Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В проекте выполняется работа по изучению уникальной стехиометрии и пространственной организации суперкомплексов фотосинтетического аппарата тилакоидных мембран хлоропластов мутанта ячменя clo-f23613, который, как показали предварительные исследования, формирует два фенотипа с различным уровнем фотосинтеза и продуктивности. В 2014 г. успешно этаблирован ряд необходимых для выполнения проекта методик высокой сложности. Применительно к объектам исследования этаблированы методы изолирования фракций хлоропластных мембран и их последующего электрофоретического разделения, либо их анализа методами электронной микроскопии высокого разрешения. Этаблированы методы ПЦР в режиме реального времени и проведены рекогносцировочные эксперименты по локализации антенных белков на доменах гранальных мембран методом иммуноголд. Установлена специфичность антител к белку HvСАО ячменя (предоставленных группой M. Hansson, Carlsberg Laboratories, Дания; их специфичность ранее не проверялась), и показано, что у ячменя реализуется регуляция количеств белка САО по тому же принципу обратной связи, что и у Arabidopsis thaliana. Исследованы параметры фотосинтеза и флуоресценции хлорофилла у ячменя (дикий тип, низко- и высокопродуктивный фенотипы мутанта clo-f23613) и выявлен ряд характеристик, специфичных для высокопродуктивного фенотипа. Начата биоинформатическая обработка данных анализа транскрипционной активности обоих фенотипов мутанта и дикого типа, полученных в 2013 году с использованием чипов Affymetrix GenChip®Barley Genome Array, и выявлены гены-кандидаты, экспрессия которых, возможно, связана с развитием фенотипа мутанта clo-f23613.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В проекте выполняется работа по изучению уникальной стехиометрии и пространственной организации суперкомплексов фотосинтетического аппарата тилакоидных мембран хлоропластов мутанта ячменя clo-f23613, который, как показали наши предварительные исследования, формирует два фенотипа с различным уровнем фотосинтеза и продуктивности. В 2015 году проводились работы с использованием молекулярно-биологических и биоинформатических методов, а также ряда методик высокой сложности, этаблированных в 2014 г., таких, как выделение фрагментов гран и их анализ с помощью ТЭМ высокого разрешения; метод раздельного анализа фракций стромальных и гранальных тилакоидов с помощью нативного электрофореза; метод иммуноголд; оценка продукции различных форм АФК хлоропластами с помощью специфичных флуоресцентных красителей. Кроме того, в 2015 году мы дополнительно адаптировали к задачам проекта метод исследования латеральной подвижности интегральных белков и мембранных липидов гранальных мембран с помощью Fluorescence Recovery After Photobleaching и метод анализа содержания АБК с помощью жидкостной хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией (LS-MS). Часть работ была выполнена с помощью системы Dual-PAM 100 (Walz, Германия), позволяющей исследовать превращения энергии с участием обеих фотосистем. В отчетном году достигнуты значительные успехи в достижении целей проекта. Полученные результаты позволили выдвинуть предположение, что основные характеристики двух фенотипов мутанта обусловлены различиями в латеральной подвижности пигмент-белковых комплексов и пластохинонов в гранальных мембранах хлоропластов. Предположительно имеют место замедление диффузии пластохинона (компонента ЭТЦ фотосинтеза) и процессов репарации поврежденных компонентов фотосинтетического аппарата у низкопродуктивного фенотипа, и востановление этих процессов у высокопродуктивного фенотипа изучаемого мутанта ячменя clo-f23613. Таким образом, предположительно удалось выявить ключевой процесс, лежащий в основе низкой фотосинтетической продуктивности и высокого уровня фотоокислительного стресса изучаемого нами низкопродуктивного фенотипа мутанта ячменя clo-f23613 (и вероятно других мутантов, лишенных хлорофилла b), а также в основе восстановления фотосинтетической продуктивности и снижения фотоокислительного стресса у высокопродуктивного фенотипа clo-f23613. Подтверждено, что основной формой АФК, ответственной за фотоокислительный стресс в хлоропластах мутанта ячменя clo-f23613, является синглетный кислород. Выявлено, что хлоропласты с высокой способностью к выделению синглетного кислорода на свету присутствуют в листьях обоих фенотипов мутанта ячменя, но у высокопродуктивного фенотипа их доля снижена на фоне общего увеличения объема, занимаемого хлоропластами в клетке мезофилла. Эти закономерности вносят вклад в общее снижение фотоокислительного стресса и повышение фотосинтетической продуктивности у растений высокопродуктивного фенотипа. Выделены две перспективные для дальнейшего анализа группы генов: с первой группой (гены, экспрессия которых у высокопродуктивного фенотипа восстанавливается до уровня дикого типа) может быть связано формирование высокопродуктивного фенотипа из низкопродуктивного, а со второй группой (гены, экспрессия которых у обоих фенотипов мутанта в одинаковой степени отличается от дикого типа) могут быть связаны наблюдавшиеся в некоторых полевых сезонах ростовые и продукционные преимущества высокопродуктивного фенотипа по сравнению с диким типом. Изучение онтогенетической регуляции у мутантов chlorina Arabidopsis thaliana и ячменя (низкопродуктивный фенотип) продемонстрировало замедление процесса флоральной трансформации меристем мутантов. Сравнение частот плазмодесм в апикальных меристемах мутанта ячменя Clo-f23613 и дикого типа позволило предположить, что нарушения флоральной трансформации меристем мутантов вызваны нарушениями формирования плазмодесм в связи с повышенным уровнем синглетного кислорода в клетках этих растений.