Разработка методов моделирования ключевых аспектов патогенеза заболеваний человека в генетически модифицированных животных

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 17-75-20249

НазваниеРазработка методов моделирования ключевых аспектов патогенеза заболеваний человека в генетически модифицированных животных

Руководитель Дейкин Алексей Васильевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук , г Москва

Конкурс №24 - Конкурс 2017 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-102 - Патологическая анатомия, патологическая физиология

Ключевые слова Генетически модифицированные животные модели, атеросклероз, эпилептическая энцефалопатия, синдрома Леша-Найхана, геномное редактирование, точечные мутации, митохондриальный геном

Код ГРНТИ76.03.49

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Генно-модифицированные организмы — незаменимый инструмент для исследования функций генов и некодирующих последовательностей, взаимодействия регуляторных последовательностей в геноме и экспрессии рекомбинантных белков, а также для моделирования заболеваний человека. До недавнего времени получение генно-модифицированных животных являлось очень длительным и дорогостоящим, и потому практически недоступным для многих групп ученых, однако все изменилось с появлением новых систем редактирования генома. В 2013 г. была опубликована первая статья о применении системы CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9) — методики, позволяющей в один прием инактивировать несколько генов [1]. Открытие системы CRISPR/Cas9 произвело настоящую революцию в получении генно-модифицированных животных, сократив продолжительность экспериментов с нескольких лет до нескольких месяцев. С этого времени началась новая эра, в которую генетически-модифицированные организмы могут быть использованы не только учеными в дорогостоящих экспериментах, но и врачами при обнаружении новых генетических дефектов в своей практике. Система CRISPR/Cas9 включает РНК, содержащую регулярные кластеры коротких палиндромных повторов (CRISPR), транс-активирующую РНК и белок Cas9 (нуклеазу). Этот комплекс, который в природе выполняет роль иммунитета бактерий против паразитирующих на них фагов [2], был приспособлен для редактирования последовательности ДНК как in vitro, так и в клетках млекопитающих [3]. С помощью микроинъекций в пронуклеус зиготы комплекса РНК-гида с белком Сas9 уже были получены генно-модифицированные мыши [4, 5], крысы [5], обезьяны [6] и др. Нами было показано, что внесение как делеций, так и вставок происходит на мышиных эмбрионах с высокой эффективностью и высокой точностью [7]. Кроме того, мы выяснили, что помимо протяженных модификаций, данная система позволяет вносить однонуклеотидные замены (неопубликованные данные). В настоящее время, при обследовании больных, секвенирование генома и выявление новых мутаций носит зачастую аналитический характер и лишь в редких случаях помогает быстрее подобрать лекарственную терапию. Если бы существовала мышиная модель, повторяющая генетический дефект конкретного пациента, на ней можно было бы подбирать таргетную терапию, варьируя составы и дозы лекарственных препаратов, минимизируя побочные эффекты от неправильно подобранной комбинации и необратимого ухудшения состояния пациента. Кроме того, наличие мышиной модели позволит тестировать современные препараты, направленные на исправление генетического дефекта, а не последствий, которые развиваются у пациентов в результате его наличия. Такие эксперименты уже проводятся для других заболеваний, например, миодистрофии Дюшенна и хронической ишемии нижних конечностей [8, 9,12]. В данном проекте поставлена задача получить генетически модифицированные модели эпилептической энцефалопатии и синдрома Леша-Найхана, воспроизводящие генетический дефект конкретных пациентов, а также две модели атеросклероза, одна из которых за счёт большого числа ошибок при репликации в митохондриях (в т.