КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-24-00118

НазваниеМолекулярные технологии управления нейросигнализацией

РуководительКозлов Сергей Александрович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016 

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований коллективами существующих научных лабораторий (кафедр)»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаНервная система, нейросигнализация, нейрорецепторы, ионные каналы, лиганды, лиганд-рецепторные взаимодействия, молекулярная поверхность, взаимосвязь “структура-функция”, пептиды, нейротоксины, мутагенез, рациональный дизайн

Код ГРНТИ34.39.15


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В основе всех физиологических процессов, в том числе функционирования нервной системы, лежит меж- и внутриклеточная сигнализация. В межклеточной сигнализации важным шагом является восприятие внешнего сигнала, например, поступивших на поверхность клетки соединений (лигандов) с помощью специальных мембранных белков (рецепторов). Взаимодействие лиганда с рецептором вызывает серию конформационных перестроек последнего, в результате которых в клетке запускаются различные сигнальные каскады, ведущие в итоге к тому или иному физиологическому ответу. Связывание лиганда с белком-рецептором является первым и очень важным шагом. Управляя этой начальной стадией, можно повлиять на физиологический ответ – активировать его или затормозить. Несмотря на впечатляющее разнообразие структуры и функции мембранных рецепторов, начальная стадия распознавания ими своих специфичных лигандов определяется сравнительно небольшим набором факторов: особенностями пространственной организации, физико-химическими свойствами молекул-партнеров и их окружения, а также динамикой системы. Чтобы раскрыть молекулярные механизмы лиганд-рецепторного узнавания, необходимо выявить и количественно оценить указанные параметры. Таким образом, в настоящее время появляется возможность унификации рассматриваемого многообразия явлений, вне зависимости от конкретной биологической природы изучаемых молекул. Важнейшими характеристиками, играющими ключевую роль в процессе межмолекулярного взаимодействия, обладает поверхность молекул. Именно комплементарность локальных свойств поверхности часто является движущей силой образования комплекса. В настоящем проекте мы предлагаем разработать оригинальный метод анализа сложных молекулярных комплексов, основанный на расчете, картировании и визуализации различных физико-химических свойств поверхности рецепторов и связывающихся с ними лигандов. Важно, что создаваемая физическая модель не является статичной, она описывает процесс распознавания лигандов рецепторами на основе расшифровки и взаимной адаптации их динамических молекулярных «портретов». В качестве объектов исследования нами выбраны рецепторные системы, участвующие в формировании и передаче сигналов в нервной системе и представляющие разнообразные типы пространственной организации и способа активации: потенциал-зависимые калиевые и натриевые каналы, никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, терморецепторы и кислото-чувствительные ионные каналы. Эти рецепторы (а) являются важными фармакологическими мишенями для разработки новых терапевтических агентов и (б) имеют специфичные лиганды пептидной природы, наиболее подходящие для исследования комплементарных взаимодействий с рецептором. Кроме того, (в) имеются данные о пространственной структуре указанных рецепторов и/или их лигандов, и (г) в коллективе заявителя разработаны эффективные системы для их изучения. Реализация проекта будет включать следующие основные этапы. (1) Для каждого из указанных типов рецепторных систем характерно широкое разнообразие известных и хорошо охарактеризованных лигандов. Необходима систематизация накопленных данных, которая позволит (2) провести надежный анализ взаимосвязи структура-функция для лигандов каждого типа рецепторов и предложить рабочую модель лиганд-рецепторного узнавания. (3) Проверка моделей будет осуществлена рациональным проектированием новых лигандов с заданным профилем специфичности. Кроме того, (4) будет проведен широкомасштабный скрининг активности известных соединений в отношении указанных рецепторов, а его результаты сопоставлены с моделями. В результате (5) будет выработан универсальный метод анализа систем лиганд-рецептор и (6) получен целый арсенал специфичных лигандов для управления нейросигнализацией. Актуальность проекта обусловлена двумя обстоятельствами. (а) Мембранные рецепторы служат мишенями множества лекарственных соединений, и их разработка ведется с учетом принципов лиганд-рецепторного взаимодействия. Новый метод позволит существенно улучшить эффективность разработки лекарств. (б) Современные исследования организации нервной системы на молекулярном уровне немыслимо без эффективных инструментов – специфичных лигандов нейрорецепторов. Проект направлен на получение такого инструментария. Научная новизна проекта состоит в использовании абсолютно новой методики компьютерного моделирования, а также в том, что с использованием расчетных и экспериментальных методов будет исследовано взаимодействие широкого круга имеющихся лигандов со всеми анализируемыми рецепторными мишенями. Будут выявлены универсальные механизмы распознавания молекулярных поверхностей, и как следствие, будет реализована возможность направленного воздействия на процессы нейросигнализации.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут получены и охарактеризованы новые соединения, способные направленно регулировать работу фармакологически важных клеточных рецепторов и ионных каналов. Основой исследовательской стратегии станет совместное использование данных биохимических экспериментов и биофизического моделирования, объясняющих общие принципы лиганд-рецепторного взаимодействия. Для этого: 1. Будет исследована перекрестная активность нескольких известных групп природных лигандов по отношению к нейрональным рецепторам различных структурных классов и функциональных (под)типов. 2. Будет разработан метод структурно-функционального анализа биологически активных пептидов (модуляторов сигнальных систем клетки), позволяющий с помощью компьютерных алгоритмов выявлять молекулярные детерминанты биологической активности и специфичного действия. Заявленные результаты позволят на основе пептидов с известной пространственной укладкой проводить рациональный дизайн соединений с новыми функциями и компьютерный поиск новых биологических функций у уже известных соединений. Такие найденные или вновь созданные молекулы станут новыми инструментами изучения рецепторных систем клеточной мембраны и, следовательно, основой инструментария для управления нейросигнализацией и создания лекарственных средств нового поколения.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Проект посвящен разработке оригинальных методов анализа сложных молекулярных комплексов, в частности фармакологических значимых ионных каналов и рецепторов, механизмы функционирования которых лежат в основе процессов нейросигнализации. В ходе выполнения проекта: 1. Построены предварительные модели пространственной структуры потенциал-чувствительных натриевых каналов человека Nav1.2 и Nav1.4, а также модели лиганд-связывающего домена альфа7-никотинового ацетилхолинового рецептора, выявлены конформационные состояния рецепторов, участвующие в образовании сайта связывания с пептидными лигандами. 2. Экспериментально на примере модельной системы белка альфа-актинин показана применимость создаваемых расчетных подходов для предсказания структуры комплексов белок-лиганд. 3. Проведена разработка методики «белковой топографии» пептидных молекул. Метод применен для рационального дизайна лигандов ацетилхолиновых никотиновых рецепторов типа α7, а также ингибиторов потенциал-чувствительных натриевых каналов. 4. Созданы и проанализированы базы данных известных специфичных полипептидных нейромодуляторов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, потенциал-зависимых натриевых каналов, а также блокаторов калиевых каналов, выделенных из скорпионов. 5. Проведен первичный скрининг части коллекции природных ядов – комбинатоных библиотек биологически-активных молекул, на «нетрадиционные» для них мишени, имеющиеся в коллективе исполнителя, определены объекты для дальнейшего фракционирования и выделения активных компонентов. 6. По результатам первого года опубликовано 2 статьи в журналах, индексируемых Web of Science (Сеll, Biochimie), 2 статьи в русскоязычных изданиях, индексируемых РИНЦ (Природа, ДАН - статья принята в печать).