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В проекте выполняются работы, направленные на изучение уникальных механизмов, лежащих в основе повышения урожайности и устойчивости к световому и водному стрессам у высокопродуктивного фенотипа мутанта ячменя сlo-f23613 по сравнению с низкопродуктивной формой мутанта. В 2016 г. были выполнены исследования латеральной подвижности интегральных компонентов тилакоидных мембран мутантов chlorina в сравнении у двух пар модельных орагнизмов: ячменя (дикого типа и двух фенотипов мутанта) и арабидопсис (дикого типа и мутанта ch1-3 с мутацией, гомологичной мутации в основном объекте исследования по данному проекту – мутанте ячменя clof23613). Показано, что замедленная латеральная диффузия белков, без сомнения, выступает одним из механизмов снижения фотосинтетической продуктивности и развития фотоокислительного стресса в лишенных хлорофилла b мутантах chlorina, и, в частности, в низкопродуктивном фенотипе clo-f23613. На основе сравнения данных, полученных на ячмене, с данными по изменениям диффузии белков и липидов у мутантов арабидописа, было сделано заключение о том, что эффекты латеральной подвижности не всегда оказывают определяющее воздействие на процессы электронного транспорта у мутантов chlorina. В целом впервые было показано, что изменение структурных характеристик фотосинтетических комплексов влияет на параметры латеральной диффузии и является одним из важнейших механизмов восстановления фотосинтеза и снятия окислительного стресса у высокопродуктивного фенотипа clo-f23613. За отчетный период была проведена проверка гипотезы о роли размера пула пластохинонов в феномене восстановления высокой интенсивности процесса фотосинтеза у мутанта ячменя clo-f23613 и формирования высокопродуктивного фенотипа. В результате показано, что у мутанта с высокой продуктивностью эффективный перенос электронов от ФСII к ФСI восстановлен, причем не за счет увеличения общего пула этих молекул и не за счет снижения потока электронов от ФСII (размер функциональной антенны ФСII не изменяется), а, по-видимому, в связи с увеличением эффективности переноса электронов на последующих участках ЭТЦ. В 2016 г. были изучены уровни экспрессии генов-кандидатов из двух групп дифференциально экспрессирующихся генов (по результатам биоинформатической обработки данных микроэрреев 2015 года), предположительно ответственных за развитие высокопродуктивного фенотипа мутанта clo-f23613 из низкопродуктивного. Результаты количественной ПЦР подтвердили направленность изменений в уровнях экспрессии отобранной группы генов. В 2016 г. показан важнейший механизм восстановления водного режима и засухоустойчивости у высокопродуктивного фенотипа мутанта. Выявлено, что регуляция степени закрытия устьиц (в ответ на водный дефицит) в листьях высокопродуктивного фенотипа восстановлена за счет конститутивно увеличенного уровня биосинтеза абсцизовой кислоты (АБК) и снижения уровня образования активных форм кислорода (АФК) на свету. Кроме того, оказалось, что восстановление чувствительности к физиологическим концентрациям эндогенной АБК у высокопродуктивного фенотипа связано с падением уровня экспрессии гена 1-ACCOx, что приводит к снижению образования этилена и снятию блокировки закрытия устьиц. Известно, что закладка и созревание сельскохозяйственно ценных органов культурных растений во многом зависят от времени перехода растений к цветению и сроков инициации программы старения. В 2016 г. была исследована взаимосвязь между восстановлением сроков перехода к цветению у высокопродуктивного фенотипа clo-f23613 (выявленная нами ранее), изменением экспрессии генов-регуляторов онтогенеза (флоригена, гена раннего старения, нескольких маркеров стресса) и количеством плазмодесм в листьях и меристемах как мерой потенциальной емкости и функциональной активности симпластного пути распространения продуктов генов-регуляторов онтогенеза. Получены серьезные данные в пользу предположения о том, что механизмом, вызывающим задержку цветения мутантов chlorina, является увеличение количества плазмодесм между клетками мезофилла листа, что влечет за собой нарушения транспорта регуляторных молекул, участвующих в регуляции цветения. В совокупности, полученные по этому разделу результаты подтверждают предположение о роли стабилизации пигмент-белковых комплексов хлоропластов хлорофиллом b в регуляции онтогенеза высших растений. Дальнейшая разработка этой гипотезы может открыть принципиально новые пути регуляции фотосинтетической продуктивности высших растений. Таким образом, в 2016 году были завершены исследования по всем основным направлениям, намеченным в рамках проекта. Полученные результаты обработаны и обобщены, по итогам выполнения проекта подготовлено и сдано в печать шесть статей.