Новости

18 октября, 2018 10:55

Пол-иголки в стоге сена: новый экспресс-метод найдет ультрамалые концентрации низкомолекулярных веществ

Источник: Naked Science
Российские исследователи из Института общей физики им. А. М. Прохорова РАН и Московского физико-технического института разработали первый в мире ультрачувствительный метод быстрой детекции низкомолекулярных соединений. Он может использоваться для обнаружения следовых количеств токсинов, гормонов, витаминов и биологически активных малых молекул, важных для современной медицинской диагностики, контроля безопасности пищевых продуктов и многих других целей. Исследование опубликовано в журнале Analytica Chimica Acta.
Картинка: “Найти пол-иголки в стоге сена”. Источник: дизайнер @Lion_on_helium, пресс-служба МФТИ

Разработанный учеными иммунохимический анализ, основанный на магнитных метках, занимает менее 30 минут, но при этом в 100 раз чувствительнее иммуноферментного анализа (ИФА), применяющегося при стандартных лабораторных исследованиях. Эффективность подхода была продемонстрирована на примере измерения концентрации в плазме крови человека тироксина — одного из основных гормонов, используемых для мониторинга состояния щитовидной железы. Доступность и простота процедуры разработанной тест-системы позволяют проводить диагностику непосредственно на месте забора биоматериала.

Высокая чувствительность при детекции малых молекул необходима именно потому, что низкомолекулярные вещества зачастую оказывают сильное влияние на организм даже в небольших концентрациях. Сегодня для измерения концентраций таких соединений широко применяется иммуноферментный анализ. Он характеризуется высокой трудоемкостью и может проводиться только квалифицированным персоналом в специально оборудованных лабораториях. Для увеличения чувствительности при детекции гормонов щитовидной железы все еще используется радиоиммунный анализ, который основан на применении радиоактивных меток с малым временем полураспада и поэтому имеет существенные ограничения и потенциально небезопасен. Кроме того, традиционные методы требуют длительного времени пробоподготовки и наличия специализированного оборудования.

Существует еще и иммунохроматографический анализ (ИХА), используемый, например, в стандартных тестах на беременность. Он менее трудоемок, чем ИФА. Однако такой метод во многих странах одобрен только для получения пороговых результатов и случаев, не требующих высокой чувствительности анализа. Таким образом, одной из первостепенных задач в области медицинской диагностики является разработка быстрого и простого высокочувствительного метода детекции малых молекул.

Новая аналитическая система, созданная совместно учеными ИОФ РАН и МФТИ, представляет собой модификацию иммунохроматографического анализа с применением магнитных нанометок и бифункциональных лигандов. В качестве модели для изучения ее возможностей выбрали определение основного гормона щитовидной железы — тироксина, что сообщило работе и клиническую значимость.

Разработанный магнитный иммуноанализ реализован иначе, чем традиционные форматы ИХА (рис. 1). К сыворотке крови пациента, содержащей исследуемый свободный тироксин, добавляются антитела, помеченные магнитными наночастицами, и бифункциональный лиганд тироксина. Бифункциональный лиганд представляет собой молекулу тироксина, ковалентно связанную с биотином с помощью разделяющего их в пространстве «мостика». Антитела на магнитных наночастицах, таким образом, имеют возможность связывать как тироксин из сыворотки крови, так и бифункциональный лиганд.

Спустя некоторое время, дав молекулам в растворе возможность связаться друг с другом, его наносят на мембрану. В случае взаимодействия с бифункциональным лигандом частицы задерживаются на тестовой линии из стрептавидина, белка с сильным сродством к биотину. Фактор высокого сродства, а также высокочувствительный подсчет связавшихся с мембраной в результате реакции магнитных нанометок обеспечивают беспрецедентную чувствительность анализа. Достигнутый предел детекции гормона составил 16 фг/мл (или 20 фемтомоль/литр, что соответствует миллиону молекул в одном миллилитре раствора) в динамическом диапазоне 3 порядка.

Использованные оригинальные электронные приборы для считывания результатов анализа основаны на сверхчувствительном методе детекции магнитных наночастиц MPQ (англ. — magnetic particle quantification). Он базируется на явлении нелинейного перемагничивания частиц переменным магнитным полем на двух частотах и регистрации индукционного отклика на комбинаторных частотах.

Поясняет руководитель исследований и заведующий лабораторией ИОФ РАН Петр Никитин (выпускник МФТИ 1979 года): «Разработанные методы измерения концентраций низкомолекулярных веществ используют универсальные иммунохроматографические полоски со стрептавидином на распознающей линии, поэтому их нетрудно тиражировать. Многообразие возможных тестов на иные аналиты требует стандартных антител и специальных бифункциональных лигандов, синтез которых для разнообразных малых молекул — весьма непростая задача. К счастью, в нашем арсенале имеются ранее разработанные оригинальные интерферометрические методы и приборы, которые позволяют в режиме реального времени регистрировать динамику молекулярных взаимодействий. С помощью таких приборов были выбраны оптимальные иммунореагенты и бифункциональные лиганды „тироксин-биотин“, обеспечивающие за счет специальных пространственно разделяющих молекулярных „мостиков“ хорошую доступность обеих малых молекул для эффективного взаимодействия с двумя большими молекулами одновременно: с распознающим антителом и со стрептавидином. Это сэкономило много времени при разработке тестов и во многом способствовало успеху в работе».

Ведущий автор исследования Алексей Орлов, научный сотрудник ИОФ РАН и лаборатории нанобиотехнологий МФТИ, говорит: «Мы используем в качестве нанометок иммунохимических реакций магнитные частицы, которые регистрируются количественно с рекордно высокой чувствительностью со всего объема трехмерной реакционной зоны на тест-полоске с помощью портативного прибора, а не только с поверхности мембраны, как это происходит для оптических меток. Это обстоятельство, среди прочих упомянутых факторов, также обеспечивает простоту измерения ультранизких концентраций низкомолекулярных веществ в средах сложного состава, что отменяет необходимость в сложной пробоподготовке образцов и специально подготовленных специалистах для проведения уникальных по чувствительности анализов».

По словам первого автора статьи Сергея Знойко: «Разработанный анализ представляет собой экспресс-тест, обладающий характеристиками, значительно превосходящими характеристики существующих лабораторных диагностических систем. Дальнейшее расширение спектра биологических молекул, детектируемых подобным образом, позволит реализовать многопараметрический анализ сложных сред при значительном сокращении его стоимости».


Картинка: Схема предложенного метода детекции тироксина (обозначения: Т4 - тироксин, Т4-bit - бифункциональный лиганд тироксина с биотином, МP-Аб - антитела к биотину, меченные магнитными наночастицами). Источник: Пресс-служба МФТИ

Аспирантка МФТИ Наталия Гутенева, соавтор статьи, утверждает: «Этот подход простой, доступный, адаптируемый для детекции других малых молекул, и мы надеемся, что он сможет активно применяться для поиска новых маркеров заболеваний, в медицинской диагностике, экологическом мониторинге, контроле пищевой промышленности, биобезопасности и прочих жизненно важных отраслях».

Работа была поддержана Российским научным фондом.

21 февраля, 2024
«Метка-шпион» поможет ученым измерить температуру поверхности белковых молекул
Ученые Института инженерной физики и радиоэлектроники и Института фундаментальной биологии и биоте...
19 февраля, 2024
Физики показали, что форма контактов определяет фототок
Ученые из Центра фотоники и двумерных материалов МФТИ экспериментально реализовали новый подход к ...