Новости

22 июня, 2020 11:07

Предложен новый способ анализа вещества-индикатора старения и нарушений метаболизма

Ученые из МГУ совместно с коллегами предложили новый метод определения уровня НАД+ — соединения-индикатора биологического возраста человека и патологий его метаболических процессов. Недорогой набор химических реагентов и простота анализа помогут внедрить содержание НАД+ как параметр в клинической и исследовательской практике. Результаты работы опубликованы в Analytical Biochemistry. Исследования поддержаны грантом Российского научного фонда.
Принятые в современной науке изображения ФДГ и ее же со связанным НАД+, который надо определять современной медицине в крови пациентов. Показан переход между свободным ферментом (апо-форма) и тройным комплексом (холо-форма). Источник: один из авторов стат

Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) — важнейшее соединение, используемое для выработки энергии живыми организмами. В обмене веществ оно участвует в окислительно-восстановительных реакциях, то есть забирает электроны у одних молекул (окисляя их) и отдает другим (восстанавливая). Его форма, способная забирать электроны — НАД+ — также участвует в работе сигнальных систем клетки, позволяющих ей реагировать на внешние стимулы. Недавно обнаружены функции этого соединения, связанные с химическими модификациями белков. Изменения количества НАД+ в клетках в течение суток участвует в механизмах поддержания биологических часов — так называемых циркадных ритмов.

Работа биологических часов ухудшается в процессе старения, а ее нарушение ведет к различным заболеваниям. Поэтому уровень НАД+ можно использовать как один из маркеров, с помощью которых определяют биологический возраст организма, а также патологии метаболических процессов, включая развитие ожирения, некоторых болезней сердца, печени, нейродегенеративных заболеваний (например болезни Альцгеймера и Паркинсона), хронического воспаления и рака. Соответственно, содержание НАД+ может быть и индикатором эффективности фармакологических воздействий на данные состояния организма. Имея легкодоступные, быстрые и недорогие методики определения количества НАД+ в клетках, можно было бы использовать этот показатель в клинической и исследовательской практике. Однако существующие на сегодняшний день методы требуют не только сложного оборудования, но и высококвалифицированного персонала и дорогих расходных материалов, что ограничивает их применимость для клинических анализов и внедрение в практику.

В качестве альтернативного подхода сотрудники научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского МГУ с коллегами предложили использовать формиатдегидрогеназу (ФДГ) — фермент, который есть у микроорганизмов и растений. Он окисляет самую маленькую из органических кислот, муравьиную, передавая ее электроны на молекулу НАД+ в виде гидрид-иона — отрицательно заряженного иона водорода, содержащего «лишний» электрон. Таким образом НАД+ переходит из окисленной формы в восстановленную (обозначается как НАДН), которая способна флуоресцировать. Благодаря этому количество принявшего электроны НАД+ можно определить с помощью флуоресцентного анализа. В работе использовали так называемую рекомбинантную формиатдегидрогеназу — дополнительно доработанную с помощью методов белковой инженерии. По сравнению с природным ферментом она обладает более высокой температурной и химической стабильностью, а также не катализирует другие реакции. Такие свойства дают возможность использования ФДГ для определения НАД+ в сложных образцах биологических жидкостей, содержащих множество различных соединений. Исследователи предлагают создать коммерческий набор реагентов для таких ферментативных измерений НАД+, например, в крови. Анализы можно будет проводить на микропланшетных ридерах — относительно недорогих устройствах, широко используемых для диагностики, биотехнологий, ветеринарии и научных исследований. В аппарат помещают планшет со множеством лунок, что позволяет одновременно анализировать до нескольких сотен образцов.

Ученые считают, что предложенный метод способен значительно упростить и удешевить текущие методики измерения уровня НАД+, что может помочь внедрению их в клиническую и исследовательскую практику. Они успешно продемонстрировали свой метод для измерения уровня НАД+ в мозге крыс — ткани с высоким содержанием липидов, которые обычно сильно ухудшают эффективность анализа. Ткань мозга обрабатывали смесью метанола и уксусной кислоты, добавляли к экстракту генно-инженерную ФДГ, клонированную из термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha и зарегистрировали протекание каталитической реакции. В дополнение к анализам экстрактов цельной ткани мозга, НАД+ также измерили в экстрактах ее митохондрий.

«Имеющиеся у зарубежных производителей аналоги коммерческих наборов для измерения содержания НАД+ используют ферменты, обладающие рядом существенных недостатков, которые отсутствуют у использованной в нашей работе ФДГ из O. parapolymorpha. Помимо высокой эффективности и специфичности связывания НАД+, этот фермент обладает высокой физической и химической устойчивостью. Поэтому можно использовать одну партию препарата для измерения большого количества различных биологических образцов в течение длительного времени», — рассказала Виктория Буник, доктор химических наук, профессор факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М. В. Ломоносова и Первого МГМУ имени И. М. Сеченова.

Исследования проводились совместно с коллегами из группы генетической инженерии и дизайна белков кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова и лаборатории молекулярной инженерии ФИЦ Биотехнологии РАН (руководитель — профессор, доктор химических наук В. И. Тишков).

22 апреля, 2025
Химики научились точно предсказывать свойства «изменчивых» материалов
Ученые нашли способ точнее рассчитывать свойства полиморфных модификаций органических материалов —...
21 апреля, 2025
Труд важнее капитала: мобильность сотрудников может стать ключом к развитию арктических предприятий
Ученые определили, что фактор труда, а именно численность сотрудников, сильнее влияет на выручку к...