КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-24-00172

НазваниеСтруктурно-функциональные исследования белков экстремофильных микроорганизмов

РуководительПопов Владимир Олегович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук", г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016  , продлен на 2017 - 2018. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований коллективами существующих научных лабораторий (кафедр)»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словапространственная структура белка, рентгеноструктурный анализ, экстремофильные микроорганизмы, мультигемовые цитохромы, трансферазы, оксидоредуктазы, серный метаболизм

Код ГРНТИ34.15.15


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В процессе эволюции микроорганизмы колонизовали самые неблагоприятные с точки зрения человека, экстремальные среды обитания. Представителей микробных сообществ можно встретить глубоко под землей на глубине до 6.7 км, на дне океанов где давление достигает 110 МРа, в условиях экстремальной кислотности (рН 0) и основности (рН 12.8) среды, в гидротермальных источниках при 122С и замерзшей морской воде при температуре –22С. Адаптация микроорганизмов к экстремальным условиям обитания может реализовываться на различных иерархических уровнях - на уровне микробного сообщества, на уровне клеточных процессов и на молекулярном, биохимическом уровне. Последний тип адаптации представляет особый интерес, поскольку делает экстремофилы перспективным источником белков и ферментов с уникальными свойствами, структурно-функциональное исследование которых позволит создать теоретическую базу для конструирования генноинженерных белков, обладающих высокой активностью и стабильностью в экстремальных условиях (рН, соленость, температура и т.д.). Информация о структурных особенностях белков экстремофильных микроорганизмов, обеспечивающих их адаптацию к условиям внешней среды, все еще достаточно ограничена и в основном связана с белками из термофилов. Весьма актуальным в связи с этим является расширение базы знаний о принципах структурной организации белков экстремофилов из других ниш обитания . Выбранные нами для исследования экстремофильные микроорганизмы – источники белковых объектов включают в себя термо- и гипертермофильные археи, галоалкалофильные и психрофильные бактерии, микроорганизмы-металлоредукторы. Сравнение пространственных структур белков, выполняющих одни и те же функции, но выделенных из организмов, приспособленных для жизни в различных условиях, позволит выявить общие закономерности структурной адаптации белков к экстремальным условиям. Впервые будут структурно и функционально охарактеризованы многие новые белки и ферменты, в частности, обеспечивающие энергетический метаболизм галоалкалофильных микроорганизмов, а также белки, участвующие в процессах металлоредукции у микроорганизмов, которая на молекулярном уровне практически не изучена. Будут подробно исследованы пространственная структура, строение активного центра и механизм действия новых белков и ферментов, участвующих в катализе данных процессов и сопряженном с ним электронном транспорте. Используя экстремофильные микроорганизмы в качестве источника биоразнообразия будут идентифицированы, получены и охарактеризованы, в том числе структурно, ряд ферментов (трансферазы, энантиоселективные оксидоредуктазы), представляющих интерес для практической биотехнологии для целей тонкого органического синтеза и получения хиральных синтонов, используемых в самых разнообразных областях, в первую очередь при синтезе лекарственных препаратов. Проект будет включать следующие основные блоки: 1. Выбор объектов исследования - отбор белков для последующей подробной структурно-функциональной характеристики. В данном проекте в качестве целевых выбраны: ферменты и ферментные комплексы энергетического метаболизма галоалкалофилов (метаболизм соединений серы); ключевые ферменты и белки, обеспечивающие процессы металлоредукции; ферменты из термо- и гипертермофильрных архей, представляющие интерес для прикладной биотехнологии для получения оптически активных соединений (аминотрансферазы и энантиоселективные оксидоредуктазы). 2. Получение и очистка целевых белков, в том числе рекомбинантных. 3. Определение и анализ пространственной структуры белков и ферментных систем экстремофильных микроорганизмов и их функциональная характеристика. В результате выполнения проекта будет проведена структурно-функциональная характеристика белков экстремофильных микроорганизмов, адаптированных к различным условиям обитания – высокой/низкой температуре, рН среды, концентрации солей. Пространственные структуры белков из экстремофилов будут сравнены между собой и со структурами белков из мезофильных организмов. Будут выявлены основные структурные закономерности (детерминанты), отвечающие за поддержание стабильности и активности белков в оптимальных для них условиях функционирования.

