Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Основная задача проекта – изучение молекулярных механизмов, ответственных за поддержание структурно-функциональной целостности нейроваскулярной единицы/гематоэнцефалического барьера в зависимости от скоординированной экспрессии и активности молекул астроглиального происхождения, вовлеченных в локальное метаболическое сопряжение, секрецию ангиогенных и ангиостатических молекул, (ангио)барьерогенез в пределах нейроваскулярной единицы; разработка новых подходов к направленной модуляции активности астроцитов для восстановления гематоэнцефалического барьера после перенесенного повреждения мозга и компенсации неврологического дефицита и поведенческих реакций. На первом этапе работы выполнено экспериментальное исследование характера повреждения и восстановления клеток нейроваскулярной единицы/гематоэнцефалического барьера in vivo в динамике онтогенеза (Р1-Р120): особенности экспрессии основных молекул-маркеров межклеточных взаимодействий, регуляторов ангиогенеза, состояние церебрального эндотелия в коре, гиппокампе и миндалине головного мозга, метаболический статус клеток нейроваскулярной единицы, анализ неврологической, в том числе когнитивной дисфункции и нарушения поведения у животных, перенесших перинатальное гипоксическое повреждение головного мозга или стресс раннего периода жизни. Объектом исследования являлись крысята линии Wistar обоего пола возрастом 1-120 дней (n=145). Моделирование перинатальной гипоксии производили путем их помещения на 7-е сутки развития на 1,5 часа под купол с низким содержанием (8%) кислорода при температуре 28-30ºС согласно модели (Q. Zhang et al., 2013). Модель стресса раннего периода жизни выполнялась по (M. Marmendal et al., 2004) путем ежедневного отнятия крысят от матери со 2-го по 15-й дни постнатального развития (на 3 часа в условиях инкубатора). Контролем являлись интактные животные того же возраста. При выполнении работы использованы иммуногистохимические, спектрофотометрические методы исследования, а также методы исследования неврологического статуса экспериментальных животных (стандартный вариант NSS-теста, «Открытое поле», «Водный лабиринт Морриса», «Приподнятый крестообразный лабиринт», тест на гипонеофагию, быстрый тест на социальное распознавание. Для оценки межклеточных взаимодействий в развивающемся ГЭБ и структурно-функциональной целостности ГЭБ исследована экспрессия молекул, характеризующих барьерогенез (в следующих комбинациях): соотношение зрелых и прогениторных эндотелиальных клеток (CD31/CD133), пролиферация эндотелиальных клеток, структурная целостность эндотелия и активация клеток эндотелия (JAM/PCNA; CLDN5/CD62E), экспрессия рецепторов анти- и проангиогенных факторов на клетках эндотелия (CD31/CD47), экспрессия транспортных систем в клетках нейроваскулярной единицы (ZO-1/MCT1/GFAP; MCT4/CD31/GFAP; GLUT4/CD31/NSE), астроглиальный контроль ангиогенеза (TS-1/GFAP), гликолиз и его регуляция в клетках нейроваскулярной единицы (HIF-1/ZO-1/GFAP; GSK3/CD31/GFAP; Rac1/JAM/GFAP; NFAT/Nestin; HIF-1/CD36). Экспериментально подтверждено, что постнатальный период развития головного мозга характеризуется завершением процессов барьерогенеза, динамическими изменениями экспрессии молекул, контролирующих ангиогенез, гликолиз в клетках эндотелиальной и астроглиальной природы, что сопряжено с особенностями экспрессии HIF-1 и молекул, регулирующих его экспрессию, а также транспортеров глюкозы и лактата в эндотелиоцитах и астроцитах коры и лимбической системы головного мозга. Это соответствует данным об особенностях утилизации лактата и глюкозы в качестве энергетического субстрата в динамике раннего постнатального онтогенеза. Эти механизмы нарушаются при действии повреждающих факторов в раннем онтогенезе, причем нарушения носят регион-специфичный характер и отличаются при действии гипоксии или стресса раннего периода жизни, имея своим результатом отдаленные последствия для функционирования головного мозга. Установлено, что миндалина и гиппокамп являются отделами мозга, демонстрирующими высокую степень чувствительности к действию факторов, нарушающих процессы барьерогенеза, и могут быть использованы для анализа молекулярных механизмов развития и повреждения ГЭБ. Выявлено, что ключевые изменения, маркирующие нарушение целостности ГЭБ и процессов ангиогенеза при перинатальном гипоксическом повреждении головного мозга, заключаются в увеличении экспрессии CLDN5, CD133, CD47, HIF-1 в клетках