Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В 2014 году основное внимание работы по проекту было направлено на детализацию процессов ишемического и фармакологического кондиционирования и поиску агентов, обладающих цитопротекторным действием для сохранения органа или его частей, пораженных ишемическим инсультом. Для этого были выполнены следующие эксперименты и получены данные. 1. Показана высокая эффективность удаленного прекондиционирования конечностей, приводящая, как и через прекондиционирование почки, к уменьшению зоны повреждения экспериментального инсульта головного мозга и повышению нейромоторных функций мозга. Это подход позволяет осуществлять малозатратную подготовку мозга к плановой (хирургическое вмешательство) и внеплановой (ишемический или геморрагический инсульт, травма, вазоконстрикция, вызванная интоксикацией) ишемизации для уменьшения пагубных последствий ишемии. 2. Сделан анализ двух типов защитной внутриклеточной сигнализации: зависимого от активных форм кислорода и независимого от них. Особое внимание уделено высокой эффективности в нейро- и нефропротекции солям лития, которые можно рекомендовать для использования в клинической практике в острых фазах разных патологий ишемической природы. 3. Получены доводы в пользу рассмотрения ряда факторов (ишемия, травма, интоксикация, бактериальная или вирусная инвазия) как индукторов фенотипического проявления и внутриклеточных маркеров болезни Алцгеймера. Показано, что экспериментальная ишемия мозга, осуществленная за счет временной окклюзии среднемозговой артерии приводит со временем к потере способности к обучению и накоплению в мозге классических маркеров болезни Алцгеймера (гиперфосфорилированная форма тау-белка и амилоидный пептид бета АР-бета1-42). Таким образом, мы предполагаем, что эти патогенные воздействия могут служить моделями болезни Алцгеймера. Предполагается, что основным патогенным началом большинства мозговых патологий, включая болезнь Алцгеймера, является процесс гиперактивного воспалительного иммунного ответа. В логическим контексте с этим начаты работы по изучению роли митохондрий в воспалении, сопровождающем ишемическое повреждение мозга, пока сводящиеся к моделированию воспалительного ответа in vitro путем сокультивации разнородных клеток. 4. Учитывая, что состояние почек серьезным образом определяет степень повреждения структур и функций головного мозга, мы изучали патогенез почечных болезней: пиелонефрита и миоглобинурии. Так как миоглобинурия, как было обнаружено, сопровождается мощной генерацией активных форм кислорода, предпочтительно генерируемых в митохондриях, то предложено для лечения этого синдрома использовать антиоксидантную терапию. 5. Показана сопровождающий окислительный стресс активация в митохондриях металлопротеиназ, предположительно расщепляющих антиапоптотические белки, тем самым снижая эндогенный уровень защиты клетки. Предполагается участие в патогенезе рабдомиолиза продуктов деградации миоглобина. 6. Изучен механизм нейропротекторного действия производных грамицидина и сделан вывод о том, что это действие обусловлено ограниченным увеличением протонной проводимости внутренней митохондриальной мембраны.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В 2015 году работа шла по нескольким направлениям, включающих в себя как теоретическое обоснование проблем возникновения и протекания патологий, идущих с участие окислительного стресса, так и экспериментальное подтверждение наших предпосылок, причем конечным продуктом должна быть универсальная стратегия создания мер, предотвращающих повреждение мозговой и почечной ткани, вызываемое окислительным стрессом разного генеза. При рассмотрении патологий мозга в нашей стратегии защиты мозга от повреждения или его последствий мы рассматриваем равное важное значение всех клеточных компонентов головного мозга, включая как нейроны, так и астроглиальные клетки мозга, и эндотелиальные клетки сосудов мозга, и мы стремимся изучать целостную систему мозга, используя понятие нейроваскулярной единицы, которая включает эндотелий, астроглию и нейроны и именно повреждение этой единицы и ее защиту мы исследуем. Нам удалось создать модель неонатальной ишемии головного мозга за счет пережигания левой общей сонной артерии новорожденных крысят с последующим помещением их в гипоксическую камеру. В результате этого повреждение мозга у животных главным образом затрагивало сенсомоторную кору, стриатум и гиппокамп. Объем повреждений, морфометрически измерялся по Т2-взвешенным МР изображениям. Инъекции ингибиторов киназы гликогенсинтазы 3В - LiCl или вальпроевой кислоты сразу после индукции ишемии, снижали объем повреждения на 53 и 70% соответственно. В опытах по моделированию нейроваскулярной единицы путем комбинирования клеточных компонентов мозга показал, что культура клеток, полученных из коры головного мозга эмбрионов крыс, содержала преимущественно нейроны, положительно окрашивающиеся на бета-III тубулин и в небольшом количестве (менее 4%) астроциты (положительные на GFAP). Лишь 