Ожидаемые результаты
Проект направлен на исследование атомной пространственной структуры белков и ферментных систем экстремофильных микроорганизмов и их функциональную характеристику. В результате выполнения проекта будет проведена структурно-функциональная характеристика белков экстремофильных микроорганизмов, адаптированных к различным условиям обитания – высокой/низкой температуре, рН среды, концентрации солей. Сравнение пространственных структур белков, выполняющих одни и те же функции, но выделенных из организмов, приспособленных для жизни в различных условиях, позволит выявить общие закономерности структурной адаптации белков к экстремальным условиям. Особое внимание будет уделено протеомам термофильных и гипертермофильных архей, которые отличаются уникальными механизмами жизнеобеспечения и открывают широкие перспективы для поиска ферментов с необычными механизмами действия и/или уникальными функциями. В частности, будет осуществлен целенаправленный поиск, выделение и полная структурно-функциональная характеристика биокатализаторов, представляющих интерес для прикладной биотехнологии для получения оптически активных соединений (хиральных синтонов). В качестве целевых объектов рассматриваются ферменты, относящиеся к классам трансферах, в частности аминотрансфераз, и оксидоредуктаз. Галоалкалофильная, облигатно литотрофная бактерия Thioalkalivibrio nitratireducens будет использована как модельный организм для исследования особенностей энергетического метаболизма. На основе анализа генома данного микроорганизма, его транскриптомов, полученных при различных условиях культивирования (при росте на сульфите, тиосульфате, элементарной сере и т.д.), будут выявлены, выделены (при необходимости экспрессированы рекомбинантные белки) и функционально и структурно охарактеризованы основные ферменты серного метаболизма, обеспечивающие высокую конкурентоспособность этих бактерий в ее нишах обитания. В качестве целевых объектов рассматриваются различные мультигемовые цитохромы, нтират- и нитритредуктазы, флавоцитохром с сульфиддегидрогеназа, сульфитдегидрогеназный комлекс и его отдельные компоненты, ферменты серуокисляющей системы SOX, тиоцианатдегидрогеназа и др. На основе полученных данных будут охарактеризованы ферментные системы, обеспечивающие превращение соединений серы у Th.nitratireducens и проведено их сравнение с подобными же системами неэкстремофильных организмов (например, бактерии Allochromatium vinosum). На основе анализа геномов термофильных и гипертермофильных бактерий и архей, способных к восстановлению соединений в первую очередь Fe(III), а также Mn(IV), Cr(VI), Co(III), Mo(VI) и др переменно-валентных металлов, будут выявлены ферментные системы, участвующие в процессах металлоредукции. Индивидуальные белки и/или ферментные комплексы будут выделены и охарактеризованы, в т.ч. структурно. Реализация поставленных в проекте задач даст возможность сформулировать новые представления о механизмах адаптации к экстремальным условиям внешней среды (температура, соленость, рН) на уровне пространственной структуры белков и, таким образом, способствовать рациональному дизайну новых белков с улучшенными свойствами (операционная стабильность, активность и т.п.), позволит предложить новые биокатализаторы для синтеза хиральных соединений, обеспечит структурно-функциональную характеристику белков и ферментных систем, участвующих в энергетическом метаболизме экстремофилов и процессах металлоредукции у микроорганизмов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Целью настоящего научного проекта является исследование структурных особенностей белков экстремофильных микроорганизмов, обеспечивающих их адаптацию к условиям внешней среды. Адаптационные механизмы экстремофилов включают целый ряд процессов, в том числе изменение липидного состава мембран, синтез органических осморегуляторов в ответ на осмотический шок, а также изменение состава и свойств белков - ключевых компонентов метаболических путей, обеспечивающих более эффективное превращение субстратов – источников биомассы и энергии. Последний тип адаптации представляет особый интерес, поскольку делает экстремофилы перспективным источником белков и ферментов с уникальными свойствами, структурно-функциональное исследование которых позволит создать теоретическую базу для конструирования генно-инженерных белков, обладающих высокой активностью и стабильностью в экстремальных условиях (рН, соленость, температура и т.д.). В качестве источников белковых объектов для структурно-функциональных исследований в проекте использованы следующие экстремофильные микроорганизмы и/или их геномы: • галоалкалофильные бактерии рода Thioalkalivibrio • археи и термофильные бактерии • экстремофилы, для которых показана способность к металлоредукции • психрофильные микроорганизмы. Для исследования адаптации на уровне метаболических процессов в качестве модельного объекта выбрана галоалкалофильная, облигатно литотрофная сероокисляющаябактерия Thioalkalivibrio nitratireducens, особенности энергетического метаболизма которой позволяют ей успешно конкурировать с другими бактериями в условиях содовых озер. Основную роль в обеспечении данного микроорганизма энергией играет метаболизм соединений серы. На основе анализа генома построены карты диссимиляторного метаболизма соединений серы. Ферменты и ферментные комплексы, представленные в геноме бактерии, способны осуществлять диссимиляторное окисление/восстановление соединений серы несколькими путями. Для уточнения метаболических путей соединений серы были получены транскриптомы и протеомы Tv. nitratireducens при культивировании с разными донорами (тиосульфатом, тиоцианатом) и акцепторами электронов (нитрат, кислород воздуха), проведена количественная оценка дифференциального уровня экспрессии генов белков серного метаболима в условиях анаэробного и аэробного культивирования. Показано, что в анаэробных условиях при культивировании с тиосульфатом снижается уровень транскриптов белков, участвующих в так называемом APS-пути окисления сульфита до сульфата (аденилилсульфатредуктазы (AprAB) и сульфатаденилилтрансферазы (Sat)), а также диссимиляторной сульфитредуктазы (DsrAB), осуществляющей окисление сульфида до сульфита. Анализ протеомных карт также показал исчезновение на них белковых компонентов, соответствующих бета-субъединицам Dsr и Apr.Таким образом, можно исключить участие этого пути в окислении тиосульфата до сульфата в анаэробных условиях и предположить, что основную роль играет метаболический путь, связанный с участием сероокисляющего комплекса Sox. Отобраны два ключевых компонента этого комплекса SoxAX и SoxYZ для последующей функциональной и структурной характеристики. Показано, что при культивировании бактерии Tv. nitratireducens, а также близкородственной ей бактерии Tv. paradoxus, с тиоцианатом в качестве единственного источника энергии, азота и серы, реализуется неописанный ранее метаболический путь, предполагающий окисление тиоцианата на первой стадии с образованием цианата и молекулярной серы. Показано, что ключевым фактором, влияющим на потребление тиоцианата клетками и синтез тиоцианат-превращающего фермента, является содержание ионов меди в ростовой среде. Выделен и охарактеризован фермент - тиоцианатдегидрогеназа, отвечающий за окисление тиоцианата. Показано, что активный центр фермента содержит ионы меди, участвующие в катализе. Одним из направлений исследований, проводимых в рамках данного проекта является изучение процесса диссимиляторной металлоредукции у термофильных бактерий и архей. Особый интерес вызывают процессы, связанные с переносом электронов на нерастворимые внешние акцепторы электронов, такие как оксиды металлов и минералы. Ключевую роль в процессе экстраклеточного переноса электронов выполняют мультигемовые цитохромы. Для структурно-функциональной характеристики в геноме термофильной бактерии – металлоредуктора Carboxydothermus ferrireducens отобраны два 10-гемовых цитохрома с, гомологичные ранее охарактеризованным цитохромам с MtrA и OmcA, которые входят в состав респираторной системы, окисляющей оксид железа, у хорошо изученного металлоредуктора Swevanella oneidensis. За отчетный период проведен поиск новых ферментов в геномах экстремофильных организмов. Объектами поиска являлись ферменты, стереоселективные в реакциях превращения органических соединений: омега-трансаминазы, R-селективные трансаминазы IVкласса, стереоселективные липазы, D-карбоксипептидазы и дегидрогеназы. Выбор трансаминаз был сделан в результате поиска по профилю, построенному по множественному выравниванию белковых последовательностей. Для составления базовой выборки белковых последовательностей использовались Кластеры Ортологичных Групп (COGи): COG0161, COG0160, СOG4992 и COG0001 для ω-трансаминаз (III класс трансаминаз) и COG0115 для трансаминаз IV класса. Поиск и множественное выравнивание последовательностей, кодирующих потенциальные липазы, D-карбоксипептидазы и дегидрогеназы, проводились программой BLAST и CLUSTAL W. Из геномов психрофильных бактерий для дальнейших структурно-функциональных исследований отобраны последовательности потенциальных ω-аминотрансфераз. Из геномов архей и термофильных бактерий отобраны R-селективные трансаминазы III и IV классов. Начаты работы по структурно-функциональной характеристике новых ферментов: выделена и очищена до гомогенного состояния новая трансаминаза IV класса из археи Vulcanisaeta moutnovskya. Проведена предварительная биохимическая характеристика фермента, подтверждающая принадлежность фермента к IV классу трансаминаз. Проведен широкий скрининг условий кристаллизации данной трансаминазы. По результатам скрининга для оптимизации качества кристаллов отобраны три условия роста кристаллов.