 

Публикации

1. Ribeiro Ede A Jr, Pinotsis N, Ghisleni A, Salmazo A, Konarev PV, Kostan J, Sjöblom B, Schreiner C, Polyansky AA, Gkougkoulia EA, Holt MR, Aachmann FL, Zagrović B, Bordignon E, Pirker KF, Svergun DI, Gautel M, Djinović-Carugo K. The Structure and Regulation of Human Muscle α-Actinin. Cell, 159(6):1447-1460 (год публикации - 2014).

2. Кашеверов И.Е., Кудрявцев Д.С., Иванов И.А., Жмак М.Н., Чугунов А.О., Табакмахер В.М., Зелепуга Е.А., Ефремов Р.Г., Цетлин В.И. Рациональное конструирование новых лигандов никотиновых рецепторов на основе альфа-конотоксина PnIA. Доклады Академии Наук, том 461, № 4, с. 476–479 (год публикации - 2015).

3. Плужников К.А., Козлов С.А. Василевский А.А., Воронцова О.В., Феофанов А.В., Гришин Е.В. Linear antimicrobial peptides from Ectatomma quadridens ant venom Biochimie, 107:211-215 (год публикации - 2014).

4. Чугунов АО, Ефремов РГ Поверхность молекулы - источник биологической информации Природа, 10: 3-10 (год публикации - 2014).


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
1. Создана библиотека программных модулей SOMBRERO на языке Python. Библиотека включает многочисленные типовые модули, необходимые для решения повседневных задач структурной биоинформатики. Частью данной библиотеки является набор модулей, позволяющих производить картирование согласно принципам, заложенным в методе белковой топографии. 2. Проведена серия расчетов МД канала TRPV1 в мембране из различных стартовых состояний (открытого/закрытого), при разных температурах (от 280 до 340 K), в присутствии или отсутствии ионов Ca2+ (суммарная длительность траекторий >10 мкс). Для этого была реконструирована внеклеточная петля III и собран фосфолипидно-холестериновый бислой, имитирующий мембрану нейронов. Специально разработанные методы анализа данных МД позволили выявить события открывания канала и найти предположительный механизм температурной чувствительности. 3. Построены 3D модели потенциал-чувствительных калиевых каналов Kv1.1–1.3, а также предварительные модели комплексов с пептидными блокаторами. Подготовлена база данных, содержащая информацию об активности почти 250 пептидов по отношению к различным изоформам калиевых каналов, выделены группы строго специфичного действия. 4. Экспериментально подтверждена гипотеза о важном значении свойств (гидрофильности и подвижности) т.н. «модуля селективности» альфа-токсинов скорпионов для их избирательности в отношении различных натриевых каналов. 5. Проведено сравнение активности и специфичности новых аналогов альфа-конотоксина PnIA. 6. Проведены работы по поиску и характеристике новых лигандов нАХР, ГАМК А рецептора, каналов ASIC, TRP-рецепторов, кальциевых каналов: - открыты альфа7 нАХР-агонистические свойства 6-бромогипафорина, - в экстракте чабреца обнаружены новые лиганды ГАМК А рецептора, - впервые обнаружены свойства ингибиторов ГАМК А рецептора у нескольких трехпетельных токсинов из ядов змей, - в ядах змей обнаружены белки, которые по своим характеристикам схожи с белками, подобными лектинам С-типа (БЛСТ), и обладают способностью блокировать ток, индуцированный АХ в идентифицированных нейронах L. stagnalis (IC50 от 200 до 350 мкг/мл). - проанализирована активность химического аналога севанола, его стереоизомеров и молекулы-предшественника в электрофизиологическом тесте на канал ASIC3, показана значимость функциональных групп и пространственной конфигурации севанола для его биологической активности, - Проведено исследование активности нового полипептидного модулятора TRPV1 рецепторов – АРНС2, выделенного из анемоны Heteractis crispa, показаноо что, АРНС2 обладает анальгетическими свойствами, не нарушает нормальной двигательной активности и не изменяет температуру тела экспериментальных животных, что имеет большую практическую ценность для создания эффективных анальгетиков нового поколения. - проведено исследование фармакофора пептида Ugr9-1, выделенного из яда морской анемоны Urticina grebelnyi, установлены аминокислотные остатки, играющие основную роль в ингибированиии канала ASIC3. - Выделен и охарактеризован новый дисульфид-содержащий полипептидный токсин из яда паука Tibellus oblongus – специфичный блокатор пресинаптических Са-каналов несекомых. Также отработан метод быстрого скрининга молекул, активных на альфа7 и мышечном нАХР, на основе детекции изменений концентрации ионов цитоплазматического кальция. Разработана методика тестирования на животных веществ - модуляторов активности рецептора TRPA1, что дает возможность на основе этой биомодели изучать активность новых противовоспалительных и анальгетических препаратов. По результатам 2 лет выполнения проекта опубликовано - 1 монография, 14 статей, их них в журналах, индексируемых Web of Science - 12, в русскоязычных изданиях, индексируемых РИНЦ, не индексируемых Web of Science – 2, 1 статья принята в печать в 2015 г.