5% астроглиальной культуры не содержали GFAP, что говорили о преобладание в культуре астроглии. Ишемическое повреждение первичных культур в результате кислородно-глюкозной депривации приводило к значительной клеточной гибели (выживание клеток при этом в среднем составило 58.0±2.9% для нейронов, 62.0±2.7% для астроцитов и 52±12% для эндотелия). Вальпроат защищал нейроны от гибели после депривации, увеличивая жизнеспособность до 78.0±3.9% в концентрации 0.5 мМ и до 92±4.5% в концентрации 1 и 2 мМ. В то же время, LiCl не увеличивал жизнеспособность нейронов. Жизнеспособность астроцитов после кислородно-глюкозной депривации повышалась при преинкубации с LiCl в концентрациях 1 и 3 мМ, возрастая до 78±3 и 84.0±4.8% соответственно. Вальпроат обеспечивал защиту астроцитов от клеточной гибели на уровне 83-85%. Жизнеспособность эндотелиальных клеток после депривации при инкубировании клеток с LiCl также повышалась дозо-зависимым образом; при максимально эффективной концентрации 3 мМ количество погибших эндотелиоцитов снижалось более чем в 2 раза. Таким образом мы показали, что все клетки нейроваскулярной единицы чувствительны к ишемическому повреждению и в большинстве случаев ионы лития и вальпроат оказывали выраженное цитопротекторное действие, предотвращая гибель нейронов, астроцитов и эндотелия, хотя мы не выявили значимой защиты при действии соли лития на нейроны. В исследованиях механизмов повреждения головного мозга при ишемии мы использовали модель фокальной ишемии, вызванной окклюзией средней мозговой артерии взрослых животных. Была поставлена цель выявления биохимических различий в мозге при таком воздействии и при действии потенциальных протекторов. После окклюзии выявлялась выраженная зона повреждения, затрагивающая гипоталамус и амигдалу, примыкающих к территории мозга, питаемой данным сосудом. Хлорид или сукцинат лития заметно уменьшали зону повреждения на 48 ± 7% и 42 ± 17% соответственно. При этом соли лития значительно уменьшали набухание мозга. Что примечательно, введение солей лития даже через 3 часа после инсульта приводило к уменьшению зоны поражения и отека мозга. Кроме этого соли лития значительно уменьшали степень нейрологического дефицита (если нейрологическая активность контрольных крыс оценивалась в 14 баллов, то после ишемического повреждения она составляла только 2 балла, а после введения хлорида или сукцината лития нейрологический статус оценивался в среднем в 7 баллов, что говорило о частичном восстановлении активности мозга даже при использовании в периоде, отдаленном от времени наступления инсульта). Магнитно-резонансный спектроскопический анализ метаболитов мозга выявил резкие изменения после ишемического инсульта, проявляющиеся в накоплении в мозгу лактата и миоинозитола и уменьшении глутамата, холина и N-ацетиласпартата. Введение животным солей лития в большой мере восстанавливало уровень метаболитов до уровня, близкого к контролю. Мы промоделировали процесс вызванного ишемией закисления цитоплазмы клеток мозга путем искусственного снижения рН среды, в которой инкубировали митохондрии, выделенные из мозга крысы и отметили, что при переходе от рН 7,4 к 6,8 функциональные параметры митохондрий серьезно изменяются в направлении ухудшения биоэнергетики. Анализ выявил неправильное использование термина “лактатный ацидоз”, ибо теоретически гликолиз не может приводить к закислению цитозоля, учитывая биохимические реакции, лежащие в основе фосфорилирования и образования NADH. Мы делаем вывод, что регистрируемый ацидоз вызван снижением уровня АТР в клетке с параллельным увеличением АТР, что сопряжено с закислением. Таким образом, мы опровергает старую догму о "лактатном ацидозе", и предлагаем корректный механизм ацидоза в условиях ишемии. Это имеет не только чисто фундаментальное но и практическое значение, которое означает, что простое убирание лактата из системы не слишком повлияет на степень закисления цитозоля клеток мозга, а требуются иные меры, сопряженные с необходимостью уменьшения энергетических затрат в условиях возникновения патологии, сопряженной с ишемией. Используя высокочастотную ультразвуковую допплеровскую технику, мы исследовали состояние центральной и почечной гемодинамики после ишемии и реперфузии почки крысы. Через 1 мин после ишемии-реперфузии наблюдалось значительно уменьшение общего почечного кровотока (на 70% по сравнению со значениями до ишемии), уменьшение конечной диастолической скорости кровотока по почечной артерии (на 67% по сравнению со значениями до ишемии), увеличение индекса резистивности почечной артерии (0,76 до ишемии; 0,92 после ишемии-реперфузии). Ишемическое прекондиционирование почки (4 цикла по 5 мин ишемии и 5 мин реперфузии) полностью предотвращало изменения почечной гемодинамики, вызванные ишемией-реперфузией. Исследование венозного оттока показало высокую чувствительность почечного кровотока к коротким периодам ишемии. Мы обращаем особое внимание на морфофункциональное разнообразие митохондрий, которое взяли за основу концепции, на основании