 

Публикации

1. Evgeny Osipov, Konstantin Polyakov, Roman Kittl, Sergey Shleev, Pavel Dorovatovsky, Tamara Tikhonova, Stephan Hann, Roland Ludwig and Vladimir Popov Effect of the L499M mutation of the ascomycetous Botrytis aclada laccase on redox potential and catalytic properties Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography, D70, 2913–2923 (год публикации - 2014).

2. Konstantin Boyko, Marina Gorbacheva, Tatiana Rakitina, Dmitry Korzhenevskiy, Anna Vanyushkina, Dmitry Kamashev, Alexey Lipkin and Vladimir Popov Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of histone-like HU-protein from Spiroplasma melliferum KC3 Acta Crystallographica Section F, F71 (год публикации - 2015).

3. Tatyana N. Safonova, Sergey N. Mikhailov, Vladimir P. Veiko, Nadezhda N. Mordkovich, Valentin A. Manuvera, Cyril S. Alekseev, Mikhail V. Kovalchuk, Vladimir O. Popov and Konstantin M. Polyakov High-syn conformation of uridine and asymmetry of the hexameric molecule revealed in the high-resolution structures of Shewanella oneidensis MR-1 uridine phosphorylase in the free form and in complex with uridine Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, D70, 3310–3319 (год публикации - 2014).


