевой зоны). При определении связываемости с гиалуроновой кислотой образцов эякулята установили, что без дополнительной сшивки сформированные пленки обладали высоким коэффициентом набухания. Введение агарозы в их состав позволило избежать значимого набухания и обеспечивало прикрепление клеток к поверхности. Была установлена функциональность и эффективность сортинга как здоровых, так и патологически измененных сперматозоидов с помощью разработанного прототипа блока при анализе донорского материала. При условии перфузии в блоке реотаксиса скорость сперматозоидов варьировалась между 3 – 16 мкм/с, что с учетом скорости потока в канале позволило определить полную скорость как 180-190 мкм/с. При анализе образцов эякулята, подвергшихся предварительному нагреванию до 37°С (контроль) и оставленных при 25° (сперматозоиды со сниженной способностью к реотаксису), установлено, что разработанный прототип блока позволял успешно осуществить отбор жизнеспособных подвижных клеток. В рамках разработки алгоритма применения разрабатываемой платформы были обучены и оценены две модели (YOLOv10nano и YOLOv8) для решения задачи по детекции сперматозоидов. YOLOv8 показала высокую точность и стабильное снижение функций потерь, что свидетельствует о её успешном обучении и способности к обобщению при использовании новых данных На основании полученных данных подготовлена и подана 1 статья в журнал, индексируемый в Scopus и Web of Science и относящийся к первому квартилю, которая находится на рассмотрении (under review). Результаты проекта были представлены на крупных всероссийских и международных мероприятиях (в частности, Международный конгресс по фундаментальной и клинической урологии и онкоурологии (Уфа, Россия), Congress on Reproductive Biomedicine (Тегеран, Иран). В 2025 году планируется сформировать оптимизированный блок реотаксиса и оценить его функциональность, а также установить влияние вязкости буфера на сепарирование спермы в нем; создать интегрированную из отдельных разработанных блоков единую систему и показать ее функциональность; установить эффективность сортинга мужских половых клеток с ее помощью в сравнении с стандартными тестами, применяемыми в клинике; создать базу данных изображений образцов эякулята, аннотированных в соответствии со стандартами Всемирной организации здравоохранения.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках реализации второго этапа проекта № 24-45-20007 был сформирован оптимизированный блок реотаксиса. Анализ его работы подтвердил способность к эффективному отбору сперматозоидов на основе их двигательной активности. Предварительное тестирование с микрочастицами позволило определить скорость потока в каналах – 76 ± 16 мкм/c. Автоматизированный анализ траекторий выявил увеличение кинематических параметров у клеток, достигших центрального выходного резервуара, по сравнению с исходным образцом. В частности, прямолинейная скорость (VSL) возросла до 37 мкм/с vs. 28 мкм/с в исходном образце (p < 0,001), а линейность траектории (LIN) увеличилась до 76 по сравнению с 64 (p < 0.001). Анализ выходной фракции показал, что доля прогрессивно-подвижных сперматозоидов увеличилась на 30% (p < 0,001), а морфологически нормальных форм по Крюгеру – на 5%. Было установлено влияние вязкости буфера на сепарирование спермы в блоке реотаксиса. Выявлено, что увеличение вязкости в средах с поливинилпирролидоном (ПВП) приводило к повышению средней скорости по траектории, а в средах с карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ) – к снижению. При увеличении концентрации ПВП наблюдали тенденцию к увеличению средней скорости по траектории (VAP) относительно контроля, в то время как изменение концентрации КМЦ не влияло. Анализ линейности траекторий (LIN) при разных концентрациях растворов показал значимый рост параметра при увеличении концентрации ПВП. При использовании 15% ПВП наблюдали наибольшее соотношение сперматозоидов с прогрессивным линейным движением по сравнению с другими буферами; сравнение морфологии клеток выявило статистически достоверное увеличение доли морфологически нормальных клеток. Разработанные ранее блоки были интегрированы в единую