Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Сформирована группа больных инвазивной карциномой неспецифического типа люминального A и B молекулярного подтипа (n=35, без предоперационной терапии). Изучен цитогенетический профиль различных морфологических структур опухолей молочной железы и их лимфогенных метастазов. Оценено распределение опухолевых стволовых клеток (ОСК) в различных морфологических структурах опухолей молочной железы. Хромосомные нарушения идентифицировали с помощью микроматричной сравнительной геномной гибридизации. В работе использовали свежезамороженные образцы операционного материала (n=3). Различные морфологические структуры: тубулярные, альвеолярные, трабекулярные, солидные структуры и дискретные группы опухолевых клеток получали из трёх участков трёх опухолей молочной железы (по пять типов структур из каждого участка опухоли) с помощью лазерной микродиссекции, клетки метастаза – из лимфоузлов с помощью макродиссекции. Микродиссектированный материал подвергали полногеномной амплификации, из макродиссектированных образцов выделяли ДНК. Полученные образцы ДНК (n=47) использовали для гибридизации с микроматрицами SurePrint G3 ISCA V2 CGH 8X60K (Agilent, США). Наличие ОСК определяли методом иммунофлюоресценции с помощью флюорохром-меченых моноклональных антител к цитокератину 19 (CK19, клон A53-B/A2.26, Alexa Fluor (R) 647, Novus Biologicals, США), CD44 (клон IM7, FITC, Abcam, США) и CD24 (клон SN3, Abcam, США). В работе использовали фиксированные образцы опухолевой ткани молочной железы (n=10). Показана значительная вариабельность хромосомных нарушений для различных типов морфологических структур. Различия в количестве и типе аберраций детектировались между разными типами структур. Морфологические структуры одного типа отличались по хромосомным нарушениям как в пределах разных регионов одной опухоли, так и между различными опухолями молочной железы. Не было идентифицировано специфических хромосомных нарушений для каждого типа структур. Кластеризация морфологических структур была уникальной для каждого из изученных случаев, зависела от опухолевого региона или не носила какой-либо закономерный характер. Филогенетический анализ также подтвердил либо локальную, либо хаотичную природу формирования различных морфологических структур. Цитогенетическая близость лимфогенного метастаза к какому-либо типу морфологических структур варьировала от случая к случаю. Процент ОСК различался между разными типами морфологических структур. ОСК преимущественно располагались в солидных и альвеолярных структурах и полностью отсутствовали в тубулярных структурах. Таким образом, в ходе проведенных работ было установлено, что формирование внутриопухолевой морфологической гетерогенности рака молочной железы не связано с клональной эволюцией опухолевых клеток, но может быть сопряжено с ОСК. Морфологические структуры, демонстрируя высокую вариабельность хромосомных нарушений в пределах одного типа, не являются специфическими субклонами (субпопуляциями) опухолевых клеток, но могут быть дифференцированными потомками ОСК.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Второй этап настоящего проекта был направлен на решение двух задач: 1) идентификация распределения опухолевых стволовых клеток (ОСК) в различных морфологических структурах (тубулярных, альвеолярных, солидных, трабекулярных и дискретных) опухолей молочной железы и 2) анализ транскриптома различных морфологических структурах опухолей молочной железы. Первая задача была решена с использованием конфокальной микроскопии (LSM 780 NLO, CarlZeiss, Германия) и применением антител к рецепторам CD44 и CD24 на основе фиксированных опухолевых образцов 36 больных инвазивной карциномой (неспецифического типа) молочной железы (IC NST) люминального А и B подтипов, не получавших предоперационного лечения. Вторая задача была реализована с использованием микроматричного экспрессионного анализа (HUMAN G3 v2 Kit 8x60k, Agilent, США) образцов РНК (n=18) из морфологических структур и клеток нормального эпителия молочной железы, полученных в ходе лазерной микродиссекции свежих образцов опухолевой и нормальной ткани трех пациенток с IC NST люминального В подтипа, не получавших предоперационного лечения. Экспрессия генов, вовлеченных в портрет химиорезистентности, инвазии и метастазирования морфологических структур, была валидирована с помощью ПЦР в морфологических структурах (n=39) других опухолей молочной железы (всего 7 случаев). Показано, что ОСК присутствуют в 87,8% случаев рака молочной железы. В 96% случаев ОСК обнаруживались в солидных структурах, в 75% - в альвеолярных, в 64% - в трабекулярных, в 36% - в тубулярных структурах и лишь в 32% - в дискретных группах опухолевых клеток. Процент содержания ОСК в разных структурах также различался от максимального в альвеолярных и солидных структурах (11,00-11,76) до минимального в дискретных группах опухолевых клеток (1,05). Экспрессионный анализ показал схожесть морфологических структур одного и того же типа друг с другом. При этом, для каждой структуры была идентифицирована гиперэкспрессия специфических генов с наибольшим количеством последних в дискретных группах опухолевых