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект направлен на исследование ферментов из экстремофильных организмов и включает поиск новых не изученных ранее ферментов с необычными свойствами, структурно-функциональную характеристику новых ферментов, исследование механизмов адаптации белков и организма в целом к экстремальным условиям, анализ молекулярных основ стабильности белков и активности ферментов в условиях обитания организма-хозяина. Кроме постановки и решения фундаментальных задач, изучение ферментов из экстремофильных организмов позволяет предложить ферменты для биотехнологии, которые будут отличаться устойчивостью и высокой операционной стабильностью в экстремальных условиях. Объектами исследования являются ферменты из архей, термофильных и галоалкалифильных бактерий: трансаминазы – стереоселективные ферменты переноса аминогруппы; и ферменты, участвующие в метаболизме азота и серы, в том числе оксидоредуктаза, окисляющая тиоционат и цитохромы – участники цепи переноса электронов в клетке. Трансаминазы присутствуют во всех организмах и отвечают за синтез аминокислот, антибиотиков у грибов и в целом транспорт азота в клетке. Кроме обязательного участия в метаболизме аминокислот, то есть присоединения-удаления альфа-аминогруппы у природных протеиногенных L-аминокислот, трансаминазы могут иметь ряд дополнительных функций: перенос удаленной аминогруппы (синтез бета- и гамма-аминокислот), трансаминирование первичных аминов, трансаминирование R-хиральных соединений. Не все трансаминазы проявляют дополнительные функции, что определяется строением активного центра и адаптацией фермента под нужды организма-хозяина. Поиск и характеристика новых трансаминаз в археях и экстремофильных организмах нацелен на обнаружение и исследование именно интересных дополнительных функций этих ферментов, сочетающихся с высокой термостабильностью и галотолерантностью. В рамках проекта проведен биоинформатический анализ представленности трансаминаз III и IV классов, специализирующихся на трансаминировании аминокислот с удаленной по цепи аминогруппе (омега-аминотрансфераз) и трансаминировании разветвленных аминокислот. Омега –аминотрансферазы потенциально способны к переносу аминогрупп в реакциях с S-хиральными аминами, трансаминазы IV класса могут проявлять активность в реакциях переноса аминогрупп с R-хиральными аминами (R-специфичность трансаминаз). Учитывая трудности культивирования экстремофильных микроорганизмов, исследования проводятся с рекомбинантными формами ферментов. Структурно-функциональной характеристике новых объектов предшествовало создание эффективных систем экспрессии в штаммах E.coli и разработка методик выделения активных гомогенных препаратов ферментов. В отчетный период проведена первичная биохимическая характеристика новых трансаминаз из архей Мethanococcus vannielii SB, Thermomicrobium roseum, термофильной бактерии Thermobaculum terrenum ATCC и галотолерантной бактерии Haliangium ochraceum. Показано, что новые ферменты являются PLP-зависимыми трансаминазами IV класса, специфичными к разветвленным природным L-аминокиcлотам и их кетоаналогам. Все ферменты проявляют R-специфичность в реакции переноса аминогруппы с R-альфа-метилбензиламина на аминоакцептор. Наибольшую активность в реакции с R-альфа-метилбензиламином проявляют трансаминазы из H. оchraceum и T. terrenum. Ферменты из T. roseum и T. terrenum стабильны и активны при температурах выше 60 °С. Трансаминаза из М. vannielii активна при температурах до 50 °С. Термостабильность трансаминазы из H. оchraceum не исследована. Ведется кристаллизация новых трансаминаз, собраны наборы дифракционных данных с кристаллов холо-формы трансаминазы из археи M. vanillii и комплексов холо-формы с L-валином, R-альфа-метилбензиламином и L-цистеином. Структура фермента решена, ведется уточнение. Для омега-аминотрансферазы из психрофильной бактерии Psychrobacter cryohalolentis, которая относится к малоизученному семейству аdenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate aminotransferase (Clade 5 COG0161), показано, что фермент специфичен преимущественно к S-ароматическим аминам и обладает нетипичным для ω-аминотрансфераз профилем специфичности в отношении кето соединений: незначительной активностью с кетонами, кето-кислотами и сложными эфирами, высокой активностью с ароматическими альдегидами (бензальдегид, фенилглиоксаль) и алифатическими альдегидами (изобутиральдегид, пропаналь, гексаналь, глицеральдегид). Температурный оптимум реакции переноса аминогруппы с S-альфа метилбензиламина на изобутиральдегид составляет 45 °С, при 0 °С фермент сохраняет 10 % от максимальной активности. Ведется кристаллизация нового фермента с целью получения кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа и последующего анализ структуры. Исследование энергетического метаболизма у галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio, проводимое в рамках настоящего проекта, позволило выявить несколько ключевых ферментов и ферментных комплексов для последующего более подробного изучения. Наибольший интерес представляет новый, неописанный ранее фермент – тиоцианатдегидрогеназа (TCDH) - первый фермент дыхательной цепи при росте бактерий Tv. nitratireducens и Tv.paradoxus на тиоцианате в качестве единственного источника энергии, азота и серы. TCDH является гомодимером, локализован в периплазме и содержит два атома меди на субъединицу. Окисление тиоцината TCDH сопровождается образованием цианата и молекулярной серы с переносом двух электронов на цитохром с. Из периплазматической фракции бактерии Tv.paradoxus выделены два цитохрома с, являющихся потенциальными акцепторами электронов для TCDH, а также медь-связывающий белок СорС, который активируетTCDH в реакции окисления тиоцианата. Методом рентгеноструктурного анализа установлена пространственная структура TCDH. Активный центр TCDH содержит два иона меди с расстоянием между ними около 7 А, что позволяет молекуле субстрата встраиваться между ионами меди для последующего окисления. Ионы меди координированы консервативными остатками гистидина, лизина и аспартата. Еще два консервативных остатка гистидина, роль которых пока не установлена, расположены в непосредственной близости от активного центра. Предварительно можно сказать, что структура активного центра TCDH не имеет аналогов среди медь-содержащих ферментов. Рост бактерий Tv. nitratireducens и Tv.paradoxus на тиосульфате как источнике энергии приводит к значительному росту уровней транскрипции генов soxYZ, входящих в ферментативную систему Sox, отвечающую за окисление тиосульфата в условиях аэробного культивирования. SoxYZ был выделен из периплазматической фракции бактерии Tv. paradoxus, проводится функциональная характеристика выделенного белка. Создана система экспрессии мультигемовых цитохромов с в клетках E. coli. Гены целевых цитохромов с клонированы в плазмидный вектор pET-22b(+) с pelB сигнальным пептидом, обеспечивающий потенциальный транспорт целевого белка в периплазму. Полученными экспрессионными векторами трансформировали клетки E. coli штамма BL21(DE3), несущие плазмиду pEC86, содержащую кластер генов ccmABCDEFGH, обеспечивающих синтез и встраивание гемов с в рекомбинантные цитохромы, получаемые в клетках E. сoli в аэробных условиях. Два целевых мультигемовых цитохрома с из термофильной бактерии-металлоредуктора C. ferrireducens обнаружены в нерастворимой фракции клеточных белков. Проводятся эксперименты по оптимизации экспрессии целевых белков и условий перевода их в растворимое состояние.