 

Публикации

1. Вульфиус Е. А., Старков В. Г., Андреева Т. В., Цетлин В. И., Уткин Ю. Н. Новые антагонисты никотиновых холинорецепторов – белки из ядов змей семейства viperidae Доклады Академии наук, том 461, № 5, с. 604–607 (год публикации - 2015).

2. Дубовский П.В., Василевский А.А., Козлов С.А., Феофанов А.В., Гришин Е.В., Ефремов Р.Г. Latarcins: versatile spider venom peptides Cellular and Molecular Life Science, 72(23):4501-4522 (год публикации - 2015).

3. Дьяченко И.А., Андреев Я.А., Логашина Ю.А., Мурашев А.Н., Гришин Е.В. Анальгетическая активность полипептидного модулятора рецептора TRPV1. Доклады Академии наук, том 465, № 2, стр 252-254 (год публикации - 2015).

4. Дьяченко И.А., Паликов В.А., Паликова Ю.А., Андреев Я.А., Мурашёв А.Н. Новые модели изучения воспалительной активности Биомедицина, № 3, стр. 27-32 (год публикации - 2015).

5. Кашеверов И.Е., Кудрявцев Д.С., Иванов И.А., Жмак М.Н., Чугунов А.О., Табакмахер В.М., Зелепуга Е.А., Ефремов Р.Г., Цетлин В. И. Рациональное конструирование новых лигандов никотиновых рецепторов на основе альфа-конотоксина PnIA Доклады Академии наук, том 461, № 4, с. 476–479 (год публикации - 2015).

6. Кашеверов И.Е., Шелухина И.В., Кудрявцев Д.С., Макарьева Т.Н., Спирова Е.Н., Гузи А.Г., Стоник В.А., Цетлин В.И. 6-bromohypaphorine from marine nudibranch mollusk Hermissenda crassicornis is an agonist of human α7 nicotinic acetylcholine receptor. Mar Drugs, 13(3):1255-1266 (год публикации - 2015).

7. Кудрявцев Д., Шелухина И., Вульфус С., Макарьева Т., Стоник В., Жмак М., Иванов И., Кашеверов И., Уткин Ю., Цетлин В. Natural compounds interacting with nicotinic acetylcholine receptors: from low-molecular weight ones to peptides and proteins. Toxins, 7(5):1683-1701 (год публикации - 2015).

8. Кудрявцев Д.С., Шелухина И.В., Сон Л.В., Ойомоко Л.О., Крюкова Е.В., Люксанова Е.Н., Жмак М.Н., Долгих Д,А., Иванов И.А., Кашеверов И.Е., Старков В.Г., Рамерстофер Д., Сиегхарт В., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. Neurotoxins from Snake Venoms and α-Conotoxin ImI Inhibit Functionally Active Ionotropic γ-Aminobutyric Acid (GABA) Receptors. J Biol Chem, 290(37):22747-22758 (год публикации - 2015).

9. Миков А.Н., Козлов С.А. Structural features of cysteine-rich polypeptides from sea anemone venoms Russian Journal of Bioorganic Chemistry, V. 41, 5, 455-466 (год публикации - 2015).

10. Миков А.Н., Федотова И.М., Потатьева Н.Н., Малеева Е.Е., Андреев Я.А., Бочарова Е.В., Бозин Т.Н., Алтухов Д.А., Липкин А.В., Козлов С.А., Тихонов Д.Б., Гришин Е.В. ω-Tbo-IT1 - New Inhibitor of Insect Calcium Channels Isolated from Spider Venom Scientific Reports, 5:17232 (год публикации - 2015).

