Проект «Генетические технологии создания моделей заболеваний, обусловленных нарушениями функционирования РНК» идет второй год. Лаборатория генетических технологий для изучения функционирования РНК в норме и патологии, работа которой поддержана большим грантом РНФ, находится в МГУ. И это большой плюс, считает руководитель проекта академик Ольга Донцова.
«Университет – одна большая лаборатория, – говорит она. – Тут много молодежи, она на разных этапах участвует в проекте, от студентов младших курсов до аспирантов, молодых сотрудников, делающих свою карьеру в науке. Грант дает им возможность заниматься серьезными исследованиями. Очень хороший коллектив, очень талантливые молодые профессора».
Для того чтобы создать модель заболевания, необходимо понять механизм его развития – иными словами, выяснить, какие изменения на генетическом уровне обуславливают возникновение болезни. Исследования идут как на культурах клеток, так и на лабораторных животных. Используются самые современные методы редактирования генома. Среди них – инактивация и редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas9, внедрение генов с помощью транспозонов и лентивирусов. Заодно ученые проводят сравнительное исследование нескольких методов редактирования генома и оптимизируют их.
«Проект комплексный, – рассказывает Ольга Анатольевна. – Задачи, которые он решает, связаны как с моделированием заболеваний уже известной этиологии, так и с выявлением новых генетических детерминант и механизмов, лежащих в основе изменения гомеостаза клетки, которое вызывает патологию. Основным направлением исследований можно назвать изучение сплайсинга».
Сплайсинг (от английского to splice – «сшивать», «соединять») – это процесс «дозревания» молекул РНК в ядре клетки, в ходе которого нуклеотидные последовательности, не кодирующие белок (интроны), «вырезаются», а оставшиеся (экзоны), определяющие последовательность аминокислот в молекуле белка, соединяются. Таким образом незрелая молекула – предшественник матричной РНК (пре-мРНК) – превращается в зрелую мРНК, с которой считываются белки клетки.
Сплайсинг – очень непростой процесс. Он может проходить в разных вариантах. Например, тот или иной экзон по каким-то причинам порой пропускается, и тогда из одной исходной матричной РНК получаются молекулы РНК, которые транслируются в совершенно разные белки. Пока до конца неясно, чем управляется этот процесс, от чего зависит. А между тем он очень важен. Ведь изменение формы РНК меняет и функцию белка – иногда не очень сильно, но иногда – кардинально.
«Когда мы нарушаем процесс сплайсинга, появляются другие формы белка, и это может привести к возникновению разнообразных патологий, в том числе онкологии. Кстати, можно сказать, что старение – тоже следствие нарушения сплайсинга», – объясняет ученый.
Исследователи стремятся понять принципы, которыми регулируется процесс сплайсинга, и найти способы воздействия на него. Природных факторов, влияющих на этот процесс, немало. Наверное, читателю знакомо слово «эпигеномика» – направление генетики, изучающее модификации ДНК, которые могут определенным образом передаваться по наследству и воздействовать на структуру генома. Модификации РНК также стали предметом изучения отдельного направления – эпитранскриптомики. У этих модификаций разные функции, разная значимость, они бывают регуляторные и структурные… Но что интересно, полное их отсутствие тоже приводит к патологиям! Вся эта сложная система настроена на тонкую регуляцию различных процессов в клетке. В том числе и процессов сплайсинга. Молекулярная машина, которая осуществляет сплайсинг, называется сплайсосома. Изучение того, как она функционирует, – тоже одно из поднаправлений проекта.
Результаты, которые ученые получают на клетках, необходимо проверить на организмах. В рамках гранта развивается новое направление, связанное с редактированием генома мыши. Под эти задачи в университете создано целое подразделение. Уже бегают по клеткам лабораторного вивария разнообразные «нокаутные» мыши – в них нокаутированы, то есть выключены, не работают, гены определенных белков, и исследователи изучают эффекты от того или иного «выключения» – смотрят, что не так с этой мышью, какие патологии функционирования и поведения у нее возникают.