 

Публикации

1. Ekaterina Yu. Bezsudnova, Tatiana E. Petrova, Anna V. Popinako, Mikhail Yu. Antonov, Tatiana N. Stekhanova and Vladimir O. Popov Intramolecular hydrogen bonding in the polyextremophilic short-chain dehydrogenase from the archaeon Thermococcus sibiricus and its close structural homologs Biochimie, v.118, p.82-89 (год публикации - 2015).

2. Modarres, Hassan; Dal Peraro, Matteo; Ravin, Nikolai; Dorokhov, Boris; Popov, Vladimir; Skryabin, Konstantin Understanding and Engineering Thermostability in the DNA Ligase from Thermococcus sp. 1519 BIOCHEMISTRY, v.54,19,h.3076-3085 (год публикации - 2015).

3. Osipov E., Polyakov K., Tikhonova T., Kittl R., Dorovatovsky P., Shleev S., Popov V., Ludwig R. Incorporation of the copper ion into crystals of T2-depleted laccase from Botrytis aclada Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications, F71,Pt12, p. 1465-1469 (год публикации - 2015).

4. Slutskaya E., Artemova N., Kleymenov S., Petrova T., Popov V. Heat-induced conformational changes of TET peptidase from crenarchaeon Desulfurococcus kamchatkensis. EUROPEAN BIOPHYSICS JOURNAL WITH BIOPHYSICS LETTERS, v.44,8,h.667-675 (год публикации - 2015).

5. Tatiana Petrova, Ella Slutskaya, Konstantin Boyko, Olga Sokolova, Tatiana Rakitina, Dmitry Korzhenevskiy, Marina Gorbacheva, Ekaterina Bezsudnova and Vladimir Popov The localization of Trp residues on the surface of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis Acta Cryst.Sect.F, Sect.F,v.71, p.277-2857 (год публикации - 2015).

6. Timofeev, V.I., Slutskaya, E.A., Korzhenevskiy, D.A., Gorbacheva, M.A., Boyko, K.M., Rakitina, T.V., Lipkin, A.V., Popov, V.O Crystal structure of recombinant prolidase from Thermococcus sibiricus at P21221 spacegroup. Acta Cryst, Sect.F,v.71,N8, p.951-957 (год публикации - 2015).

7. Trofimov A.A., Polyakov K.M., Lazarenko V.A., Popov A.N., Tikhonova T.V., Tikhonov А.V., Popov V.O. Structural study of the X-ray induced enzymatic reaction of octaheme cytochrome c nitrite reductase. Acta Cryst D, D71, p.1087-1094 (год публикации - 2015).

8. К.М. Бойко, В.О. Попов, М.В. Ковальчук Перспективные методы кристаллизации макромолекул, уменьшающие конвекционный транспорт вещества к растущему кристаллу Успехи Химии, 84,8, 853-859 (год публикации - 2015).