11. Михура И., Формановский А., Гришин Е. Химический синтез аргиопина LAP Lambert Academic Publishing, Saarbruchen, Германия, - (год публикации - 2015).

12. Осмаков Д.И., Кошелев С.Г., Андреев Я.А., Дьяченко И.А., Бондаренко Д.А., Мурашев А.Н., Гришин Е.В., Козлов С.А. Conversed mutagenesis of an inactive peptide to ASIC3 inhibitor for active sites determination. Toxicon, 116:11-16 (год публикации - 2016).

13. Осмаков Д.И., Кошелев С.Г., Белозерова О.А., Кублицкий В.С., Андреев Я.А., Гришин Е.В., Kозлов С.А. Биологическая активность севанола и его аналогов. Биоорганическая химия, том 41, № 5, с. 606–611 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. Усовершенствован программный комплекс по Белковой топографии. Комплекс основан на универсальной программной платформе, позволяющей решать широкий круг задач молекулярного моделирования. Белковая топография позволяет использовать три типа проекций: 1) сферическую; 2) цилиндрическую; 3) планарную. В возможности комплекса также входит: 1) усреднение карт с учетом динамической подвижности и объединения пептидов в группы, соответствующие биологической активности; 2) нанесение на карты проекций аминокислотных остатков, областей контакта с молекулами-партнерами и других особенностей; 3) анализ взаимодействующих белков исходя из принципов межмолекулярного соответствия (комплементарности). 2. Построена молекулярно-динамическая модель термочувствительного катионного канала TRPV1. На этой модели изучен эффект температурной активации этого канала. С помощью модели показано, что открывание «верхних» и «нижних» ворот канала является независимым и асимметричным. На сайте ИБХ РАН (http://www.ibch.ru/ru/press/news/science/1774) опубликован очерк «Биофизики впервые смогли in silico изучить температурную активацию TRPV1», содержащий результаты выполнения проекта. 3. C помощью компьютерных расчетов исследована молекулярная динамика модели биоинженерного пептида Tk-hefu2. Показано существование двух конформационных состояний, одно из которых предположительно является активным. 4. Исследована пространственная структура токсина M9 из яда скорпиона Mesobuthus eupeus. Получено производное токсина M9 с улучшенной селективностью в отношении натриевых каналов насекомых. 5. Охарактеризованы новые модуляторы, взаимодействующих с нейрональными рецепторами: - выделены 3 пептида, получившие название баптидов, из яда шумящей гадюки Bitis arietans, установлена их структура, получены синтетические аналоги, охарактеризована их активность по отношению к нАХР. - из секрета паротидных желез серой жабы Bufo bufo выделены соединения, способные взаимодействовать с нейрональным α7 нАХР и ГАМК-А рецепторами; - получен мутант конотоксина PnIA с самым высоким на сегодняшний день сродством к альфа7-нАХР (IC50 = 25 нM) и высокой селективностью действия; - охарактеризованы низкомолекулярных соединения хинолинового ряда, проявляющие свойства ингибиторов α4β2 подтипа нАХР в микромолярном диапазоне концентраций; - обнаружен компонент экстракта растения Laurus nobilis обладающий новым, не описанным ранее двойным эффектом на ASIC3 каналы; Проведено получение и тестирование нескольких мутантов альфа7 нАХР с различной чувствительностью к известным лигандам данного рецептора, а также получение мутантных форм никотиновых холинорецепторов на основе α7 и α9 субъединиц в клетках Neuro2a и оценка их аффинности к различным лигандам с помощью разработанного метода кальциевого имиджинга. Проведены биологические исследования полипептидных модуляторов TRPV1-рецепторов АРНС1-3 из морской анемоны Heteractis crispa – изучено влияние на систему гемостаза, частоту сердечных сокращений и артериальное давление крыс, а также физиологический эффект действия полипептида APHC3 при интраназальном введении. 6. Проведен поиск потенциальных активных компонентов в природных ядах с использованием транскриптомного анализа кДНК клеток животных: разработаны и апробированы новые методы обработки транскриптомной информации кДНК ядовитых животных, проведен транскриптомный анализ образцов морской анемоны Cnidopus japonicus, идентифицировано 27 новых потенциальных нейромодуляторов, секретируемых в яде анемоны. По результатам 3-х лет выполнения проекта опубликовано 1 монография, 24 статей (9 статей опубликованы в 2016 году, одна принята в печать), их них в журналах, индексируемых Web of Science и Scopus - 20, в русскоязычных изданиях, индексируемых РИНЦ, не индексируемых Web of Science/Scopus – 4.