– Пока еще рано говорить о результатах, исследования не закончены, но эффекты получены очень интересные, неожиданные, – говорит Ольга Донцова. – То, что мы видим на клетках, транслировать на организм очень сложно, поэтому такие исследования необходимы. Для понимания причин развития патологии требуются фундаментальные исследования. Поиск способов воздействия на нее – прикладная составляющая нашей работы.
Один из методов, которым пользуются ученые, – биоинформатический анализ генетических структур. Что значит изучить последствия намеренного повреждения того или иного гена? Во-первых, надо доказать, что поврежден только этот и именно этот ген, никакие другие. То есть просеквенировать значимую часть генома вокруг него. А дальше изучать, что при этом происходит с РНК, какие интроны и экзоны появились… Чтобы со всем этим разобраться, требуются, во-первых, современные методы секвенирования, а во-вторых – специалисты-биоинформатики, которые умеют анализировать огромные массивы данных. Профессор Дмитрий Первушин из Сколтеха занимается исследованием возникновения разнообразных структур в РНК. Оказалось, что сплайсинг в определенных вариантах, для определенных матриц зависит от структуры РНК. В молекуле могут складываться альтернативные вторичные структуры, это приводит к включению разных экзонов.
Анализ геномов и последовательностей пре-мРНК, предсказание структур – это работа с очень большим объемом информации.
– Вся современная наука требует комплексного подхода, невозможно заниматься чем-то одним и не думать ни о чем другом, – напоминает академик Ольга Донцова. – Но человек не может в равной степени хорошо владеть всеми знаниями, накопленными мировым научным сообществом. Единственный способ делать исследование хорошего уровня – создавать коллаборации, объединять умения ученых из разных лабораторий. Соисполнители нашего гранта – научные коллективы из Сколково и МГУ.
В рамках этого проекта ученые сотрудничают также с ЗАО «БИОКАД», индустриальным партнером. По условиям гранта софинансирование со стороны промышленности привлекать не надо («И это очень хорошо, – отмечает руководитель проекта. – Сильные фирмы в области биотехнологий только начинают появляться в стране»). Но «БИОКАД» в проект вкладывается. Фирму интересует как раз возможность создания генно-инженерных мышей, на которых можно моделировать какие-то патологии и изучать возможные подходы к лечению. Как записано в аннотации к заявке, в работе, проводящейся совместно с фирмой «БИОКАД», с помощью инактивации гена фактора свертываемости крови IX будет создана модель гемофилии. Эту модель индустриальный партнер намерен использовать для разработки метода генной терапии этого заболевания.
Еще одно направление проекта связано с изучением эффективности синтеза белка в митохондриях, в этих энергетических станциях клетки. Повреждения в митохондриях приводят к различным заболеваниям: развиваются оптическая дистрофия, прогрессирующая энцефалопатия, периферическая нейропатия… Наконец, старение тоже можно рассматривать как болезнь, связанную с повреждением митохондрий: чем старше организм, тем более вероятны проблемы с «энергетическими станциями» клетки и тем меньше энергии на функционирование организма в целом или отдельных его органов. Создание моделей таких болезней у лабораторных животных позволит провести исследования механизмов развития патологий, связанных с повреждением митохондрий, и заложить основу для разработки генно-терапевтических препаратов.
Одна из угроз современного мира вызвана возникновением и закреплением антибиотикорезистентности бактерий. Иными словами, с тем, что бактерии все чаще перестают реагировать на антибиотики. Борьба с появившимися устойчивыми болезнетворными штаммами стала актуальнейшей задачей. В рамках проекта изучаются генетические механизмы развития устойчивости бактерий к антибиотикам.
Традиционный вопрос: что удалось благодаря этому гранту, что без него не получилось бы
– Без него бы вообще ничего не получилось, – отвечает руководитель проекта. – Грант позволил нам развивать новые научные направления. Речь не только о зарплате. Это еще и возможность купить нужные приборы, реактивы. Кстати, содержание мышей обходится очень дорого: нужны специальные клетки, стерильные условия, приборы.