9. Михайлова А.Г., Некрасов А.Н., Зинченко А.А., Ракитина Т.В., Корженевский Д.А., Липкин А.В., Разгуляева О.А., Овчинникова М.В., Горленко В.А., Румш Л.Д. Укороченные варианты олигопептидазы В из Serratia proteamaculas с измененной активностью Биохимия, v.80, N10, 1606-1620 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В рамках исследования основных ферментов энергетического метаболизма галоалкалофильных бактерий рода Thioalkalivibrio продолжено изучение структуры и функции нового, открытого в ходе выполнения проекта, медь-зависимого фермента тиоцинатдегидрогеназы (TCDH). TCDH является первым ферментом, отвечающим за потребление тиоцианата клетками бактерий рода Thioalkalivibrio при росте на тиоцианате как единственном источнике энергии и азота. TCDH выделяется из клетки в каталитически неактивной форме (TCDH «as isolated»), которая содержит, согласно данным ICP-MS, 0.5 – 0.8 ионов меди на субъединицу. Активация TCDH происходит при насыщении ионами Cu(II) или ионами Cu(I). TCDH, насыщенная ионами меди Cu(II), содержит 2.5 – 3.5 ионов меди на субъединицу и имеет активность 2.5 мкмоль/мин на мг белка. TCDH, насыщенная Cu(I), содержит 4-5 ионов меди на субъединицу и имеет активность 4.5 мкмоль/мин на мг белка. Согласно данным ЭПР, независимо от способа встраивания ионов меди, все ионы меди в белке находятся в окисленном состоянии и принадлежат к типу 2. Методом рентгеноструктурного анализа с разрешением до 1. 45 Å получены пространственные структуры TCDH с различным содержанием ионов меди в активном центре. Структура TCDH «as isolated» (неактивная форма) содержит один ион меди в активном центре (Cu1). Cтруктура TCDH, насыщенной ионами Cu(II), содержит два иона меди в активном центре (Cu1 и Cu2), причем один ион меди (Cu1) - расположен также, как ион меди в структуре TCDH «as isolated». В структуре TCDH, насыщенной ионами меди Cu(I), обнаружено еще два иона меди (Cu3 и Cu4). Ионы меди (Cu1, Cu2 и Cu3) имеют тетраэдрическую координацию. Ион меди Cu4 имеет плоскую квадратную координацию и расположен на расстоянии около 2 Å от иона меди Cu2. Подобное строение медь-содержащего активного центра ранее описано не было. Получена структура комплекса TCDH, насыщенной ионами Cu(II), с субстратом (разрешение 1.8 Å). В активном центре локализованы два иона меди (Cu1 и Cu2) и молекула тиоцианата. Тиоцианат координируется атомом серы с ионом меди 2, замещая молекулу воды в координационной сфере, при этом сохраняется тетраэдрическая координация иона меди. Атом азота молекулы тиоцианата фиксируется водородной связью с остатком Glu288 через молекулу воды. На основании взаимного расположения молекулы субстрата, ионов меди, и каталитически активных групп в активном центре можно предположить, что на первой стадии реакции молекула воды, активируемая консервативным остатком His136, осуществляет нуклеофильную атаку на атом углерода SCN-, расположенный на расстоянии 3.7 Å от нее. Для проверки роли остатков активного центра в связывании субстрата и катализе были получены два точечных мутанта TCDH с заменой Glu288 и His136 на остатки Ala. Мутант TCDH His136Ala был неактивен, что подтверждает важную роль остатка His136 в катализе. Проводится работа по дальнейшей кинетической характеристике мутантных форм фермента и получению структуры мутантных белков и их комплексов с субстратом. В рамках исследования энергетического метаболизма термофильной грам-положительной бактерии - металлоредуктора Carboxydothermus ferrireducens выделен и охарактеризован поверхностный 12-гемовый цитохром c WP_028052385. Предполагается, что WP_028052385 участвует в переносе электронов на нерастворимый экстраклеточный акцептор, такой как ферригидрит или магнетит. Редокс титрование нативного WP_028052385 показало, что белок восстанавливается в интервале потенциалов -100 +200 мВ. Восстановленный WP_028052385 окисляется цитратом железа (E0 = 372 mV) и комплексом Fe(edta) (E0 = 96 mV), что коррелирует с величинами редокс потенциалов гемов с. При экспрессии мультигемового цитохрома с WP_028052385 в клетках E. сoli целевой белок был обнаружен в нерастворимой фракции клеточных белков. Подобраны условия перевода рекомбинантного цитохрома в растворимое состояние. Полученный цитохром с характеризуется неполным встраиванием гемов с в молекулу, что приводит к нарушению свертывания полипептидной цепи и последующей агрегации. Биотехнологическая составляющая проекта ориентирована на трансаминазы III и IV классов, проявляющие активность с первичными (R)- и (S)- аминами. Специфичные к (R)-первичным аминам трансаминазы IV класса (R-TA) и к (S)-первичным аминам омега-TA активно исследуются в настоящее время, некоторые успешно применяются на практике. За последние 3 года появились четыре структуры грибных R-TA, для нескольких грибных R-TA охарактеризована субстратная специфичность. Проведенные в рамках проекта биоинформатические исследования выявили группу из четырех бактериальных/архейных ТА IV класса с мотивом а.