которой именно оно является частичной причиной возникновения патологий. В митохондриях, выделенных из почки, подверженной ишемии- реперфузии, выявлено увеличение функциональной гетерогенности популяции, оцененной по величине мембранного потенциала, который является золотым стандартом качества митохондрий, будучи нужным не только для производства АТР, но и при определении выбора между жизнью и смертью этой органеллы, хозяйской клетки, органа, а может быть и организма. Более того, популяции отличались по оптическим свойствам содержимого митохондрий, что соответствовало ультраструктурным данным. Таким образом, мы показываем, что окислительный стресс, сопряженный с процессом восстановления кровотока в орган, приводит к повреждению митохондрий и разделению их на по крайней мере две популяции. Отправной точкой нашей концепции является то, что патология определяется отклонением от нормального процента "плохих" (нефункциональных) клеток или митохондрий в сторону увеличения этого процента, причем существует резкий порог перехода от нормального к патологическому фенотипу в зависимость от этого процента. В процессе сегрегации митохондрий на "плохие" (мало функциональные) и "хорошие" (сохранившие полноту функций) ключевым является открытый нами в начале 80-х годов прошлого века процесс фрагментации митохондриального ретикулума с возможным отделением внутри одной митохондрии "плохого" (поврежденного) от "хорошего" (интактного) содержимого. Мы отчетливо видим в результате фрагментации образование двух популяций митохондрий, которые отличаются по ультраструктурной конфигурации. Разбор процесса фрагментации митохондриального ретикулума показал, что фрагментация - есть процесс, индуцируемый окислительным стрессом. Мы предполагаем, что популяция митохондрий с уменьшенным мембранным потенциалом должна утилизироваться, одновременно предполагая, что в условиях патологии, сопряженной с окислительным стрессом, повреждается и система утилизации митохондрий (митофагия). Был проведен анализ разницы в причинах, тяжести протекания заболеваний и смертности в зависимости от пола. Сделан вывод, что нельзя все различия свести к различиям и разнообразию, например, в половых гормонах - анализ показывает некоторое, но не абсолютное их влияние на толерантность к болезням и продолжительность жизни мужчин и женщин. В анализ введены часто выпадающие из рассмотрения элементы, такие как влияние Y хромосомы, или факт абсолютного наследования по женской линии митохондриальной ДНК, и мы делаем первые выводы, сводящиеся к важной роли митохондрий в проявлении этих различий.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Разработана и использована новая схема ультракороткого ишемического прекондиционирования почек крыс, направленная на защиту почки от ишемического повреждения у старых животных – беспородных белых крыс возрастом 1,5-2 года и 6-мес крыс линии OXYS, проявляющих признаки преждевременного старения. Показано, что ишемия почки приводит к полной остановке кровотока, а его восстановление приводит у молодых крыс (3 мес) к ослаблению кровотока по сравнению с доишемическим периодом, которое уменьшается, если до эпизода ишемии почку прекондиционировали. У старых животных кровоток мало изменялся в постишемическом эпизоде, а после прекондиции увеличивался, причем почечная недостаточность была как у молодых, так и у старых крыс. При этом, прекондиция улучшала функционирование почки только у молодых крыс, но не у старых или OXYS. Видимо именно этим объясняется гиперперфузия при прекондиции почек старых крыс – как способ в качестве защиты компенсаторно обеспечить увеличение кровотока в силу невозможности включить сигнальную систему индукции защиты. После ишемического воздействия уровень ацетилирования белков почки возрастает и нормализуется при прекондиционировании почки. У старых и OXYS крыс, прекондиционирование вызывало даже увеличение уровня ацетилирования, в результате чего сам процесс ацетилирования мы рассматриваем как патогенный фактор. При ишемическом повреждении аутофагия повышается и нормализуется при прекондиционировании. У OXYS в почке уровень ацетилирования белков стабилен и не отвечает на воздействия, что говорит об уменьшении или уничтожении ответа системы на окислительные вызовы, при этом система первичного ответа на повреждения, видимо присутствует, так как уровень убиквитирования и белка, способного осуществлять связь убиквитирования с наличием низкопотенциальных митохондрий, возрастает. Количество митохондрий с низкими значениями мембранного потенциала у старых и OXYS крыс возрастает. Эти данные свидетельствуют о том, что ишемия/реперфузия в основном затрагивают митохондрии, а именно из-за появления нефункциональных, неутилизованных митохондрий возникает патология. Накопление таких митохондрий приводит к почечной недостаточности. Проведен анализ механизма повреждения при старении биологической системы. Основой анализа стал открытый нами процесс фрагментации всей популяции митохондрий, вызванный разными веществами, среди которых