Мембранные белки очень важны для работы клеток человека. Они отвечают за такие процессы, как транспорт веществ и передача информации из клетки и в клетку, передача нервного импульса, восприятие света и различных химических веществ и многие другие. Около половины мишеней современных лекарств являются именно белками клеточных мембран. При этом, для поиска новых лекарств, очень важно понимать, как устроена мишень, какова её пространственная структура, а структура мембранных белков достаточно плохо изучена - в базе данных PDB (база пространственных структур белков) менее 10% записей относятся к белкам этого типа. Это связано с рядом экспериментальных трудностей, возникающих при работе с такими белками. В первую очередь с тем, что белок нужно поместить в некий аналог клеточной мембраны, при этом стандартные системы вроде гигантских липидных везикул (липосом) не подходят, поскольку ни один из трех основных методов исследования пространственной структуры макромолекул не может работать с такими объектами. Поэтому для нужд структурной биологии ученые разработали специальные мембраноподобные среды - мицеллы, бицеллы, нанодиски и амфиполы.
Картинка: мембраноподобные среды. Источник: ИБХ РАН
Все перечисленные среды в водном растворе могут образовывать частицы малого размера (радиусом от 2 до 6 нм), и каждая имеет свои преимущества и недостатки. Мицеллы - сферические частицы из молекул детергента, характеризуются самым малым размером, однако, меньше всего похожи на клеточную мембрану. Поверхность мицелл сильно изогнута, а детергенты взаимодействуют не только с внутримембранными частями белка, но и с теми участками, которые по идее должны находиться в водном растворе. Это приводит к потере активности белка, и, что самое неприятное, может поменять его пространственную укладку. Нанодиски - частицы, которые содержат участок липидной мембраны, окруженный поясом из специального белка MSP или полимера SMA (styrene maleic acid co-polymer). Среды на основе нанодисков очень близки по свойствам к мембранам клеток, но эти частицы имеют уже заметно больший размер (радиус от 4 нм). Бицеллы - дисковидные частицы, которые образуются в смесях липидов и детергентов, являются компромиссным вариантом, поскольку в теории содержат участок липидного бислоя. При этом размер частиц бицелл может варьироваться в широком диапазоне, начиная от 2.5 нм. Однако, до последнего времени было неясно, существует ли в действительности в бицеллах фрагмент мембраны.
В ИБХ РАН пространственные структуры мембранных белков исследуют в Лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии под руководством проф. Александра Арсеньева, используя один из мощнейших методов структурной биологии - спектроскопию ЯМР. Очевидно, что изучение мембраноподобных сред является неотъемлемым направлением этих исследований и им посвящено достаточно много усилий. Так, небольшой коллектив лаборатории (Гончарук С.А., Надеждин К.Д., Кот Э.Ф., Брагин П.Е., Бочарова О.В., Арсеньев А.С.) под руководством с.н.с. Константина Минеева в серии работ исследовал структуру и свойства бицелл, а также разработал новые составы, с помощью которых можно изучать мембранные белки с большими водорастворимыми доменами и отслеживать влияние состава мембраны на поведение мембранного белка. Стоит отметить, что исследовать частицы размером 2-4 нанометра не так уж и просто: их не видно даже в электронный микроскоп. Поэтому, ученые предложили использовать для этих целей коэффициенты диффузии, которые можно получить при помощи ЯМР. Эти коэффициенты достаточно просто конвертируются в радиусы частиц, для которых можно предположить теоретическую зависимость от соотношения липид/детергент. Соответствие экспериментальных параметров теоретическим и может являться критерием "правильности" бицелл. В качестве второго критерия было предложено отслеживать фазовые переходы липидов. Все липидные мембраны при определенной температуре переходят из "жидкого" жидкокристаллического состояния в "твердое" гелевое. Коллективу ученых удалось разработать метод детекции фазовых переходов в бицеллах, а также изучить зависимость температуры перехода от параметров изучаемых смесей. Как оказалось, даже самые маленькие частицы содержат участок липидного бислоя, который подвержен фазовым переходам. При этом многие параметры фазовых переходов в "настоящих" липидных бислоях полностью или частично воспроизводятся в бицеллах. Используя два указанных критерия ученые изучили сотни различных смесей липид/детергент и установили, какие составы можно использовать для того, чтобы изучать, как свойства мембраны влияют на свойства белка. В частности, удалось разработать методику для измерения энергии взаимодействия между мембранными белками в бицеллах. Используя данную методику, ученые смогли показать, как толщина мембраны влияет на образование димеров одного из рецепторов фактора роста эпителия (ErbB4).
Наконец, важной проблемой, с которой сталкиваются ученые при использовании бицелл, является способность детергентов нарушать структуру водорастворимых частей мембранных белков. Широко применяемые составы бицелл не подходят для изучения белков с крупными водорастворимыми доменами. Константин Минеев с коллегами предложили использовать для приготовления бицелл специальные сверхмягкие детергенты - сложные молекулы на основе холиевой кислоты под общим названием Facade (Рисунок 2). Как оказалось, эти детергенты способны формировать бицеллы высокого качества - с выраженными фазовыми переходами и идеальной зависимостью размера от состава смесей.
Работа ученых опубликована в пяти научных статьях и была поддержана грантом РНФ. Нобелевский лауреат по химии 2002 года Курт Вютрих во время своего визита в ИБХ РАН отдельно отметил важность данного исследования для структурной биологии. Коллектив получил широкий набор инструментов для изучения влияния состава мембраны на поведение мембранного белка, пригодных для различных физико-химических методов, а также разработал полный набор практических указаний для приготовления бицелл и работы с ними.