о. в активном центре, отличающимся от гомологичных трансаминаз разветвленных аминокислот (BCAT) и гомологичных грибных R-TA: трансаминазы из археи Мethanococcus vanielii, из термофильных бактерий Thermomicrobium roseum, Thermobaculum terrenum и из галотолерантной бактерии Haliangium ochraceum. Наши текущие исследования включали подбор оптимальных условий определения активности для новых ТА, анализ субстратной специфичности, кристаллизацию холо-форм ферментов и комплексов с ингибитором габакулином, PCA полученных кристаллов, решение и уточнение структур и анализ полученных структур. Исследование кинетики и субстратной специфичности показали, что в оптимальных условиях проведения реакции наиболее активной из новых ТА является TA из бактерии T.terrenum. Удельная активность в реакции переноса аминогруппы с L-лейцина на α-кетоглутарат в 50 мМ Tris, рН=8.0, 100 мM NaCl при 50 °C составила 300 U/mg, при 85 °С - 690 U/mg. В оптимальных условий реакции (Tris рН 9.0, 60 мкМ PLP, 50 °C, 1mM α-кетоглутарата, 10 мМ R-MBA) удельная активность этой TA с R-альфа-метилбензиламином (R-MBA) достигает 0.6 U/mg. Активность с S-MBA в этих условиях составила 0.02 U/mg. То есть по активности с R-MBA и селективности исследуемая трансаминаза не уступает грибным R-TA, удельная активность которых находится в диапазоне 0.1-10 U/mg, при этом вторым субстратом – амино акцептором в реакции является альфа-кетоглутарат, а не пируват, как у грибных R-TA. Такой тип R-специфичной активности для трансаминаз IV класса показан впервые. Активность других исследуемых в рамках проекта TA из археи М.vanielii и бактерии H.ochraceum с субстратом R-MBA в подобранных оптимальных для работы ферментов условиях составила 0.1 U/mg. Активность с R-этилбензиламином составила около 1% от активности с R-MBA для исследуемых ТА. ТА из Thermomicrobium roseum, несмотря на отличный от консервативного для BCAT мотив в активном центре, практически не активна с R-MBA. Для всех перечисленных ТА охарактеризована субстратной специфичности, которая определяет новые ТА как BCAT, проявляющие активность с R-MBA. TA из бактерии T.terrenum на сегодня и самая активная из охарактеризованных BCAT. За отчетный период выращены кристаллы, методом РСА получены наборы дифракционных данных и решены структуры холо-форм TA из T.terrenum и TA из H.ochraceum, структуры TA из T.terrenum, TA из М.vanielii с ингибитором габакулином с разрешением 1.5-2.3 Å. Анализ структур показал, что в димерах TA из T.terrenum, TA из М.vannielii имеется два симметрично расположенных активных центра, которые формируются а.о. двух субъединиц. PLP связан с белковой глобулой через ковалентную связь с каталитическим лизином, и фиксирован si-стороной к растворителю, поэтому, как и у всех ТА IV класса, у TA из T.terrenum и TA из М.vanielii перенос протона с Сα атома аминодонора на С4’ атом PLP происходит на re-стороне кофактора. Пространственная структура димеров новых ТА гомологична структурам димеров ВСАТ, DAAT и грибных R-ТА, которые объединены в один IV класс, основные различия наблюдаются в размере субстрат связывающей полости и составе и локализации а.о. в активном центре. Проведенный анализ структурных факторов термостабильности показал, что по сравнению с димерами нетермостабильных гомологов из E.coli (PDB code 1I1K) и бактерии Burkholderia pseudomallei (PDB code 3U0G) димеры TA из T.terrenum и TA из М.vannielii отличаются усилением межсуъединичного контакта, увеличением доли заряженных аминокислот в последовательности, увеличением общего числа водородных связей на 50-90%. Для повышения эффективности в реакциях с первичными R-аминами методом рационального дизайна предложен ряд мутаций в субстрат связывающей полости TA из М.vanielii SB и TA из T.terrenum. В 2016 г проведена детальная биохимическая характеристика омега-TA (Pcryo361) из психрофильной бактерии Psychrobacter cryohalolentis, которая относится к малоизученному семейству узкоспецифичных S-аденозилметионин-8-амино-7-оксононаноат аминотрансферазам (аdenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate aminotransferase). Составлен профиль субстратной специфичности фермента с неприродными субстратами. Показано, что Pcryo361 активна с (S)--метилбензиламином. Наилучшими кетосубстратами являются дикетоны и ароматические и алифатические альдегиды. Активность в реакции аминирования 2,3 гександиона достигает 0.55 U/mg, что в 5-10 раз выше активности гомологичных ферментов с природными субстратами. рН-оптимум в катализируемой Pcryo361 реакции аминирования изобутиральдегида аминодонором (S)-альфа–MBA составляет рН 10.00, установлено, что Pcryo361 активен и стабилен в диапазоне температур 0-35 °С, время полуинактивации при 35 °С при рН 10 составило 1.5 часа. Показана возможность применения Pcryo361 для кинетического разделения аминов в щелочных условиях при низких температурах (до 0 °С) и для аминирования дикетонов и альдегидов. Проведена кристаллизация холо-формы Pcryo361. Методом PCA собраны наборы дифракционных данных с кристаллов холо-формы трансаминазы Pcryo361 c разрешением 1.6 Å, структура фермента решена методом молекулярного замещения.