ч. индуцируемых) позволит отобрать мышей с мутациями, ассоциированными с атеросклерозом у человека, другая позволит проверить гипотезу об участии сиалидаз в патогенезе атеросклероза. Альтернативной стратегией получения мутаций, ассоциированных с атеросклерозом, у контурных пациентов станет разработка технологии сайтспецифичного мутагенеза генома митохондрий за счёт доставки в митохондрии комплекса Cas9-sgRNA и матрицы для гомологичной рекомбинации по месту разрыва. Внесение точечных мутаций в ядерный и митохондриальный геном будет обеспечено за счет инъекции в зиготы мыши (в пронуклеус или в цитоплазму) системы на основе CRISPR/Cas9 (с одной или двумя целевыми sgRNA) и матрицы для репарации разрыва (в виде плазмидной ДНК, одноцепочечной ДНК, ДНК в комплексе с сигналом митохондриальной локализации) Достижимость поставленных задач обусловлена тем, что все они технически выполнимы в рамках современного уровня развития науки. Коллектив авторов обладает опытом создания более чем 120 линий трансгенных мышей, в т.ч. с использованием технологии CRISPR/Cas9, что подтверждается публикациями в ведущих журналах по специальности, успешным выполнением проектов РФФИ и РНФ, а также Гос. контрактов по соответствующей тематике. Препятствием к достижению поставленных целей при получении трёх новых моделей заболеваний может быть их летальность, что, с одной стороны, будет научным результатом, может быть задокументировано и опубликовано, а с другой при использовании современных подходов, таких как сайтспецифичное встраивание, целевой нокаут с анализом отсутствия мутаций в альтернативных сайтах технологически преодолимо и не вызовет затруднений при реализации проекта. Возможность получения поставленных результатов основана на владении авторским коллективом технологией создания генетически-модифицированных животных на самом современном уровне, наличии действующей лаборатории, постоянно выполняющей такие работы, полном соответствии материально-технической базы современному уровню науки и техники, масштабу задач проекта. В то же время авторский коллектив обладает необходимой компетенцией в области изучения молекулярно-генетических механизмов патогенеза модельных заболеваний, исследования животных-моделей и проявлений соответствующих патологий у человека. 1. Wang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013; 153(4):910–918. PubMed PMID: 23643243 2. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012; 337(6096):816–821. 3. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013; 339(6121):819–823. 4. Mashiko D, Fujihara Y, Satouh Y, Miyata H, Isotani A, Ikawa M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 2013; 3:3355. 5. Li D, Qiu Z, Shao Y, Chen Y, Guan Y, Liu M, Li Y, Gao N, Wang L, Lu X, Zhao Y, Liu M: Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol 2013, 31(8):681–683. 6. Niu Y, Shen B, Cui Y, Chen Y, Wang J, Wang L, Kang Y, Zhao X, Si W, Li W, Xiang AP, Zhou J, Guo X, Bi Y, Si C, Hu B, Dong G, Wang H, Zhou Z, Li T, Tan T, Pu X, Wang F, Ji S, Zhou Q, Huang X, Ji W, Sha J: Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell 2014, 156(4):836–843. 7. Димитриева Т.В., Решетов Д.А., Жерновков В.Е., Влодавец Д.В., Зотова Е.Д., Ермолкевич Т.Г., Дейкин А.В. Модификация метода анализа результатов редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 на предимплантационных эмбрионах мыши. Вестник Российского государственного медицинского университета. 2016. № 3. С. 16-22. 8. Jerry R Mendell and Louise R Rodino-Klapac: Duchenne muscular dystrophy: CRISPR/Cas9 treatment. Cell Research 2016, 26:513–514. doi:10.1038/cr.2016.28; 9. DE LOS ANGELES BEYTIA M, VRY J, KIRSCHNER J. Drug treatment of Duchenne muscular dystrophy: available evidence and perspectives. Acta Myologica. 2012;31(1):4-8. 10. Kadotani H, et al., Motor discoordination results from combined gene disruption of the NMDA receptor NR2A and NR2C subunits, but not from single disruption of the NR2A or NR2C subunit. J Neurosci. 1996 Dec 15;16(24):7859-67 11. Pierson, T. M., Yuan, H., Marsh, E. D., Fuentes-Fajardo, K., Adams, D. R., Markello, T., Gahl, W. A. (2014). GRIN2A mutation and early-onset epileptic encephalopathy: personalized therapy with memantine. Annals of Clinical and Translational Neurology, 1(3), 190–198. http://doi.org/10.1002/acn3.39 12. Бурлева Е.П., Бабушкина Ю.В. Применение препарата Неоваскулген для лечения больного с нейроишемической формой синдрома диабетической стопы Стр. 47-51 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27336333