 

Публикации

1. - «Биофизики впервые смогли in silico изучить температурную активацию TRPV1» сайт ИБХ РАН, - (год публикации - ).

2. Андреев Я.А., Логашина Ю.А., Лубова К.И., Василевский А.А., Козлов С.А. Боль, воспаление и другие неприятности: обратная сторона ощущений Природа, 12:3-9 (год публикации - 2016).

3. Вульфус С.А., Спирова Е.Н., Серебрякова М.В., Шелухина И.В., Кудрявцев Д.С., Крюкова Е.В., Старков В.Г., Копылова Н.В., Жмак М.Н., Иванов И.А., Кудряшова К.С., Андреев Т.В., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. Peptides from puff adder Bitis arietans venom, novel inhibitors of nicotinic acetylcholine receptors Toxicon, 121:70-76 (год публикации - 2016).

4. Кашеверов И., Чугунов А., Кудрявцев Д., Иванов И., Жмак М., Шелухина И, Спирова Е., Табакмахер В., Зелепуга Е., Ефремов Р., Цетлин В. High-Affinity α-Conotoxin PnIA Analogs Designed on the Basis of the Protein Surface Topography Method Scientific Reports, 6:36848 (год публикации - 2016).

5. Лихоносова А.Ф., Чугунов А.О., Ефремов Р.Г. Структурно-динамическое поведение пептида α-гарпинина TK-hefu2 в воде по данным компьютерного моделирования Наноструктуры. Математическая физика и моделирование, 15(2), 5-22 (год публикации - 2016).

6. Манетти Д., Беллучи С., Теодори Е., Варани К., Спирова Е., Кудрявцев Д., Шелухина И., Цетлин В., Романелли М.Н. New quinoline derivatives as nicotinic receptor modulators Eur J Med Chem, 110:246-58 (год публикации - 2016).

7. Плетнев В.З., Плетнева Н.В., Ефремов Р.Г., Горячева Е.А., Артемьев И.В., Архипова С.Ф., Саркисян К.С., Мишин А.С., Лукьянов К.А., Даутер З., Плетнев С.В. Пространственная структура рн-зависимого зеленого флуоресцентного белка WasCFP с хромофором на основе депротонированного TRP Биоорганическая химия, - (год публикации - 2016).

8. Скобцова Л.А., Дьяченко И.А., Андреев Я.А., Логашина Ю.А., Мурашев А.Н., Гришин Е.В. Effect of polypeptides from sea anemone Heteractis crispa on the rodent blood pressure, heart rate, and hemostasis Dokl Biol Sci, 470(1):228-230 (год публикации - 2016).

9. Тишкина А.О., Мартьянова Е.К., Логашина Ю.А., Андреев Я.А., Хайбуллина С.Ф., Мартынова Е.В., Ризванов А.А., Гуляева Н.В., Гришин Е.В. Effects of intranasal administration of the peptide antagonist of type I vaniloid receptor (TRPV1) in the rodent central nervous system Dokl Biol Sci, 470(1):234-236 (год публикации - 2016).

10. Чугунов А.О., Волынский П.Е., Крылов Н.А., Нольде Д.Е., Ефремов Р.Г. Temperature-sensitive gating of TRPV1 channel as probed by atomistic simulations of its trans- and juxtamembrane domains SCIENTIFIC REPORTS, 6, 33112 (год публикации - 2016).