 

Публикации

1. - Фабрика белков принимает заказы Российская газета, Спецвыпуск № 7146 (278) (год публикации - ).

2. Алексеев К.С., Сивец Г.Г., Сафонова Т.Н., Михайлов С.Н. Substrate specificity of E.Coli UridinePhosphorylase. Further evidences of high-syn conformation of the substrate in uridinephosphorolysis Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Том 0, номер 0. стр.1-15 (год публикации - 2016).

3. Безсуднова Е., Петрова Т., Артемова Н., Бойко К., Шабалин И., Ракитина Т., Поляков К., Попов В. NADP-Dependent Aldehyde Dehydrogenase from Archaeon Pyrobaculum sp.1860: Structural and Functional Features Archaea, Article ID 9127857, 14 pages (год публикации - 2016).

4. Безсуднова Е.Ю., Стеханова Т.Н., Суплатов Д.А., Марданов А.В., Равин Н.В., Попов В.О. Experimental and Computational Studies on the Unusual Substrate Specificity of Branched-Chain Amino Acid Aminotransferase from Thermoproteus uzoniensis Archives of Biochemistry and Biophysics, Том: 607 Стр.: 27-36 (год публикации - 2016).

5. Бойко К., Ракитина Т., Корженевский Д., Власкина А., Агапова Ю., Камашев Д., Клейменов С., Попов В. Structural basis of high stability of histone-like HU ptotein from mollicute Spiroplasma melliferum KC3 Scientific Reports, 6:36366, 11 pages (год публикации - 2016).

6. Бойко К.М., Горбачева М.А., Корженевский Д.А., Алексеева М.Г., Мавлетова Д.А., Захаревич Н.В., Елизаров С.М., Рудакова Н.Н., Даниленко В.Н., Зщзщв В.О. Structural characterization of the novel aminoglycoside phosphotransferase Aph VIII from Streptomyces rimosus with enzymatic activity modulated by phosphorylation Biochemical and Biophysical Research Communications, Том: 477 Выпуск: 4 Стр.: 595-601 (год публикации - 2016).

7. Бойко К.М., Стеханова Т.Н., Николаева А.Ю., Марданов А.В., Ракитин А.Л., Равин Н.В., Безсуднова Е.Ю., Попов В.О. First structure of archaeal branched‑chain amino acid aminotransferase from Thermoproteus uzoniensis specific for l‑amino acids and R‑ amines. Extremophiles Extremophiles, Том: 20 Выпуск: 2 Стр.: 215-225 (год публикации - 2016).

8. Бойко К.М., Тимофеев В.И., Самыгина В.Р., Куранова И.П., Попов В.О., Ковальчук М.В. Кристаллизация белков в условиях микрогравитации. Анализ результатов российских экспериментов на МКС в 2005-2015 гг Кристаллография, Том 61, № 5, стр.691-702 (год публикации - 2016).

9. Дергоусова Н.И., Тихонова Т.В., Гаврилов С.Н., Устинникова Т.Б., Бонч-Осмоловская Е.А., Попов В.О. Получение рекомбинантного поверхностного мультигемового цитохрома С из термофильной бактерии Carboxydothermus ferrireducens ActaNature Спецвыпуск, Том 2. стр.228 (год публикации - 2016).

10. Лильина А.В., Осипов Е.М., Тихонова Т.В., Сорокин Д.Ю., Попов В.О. Структурно-функциональная харатеристика флавоцитохром с сульфиддегидрогеназы из экстремофильной бактерии Thioalkalivibrio paradoxus Acta Nature спецвыпуск, Том 2, стр. 85 (год публикации - 2016).

11. Сафонова Т.Н., Мордкович Н.Н., Вейко В.П., Окорокова Н.А., Манувера В.А., Дороватовский П.В., Попов В.О., Поляков К.М. Concerted action of two subunits of the functional dimer of Shewanella oneidensis MR-1 uridine phosphorylase derived from a comparison of the C212S mutant and the wild-type enzyme ACTA CRYSTALLOGRAPHICA SECTION D-STRUCTURAL BIOLOGY, Том: 72 Стр.: 203-210 Часть: 2 (год публикации - 2016).

12. Стеханова Т.Н., Ракитин А.Л., Марданов А.В., Безсуднова Е.Ю., Попов В.О. A Novel highly thermostable branched-chain amino acid aminotransferase from the crenarchaeon Vulcanisaeta moutnovskia Enzyme and Microbiol Technology, Том 96, стр 127-134 (год публикации - 2017).

13. Стеханова Т.Н., Ракитина Т.В., Безсуднова Е.Ю., Попов В.О. Новая омега-аминотрансфераза из Psychrobacter cryohalolentis K5 ActaNature Спецвыпуск, Том 2, стр.228 (год публикации - 2016).

14. Тихонова Т.В., Слуцкая Э.С., Попов В.О. Пероксидазная активность восьмигемовых нитритредуктаз из бактерий рода THIOALKALIBRIO. Прикладная биохимия и микробиология, Том 53, №2, стр.1-9 (год публикации - 2017).

15. Тихонова Т.В., Цаллагов С.И., Поляков К.М., Сорокин Д.Ю., Попов В.О. Тиоцианатдегидрогеназа – первый фермент нового метаборлического пути разложения тиоцианата у галоалкалофильных бактерий Acta Nature Спецвыпуск, Том 2, стр. 87 (год публикации - 2016).

16. Цаллагов С.И., Поляков К.М., Тихонова Т.В., Попов В.О. Структурные исследования тиоцианатдегидрогеназы из бактерий Thioalkalivibrio paradoxus ActaNature спецвыпуск, Том 2, стр.80 (год публикации - 2016).