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Калмыков В., Кусов П., Дейкин А. Bioinformatic analysis of a transgenic personalized murine model of Lesch-Nyhan syndrome FEBS OPEN BIO, Том: 8 Стр.: 458-459 (год публикации - 2018)
10.1002/2211-5463.12453

2. Kusov P., Kalmykov V., Deikin, A. Bioinformatic structural analysis of a transgenic personalized murine model of epileptic encephalopathy FEBS OPEN BIO, Том: 8 Стр.: 458-458 (год публикации - 2018)
10.1002/2211-5463.12453

3. Кубекина М., КУсов П., Калмыков В. Creation of a personified model of atherosclerosis in genetically modified mice FEBS OPEN BIO, Том: 8 Стр.: 458-458 (год публикации - 2018)

4. Сухоруков В., Калмыков В., Шарков А., Кусов П. Bioinformatics analysis of a transgenic personalized murine model of refractory epilepsy FEBS OPEN BIO, Том: 8 Стр.: 457-457 (год публикации - 2018)
10.1002/2211-5463.12453

5. Кубекина М.В., Калмыков В.А. Дейкин А.В. Орехов А.Н. Bioinformatics Analysis of Mitochondrial Mutations Associated With Atherosclerosis Global Heart, Volume 13, Issue 4, Pages 237-540 (год публикации - 2018)
10.1016/j.gheart.2018.09.062

6. Дейкин А., Орехов А. Development of methods for modeling key aspects of the pathogenesis of atherosclerosis in genetically modified animals ATHEROSCLEROSIS, V.275, p.: E114-E114 (год публикации - 2018)
10.1016/j.atherosclerosis.2018.06.320

7. Гланц В.Ю., Орехов А.Н., Дейкин А.В. Human Disease Modelling Techniques: Current Progress CURRENT MOLECULAR MEDICINE, Том: 18 Выпуск: 10 Стр.: 655-660 (год публикации - 2018)
10.2174/1566524019666190206204357

8. Калмыков В.А., Кусов П.А., Яблонская М.И., Коршунов Е.Н., Коршунова Д.С., Кубекина М.В., Силаева Ю.Ю., Дейкин А.В., Лукьянов Н.Е. New personalized genetic mouse model of Lesch-Nyhan syndrome for pharmacology and gene therapy Research Results in Pharmacology, 4(4):115-122 (год публикации - 2018)
10.3897/RRPHARMACOLOGY.4.32209

9. Волобуева А.С., Орехов А.Н., Дейкин А.В. An update on the tools for creating transgenic animal models of human diseases – focus on atherosclerosis Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 52(5): e8108 (год публикации - 2019)
10.1590/1414-431X20198108

10. Егорова Т.В., Зотова Е.Д., Решетов Д.А., Поликарпова А.В., Васильева С.Г., Влодавец Д.В., Гаврилов А.А., Ульянов С.В., Бухман В.Л., Дейкин А.В. CRISPR/Cas9-generated mouse model of Duchenne muscular dystrophy recapitulating a newly identified large 430 kb deletion in the human DMD gene Disease Models & Mechanisms, 25;12(4). pii: dmm037655 (год публикации - 2019)
10.1242/dmm.037655

11. Нинкина Н., Кухарский М.С., Хевитт М.М., Лысикова Е.А., Скуратовская Л.Н., Дейкин А.В., Бухман В.Л. Stem cells in human breast milk Human Cell, 2019 Apr 10. doi: 10.1007/s13577-019-00251-7. [Epub ahead of print] (год публикации - 2019)
10.1007/s13577-019-00251-7

12. Лысикова Е.А., Фуников С., Резвых А.П., Чапров К.Д., Кухарский М.С., Устюгов А., Дейкин А.В., Флямер И.М., Бойл С., Бачурин С.О., Нинкина Н., Бухман В.Л. Low Level of Expression of C-Terminally Truncated Human FUS Causes Extensive Changes in the Spinal Cord Transcriptome of Asymptomatic Transgenic Mice NEUROCHEMICAL RESEARCH, Том: 45 Выпуск: 5 Стр.: 1168-1179 (год публикации - 2020)
10.1007/s11064-020-02999-z