большинство митохондриальных ингибиторов или физическими факторами, вызывающими окислительный стресс. Этот процесс расщепления приводил к образованию внутренних септ, разделяющих матрикс на отсеки с разными конфигурациями, означающими, что одна часть митохондриального отсека по всем признакам соответствует энергизованным митохондриям, а вторая часть частично, или полностью деэнергизована. Анализ причин такого несимметричного деления дал возможность сформулировать концепцию механизма выделения поврежденных структур в системе. Был поставлен вопрос: стареют ли митохондрии, и если да, то есть ли у этого процесса биологические часы. Для ответа на это вопрос мы обратились к бактериям, у которых было признано наличие процесса старения, ассоциирующийся с асимметрическим делением клеток. Предполагается, что митохондрии, являющиеся эволюционными предшественниками митохондрий, унаследовали такой же принцип асимметрии деления. Предложена концепция, в соответствии с которой вначале внутри митохондрии по разным причинам происходит повреждение структур, которые если не могут быть репарированы, образуют отдельный отсек, который потом фрагментируется от основного тела митохондрий и затем утилизуется. Для полного отражения состояния митохондриального хондриома были опробованы три подхода к анализу структурной организации митохондрий клеток в норме и при фрагментации, индуцированной окислительным стрессом. Выявлено, что наиболее информативным способом анализа является трехмерное реконструирование на основе серии конфокальных изображений по оси Z, однако с рядом ограничений возможно применение и более простых систем анализа, в том числе и по единичным двухмерным изображениям. Митохондриально-направленные антиоксиданты частично предотвращают структурные изменения в хондриоме при окислительном стрессе, что указывало на важность активных форм кислорода в этих изменениях. Учитывая, что активные формы кислорода играют также и ключевую роль в воспалении, на примере генерации воспалительного ответа при пиелонефрите в моделях in situ in vitro такая связь была оценена. При сокультивировании клеток почки, лейкоцитов и бактериального лизата в почечных клетках наблюдались провоспалительные изменения, сопровождаемые окислительным и нитрозильным стрессами и гибелью клеток, частично опосредованной сигнализацией через Toll-подобные рецепторы (TLR2 и TLR4). Активация этих рецепторов приводит к увеличению уровня окислительного стресса и синтеза провоспалительных цитокинов (TNFα, IL-6, IL-1α) в почечном эпителии, а блокада TLR4 – к снижению выраженности этих процессов. Повышение содержания IL-1α в ядрах сопровождается увеличением ацетилирования белков ядра, которое снижается до контрольных значений при обработке защитными агентами (Trolox, митохондриально-направленный антиоксидант SkQR1 и LiCl). Вероятно, уровень ацетилирования гистонов, регулируемый провоспалительным цитокином, в некоторой степени является маркером воспаления, которое опосредованно может быть снижено защитными агентами. Учитывая, что при ишемии ткани первыми на себя принимают гипоксический удар клетки эндотелия, выстилающего сосуды, в данной работе для оценки состояния эндотелиальных клеток сосудов почки после ишемии/реперфузии и их митохондрий использовали метод электронной микроскопии. Проанализирована возможность уменьшения степени тяжести этих изменений с помощью митохондриально-направленного антиоксиданта пластохиноил-децилродамина 19 (SkQR1). Показано, что 40 мин ишемии и 10 мин реперфузии почки приводит к выраженному изменению структуры митохондрий эндотелиоцитов, что сопровождается вазоконстрикцией сосудов почки, уменьшением почечного кровотока, повышением сопротивления сосудистого русла и увеличением количества циркулирующих в крови эндотелиальных клеток. Инъекция SkQR1 улучшает восстановление почечного кровотока и уменьшает сосудистое сопротивление почки в первые минуты реперфузии, а также снижает тяжесть почечной недостаточности и нормализует проницаемость сосудистого русла почки. В опытах in vitro SkQR1 защищал клетки эндотелия от гибели, спровоцированной кислородно-глюкозной депривацией. Сделан вывод, что дисфункция и гибель эндотелиоцитов играет важную роль в развитии реперфузионного повреждения почечной ткани. Результаты показывают, что основным патологическим началом в повреждении эндотелия является окислительный стресс и повреждение митохондрий эндотелиоцитов, поэтому митохондриально-направленные антиоксиданты могут служить эффективным инструментом защиты от негативных последствий ишемии. Так как не только митохондриально-направленные антиоксиданты, но и их производные, не обладающие антиоксидативной активностью, являются протекторами, было исследовано проникающее производное флуоресцеина на предмет защиты головного мозга от ишемического поражения, и было показано, что это производное обладало свойствами уменьшения последствий повреждения головного мозга при экспериментальной травме головного мозга, оцененными по размеру отека мозга и степенью неврологического дефицита.