систему. Анализ кинематических параметров в режиме работы только блока реотаксиса выявил, что текущий уровень гидродинамического стимула обеспечивает лишь ограниченную селективность: VAP увеличился с 45± 3,9 до 45,8±3,7 мкм/с, прямолинейная скорость (VSL) – с 38,1±3,6 до 38,5± 3,1, при этом значения LIN совпадали до и после отбора. По данным морфологической оценки выявлено, что доля сперматозоидов с нормальной морфологией возросла на 12,4% после сортинга с помощью разработанной платформы. Комбинированный режим показал наибольшую интегральную эффективность относительно селекции клеток. Отмечен синергетический эффект, выразившийся в более высоких значениях характеристик VAP, VSL, LIN для отобранных сперматозоидов, превосходящих показатели отдельных блоков. Доля клеток, достигших выходного канала в этом режиме, оказалась наибольшей (75% vs 65% при реотаксисе и 45% при хемотаксисе). Данные, полученные в ходе эксперимента, хорошо согласуются с результатами моделирования. Установлена эффективность сортинга мужских половых клеток с помощью микрофлюидной платформы в сравнении с методами центрифугирования в градиенте плотности (ЦГП) и прямого всплытия. Выявлено, что все используемые методы позволяли получить фракции сперматозоидов с улучшенными показателями по сравнению с исходным образцом, в котором доля прогрессивно-подвижных сперматозоидов составила 20%, а морфологически нормальных форм 32%. В фракции сперматозоидов, вышедшей из микрофлюидной платформы, доля прогрессивно-подвижных сперматозоидов составила 58%, а морфологически нормальных форм 41%. Оценка восстановления клеточной популяции показала более высокий выход в традиционных методах (70% при ЦГП и 76% при прямом всплытии), тогда как разработанное устройство – 68%. Несмотря на умеренный количественный выход, микрофлюидная платформа обеспечивала выделение фракции с минимальным уровнем повреждений, наименьшим числом клеток с морфологическими дефектами и меньшей долей неподвижных сперматозоидов. Была создана комплексная база данных SPERM-MiCR, включающая три раздела: SPERM-MiCR-Static (оригинальные изображения), SPERM-MiCR-Upscaled (улучшенные версии изображений) и SPERM-MiCR-Dynamic (видео и траектории движения в микрофлюидной системе). Применение подхода с улучшением изображений показало, что он помогает извлекать дополнительные признаки из низкокачественных данных, но может приводить к переобучению на артефакты. Сглаживание траекторий снизило шум измерений на 40% без потери значимой кинематической информации. Расчётные параметры VAP, VSL, LIN и амплитуды бокового смещения головки (ALH) показали высокую корреляцию с ручной аннотацией экспертов (r > 0,85, p < 0,001). Предложенный метод классификации на основе временных рядов траекторий показал точность 82% в задаче разделения прогрессивных и непрогрессивных сперматозоидов, что превышает результат традиционного подхода (75%). Интеграция базы данных с MinIO показала высокую эффективность. В рамках реализации проекта в 2025 г. опубликовано 2 статьи в зарубежных журналах, входящих в первый квартиль (Q1), и 1 статья подана на рассмотрение. Результаты работы были представлены в форме устных и стендовых докладов на крупных научных мероприятиях. На следующем этапе будут адаптированы модели компьютерного зрения для анализа мужских половых клеток с использованием стека PyTorch и созданы воспроизводимые ML-пайплайны; установлена применимость разработанной платформы с целью анализа материала от здоровых добровольцев и пациентов с нарушениями сперматогенеза в клинических условиях и разработан протокол сортинга сперматозоидов с высокой оплодотворяющей способностью с ее помощью. Будет опубликовано не менее 6 статей в международных журналах, входящих в перечень научных изданий «Белого списка». Результаты исследования будут представлены и обсуждены на ключевых международных и национальных конференциях. Полученные результаты позволят разработать прототип системы отбора сперматозоидов с высокой оплодотворяющей способностью, которая в дальнейшем будет зарегистрирована как медицинское изделие, а также протокол ее использования, пригодный для дальнейшего внедрения в клиническую практику.