клеток. Более того, дискретные группы опухолевых клеток в значительной степени отличались от других структур по экспрессии генов и некодирующих последовательностей. На основе функционального аннотирования гиперэкспрессирующихся генов в разных структурах были сформированы три панели генов, вовлеченных в химиорезистентность, инвазию и метастазирование. Согласно этим данным выраженный фенотип химиорезистености был характерен для альвеолярных и трабекулярных структур, инвазивность – для трабекулярных структур и дискретных групп опухолевых клеток и метастатический портрет (от интравазации до колонизации органов) – для дискретных групп опухолевых клеток, что, вероятно, объясняет механистическую природу ранее обнаруженного нами вклада внутриопухолевой морфологической гетерогенности в эффективность химиотерапии и вероятность метастазирования рака молочной железы (Zavyalova et al. 2013b; Denisov et al. 2014). Таким образом, полученные результаты указывают на принадлежность различных морфологических структур опухолей молочной железы к функционально-обособленным популяциям опухолевых клеток, различающихся содержанием опухолевых стволовых клеток и демонстрирующих специфические портреты химиорезистентности, инвазии и метастазирования.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Заключительный этап настоящего проекта был направлен на решение трёх задач: 1) изучение пространственной организации различных морфологических структур в пределах опухолей молочной железы; 2) типирование опухолевого микроокружения различных морфологических структур и его вклад в метастазирование рака молочной железы и 3) анализ ассоциации внутриопухолевой морфологической гетерогенности рака молочной железы с клиническим течением и эффективностью химиотерапии данного заболевания. Первая и вторая задача были решены с использованием конфокального микроскопа LSM 780 NLO (Carl Zeiss, Германия) и применением антител к цитокератину 7, маркерам инвазивного роста (CD44 v.9, DOCK10, WAVE2 и uPA) и маркерам, специфичным к макрофагам (CD68, RS1) и фибробластам (aSMA, FAP). Для решения первой и второй задач использовались фиксированные опухолевые образцы 3 и 36 больных инвазивной карциномой (неспецифического типа) молочной железы (IC NST) люминального А и B подтипов, не получавших предоперационного лечения. Третья задача была выполнена с использованием двух групп больных IC NST, получавших химиотерапию (n=427) и без неё (n=249), и посредством изучения ассоциаций между наличием в опухоли различных морфологических структур и ответом на неоадъювантную химиотерапию (НАХТ), частотой лимфогенного метастазирования и безметастатической выживаемостью. Была подтверждена специфическая пространственная организация различных морфологических структур и описана дифференциальная экспрессия некоторых маркеров инвазивного роста, главным образом, имеющая место в солидных и трабекулярных структурах. Было показано, что ретракция более выражена в микроокружении солидных структур, а воспалительная инфильтрация – около дискретных групп опухолевых клеток. Макрофаги и фибробласты чаще обнаруживались в микроокружении солидных структур и реже около тубулярных структур. Наличие CD68+RS1+ макрофагов вокруг солидных и aSMA+FAP+ фибробластов около трабекулярных структур было ассоциировано с высокой частотой лимфогенного метастазирования у больных люминальным B HER2-негативным и HER2-позитивным IC NST, соответственно. Было установлено, что пациенты со значительным внутриопухолевым морфологическим разнообразием (3-5 структур) чаще демонстрируют плохой ответ на НАХТ и высокую частоту лимфогенного и гематогенного метастазирования. Дальнейший анализ показал, что с увеличением общего морфологического разнообразия увеличивалась встречаемость альвеолярных и трабекулярных структур. Оказалось, что наличие альвеолярных или трабекулярных структур в опухолях молочной железы как раз связано с плохим ответом на НАХТ. При этом данная ассоциация находилась в зависимости от схемы химиотерапии, статуса лимфогенного метастазирования и менопаузы пациенток. Кроме того, у больных без НАХТ наличие в опухолях альвеолярных и трабекулярных структур было связано с высокой частотой лимфогенного метастазирования. Тогда как у пациенток, получавших НАХТ, помимо указанных структур с локорегионарным процессом были связаны дискретные группы опухолевых клеток. В этой же группе больных, наличие альвеолярных и трабекулярных структур было ассоциировано с низкой безметастатической выживаемостью. Интересно, что ассоциация структур как с лимфогенным, так и гематогенным метастазированием зависела от эффекта неоадъювантной химиотерапии и менопаузы больных. По ассоциативным данным были поданы четыре заявки на патенты РФ, в которых представлены конкретные рекомендации по оценке морфологической гетерогенности IC NST в клинической практике с целью предсказания эффективности НАХТ и прогнозирования риска лимфогенного и гематогенного метастазирования. Таким образом, полученные результаты подтверждают функциональную обособленность различных морфологических структур в аспекте их пространственной организации, опухолевого микроокружения и влияния на клиническое течение рака молочной железы.