13. Мушенкова Н.В., Саммерхилл В.И., Силаева Ю.Ю., Дейкин А.В., Орехов А.Н. Modelling of atherosclerosis in genetically modified animals AMERICAN JOURNAL OF TRANSLATIONAL RESEARCH, Том: 11 Выпуск: 8 Стр.: 4614-4633 (год публикации - 2019)

14. Жунина О.А., Яббаров Н.Г., Орехов А.Н., Дейкин А.В. Modern approaches for modelling dystonia and Huntington's disease in vitro and in vivo INTERNATIONAL JOURNAL OF EXPERIMENTAL PATHOLOGY, Том: 100 Выпуск: 2 Стр.: 64-71 (год публикации - 2019)
10.1111/iep.12320

15. Солдатов В., Покровский М., Дейкин А. NEW SELECTIVE ARGINASE II INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF ATHEROSCLEROSIS, ENDOTHELIAL DYSFUNCTION AND HYPERTENSION ATHEROSCLEROSIS, Том: 287 Стр.: E267-E267 Аннотация к встрече: EAS19-0817 (год публикации - 2019)
10.1016/j.atherosclerosis.2019.06.825

16. Кусов П., Дейкин А. DEVELOPING NOVEL TRANSGENIC MICE MODEL OF ATHEROGENESIS WITH CONDITIONAL OXIDATIVE STRESS BY INTRODUCTION OF EPITHELIUM-SPECIFIC INDUCIBLE MITOCHONDRIAL POLG WITH MUTAGENIC ACTIVITY ATHEROSCLEROSIS, Том: 287 Стр.: E99-E99 Аннотация к встрече: EAS19-0737 (год публикации - 2019)
10.1016/j.atherosclerosis.2019.06.287

17. Дейкин А., Силаева Ю., Леонова Е. A NOVEL HYPOTHESIS: ERYTHROCYTE SENESCENCE PLAYS A KEY ROLE IN THE ATHEROSCLEROSIS DEVELOPMENT ATHEROSCLEROSIS, Том: 287 Стр.: E240-E241 Аннотация к встрече: EAS19-0800 (год публикации - 2019)
10.1016/j.atherosclerosis.2019.06.738

18. Кубекина М.В., Калмыков В.А., Кусов П.А., Силаева Ю.Ю., Дейкин А.В. Lesch-Nyhan syndrome: from patient to mouse model JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE, Том: 97 Стр.: 46-47 Приложение: 3 Аннотация к встрече: 223 (год публикации - 2019)
10.1093/jas/skz258.092

19. Позняк А.В., Силаева Ю.Ю., Орехов А.Н., Дейкин А.В. Animal models of human atherosclerosis: current progress Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 53(6): e9557 (год публикации - 2020)
10.1590/1414-431X20209557

20. Кубекина М., Силаева Ю. CREATING MUTATIONS ASSOCIATED WITH ATHEROSCLEROSIS BY CRISPR/CAS9 GENE EDITING SYSTEM OF THE MITOCHONDRIAL GENOME IN MICE ATHEROSCLEROSIS, Том: 287 Стр.: E266-E267 Аннотация к встрече: EAS19-0733 (год публикации - 2019)
10.1016/j.atherosclerosis.2019.06.824

21. Калмыков В., Виноградов К., Замкова М. Development Of Transgenic Mouse Model Superproducer Sealidase With Secretion Into The Blood ATHEROSCLEROSIS, Том: 287 Стр.: E240-E240 Аннотация к встрече: EAS19-0741 (год публикации - 2019)
10.1016/j.atherosclerosis.2019.06.737

22. Солдатов В.О., Кубекина М.В., Силаева Ю.Ю., Брутер А.В., Дейкин А.В. On the way from SARS-CoV-sensitive mice to murine COVID-19 model. Research Results in Pharmacology, 6(2): 1-7 (год публикации - 2020)
10.3897/rrpharmacology.6.53633

23. Дейкин А., Орехов А. DEVELOPMENT OF METHODS FOR MODELING KEY ASPECTS OF THE PATHOGENESIS OF ATHEROSCLEROSIS IN GENETICALLY MODIFIED ANIMALS Atherosclerosis (год публикации - 2018)

Публикации