эндотелия, увеличении экспрессии MCT1 клетками эндотелия на фоне снижения экспрессии MCT4 астроцитами, снижении экспрессии TS-1 астроцитами, увеличении экспрессии GLUT4 клетками эндотелия, а при стрессе раннего периода жизни – увеличении экспрессии ZO-1, увеличении экспрессии MCT1 клетками эндотелия и MCT4 клетками астроглии, увеличении экспрессии Rac1 эндотелиоцитами и астроглией, снижении экспрессии TS-1 клетками астроглии. Показано, что в физиологических условиях количество клеток церебрального эндотелия, экспрессирующих белки тесных контактов, остается на достаточно стабильном уровне, при этом уже к 7 суткам постнатального развития количество прогениторных клеток в гиппокампе минимально, но остается достаточно высоким в коре. Установлено, что перинатальное гипоксическое повреждение головного мозга и стресс раннего периода жизни нарушают формирование тесных контактов между клетками церебрального эндотелия (дисбаланс в экспрессии белков тесных контактов и адапторных белков), что сопровождается интенсификацией процессов ангиогенеза после эпизода перенесенной гипоксии, но не социальной изоляции. Период восстановления неврологического дефицита (с Р28 до Р70) при повреждении головного мозга соответствует периоду репаративного ангиогенеза, снижению экспрессии антиангиогенной молекулы астроглиальной природы, проявлением метаболизм-модулирующих эффектов HIF-1, изменению транспорта глюкозы и лактата в клетках нейроваскулярной единице в коре и лимбической системе. По результатам первого этапа опубликована 1 статья в издании, индексируемом Scopus, и 1 статья в издании, индексируемом РИНЦ.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект реализуется с целью изучения новых молекулярных механизмов повреждения и восстановления гематоэнцефалического барьера в раннем периоде онтогенеза, ассоциированных с астроцит-эндотелиальными взаимодействиями и формированием локального ангиогенного микроокружения в нейроваскулярной единице головного мозга в (пато)физиологических условиях, для разработки новых подходов к восстановлению гематоэнцефалического барьера после перенесенного повреждения мозга. В соответствии с планом, на втором этапе проекта получены новые фундаментальные данные о HIF-1-зависимых, лактат- и амилоид-опосредованных механизмах в регуляции структурно-функциональной целостности ГЭБ, барьерогенеза с участием васкулогенных клеток в развивающемся головном мозге экспериментальных животных в физиологических условиях, а также при перинатальной гипоксии, стрессе раннего периода жизни и при нейротоксическом воздействии; новые фундаментальные данные об особенностях экспрессии генов, кодирующих белки-регуляторы гликолиза и белки-мишени действия продуктов гликолиза и регуляторов ангиогенеза, формировании локального микроокружения, оптимального для процессов ангиогенеза в развивающемся головном мозге, регуляции проницаемости и восстановления структурной целостности ГЭБ молекулами астроглиального происхождения; разработана технология получения скаффолда для моделирования ГЭБ in vitro с использованием технологии голографии и оценены особенности роста клеток церебральных микрососудов на фотополимеризованных скаффолдах по сравнению с типовым биополимерным матриксом. Объектом исследования являлись крысята линии Wistar обоего пола возрастом 7-21 дней постнатального развития (P7-P21, n=100). Моделирование перинатальной гипоксии производили путем их помещения на 7-е сутки развития на 1,5 часа под купол с низким содержанием (8%) кислорода при температуре 28-30ºС согласно модели (Q. Zhang et al., 2013). Модель стресса раннего периода жизни выполнялась по методу (Marmendal M. et al., 2004), путем ежедневного отнятия крысят от матери со 2-го по 15-й дни постнатального развития (на 3 часа в условиях инкубатора). Контролем являлись интактные животные того же возраста. При выполнении второго этапа проекта использовались органотипические культуры гиппокампа, трехклеточная (эндотелиоциты, астроциты, нейроны) модель нейроваскулярной единицы/ГЭБ in vitro, полученные от животных контрольной и экспериментальных групп. При реализации второго этапа проекта были применены следующие методы исследования: культивирование клеток и тканей, оценка пролиферации клеток в режиме реального времени, оценка экспрессии мРНК ключевых ангиогенных факторов методом ПЦР, оценка структурной целостности ГЭБ in vitro и in vivo, спектрофотометрическое определение метаболитов, иммуногистохимическая оценка экспрессии белков, конфокальная лазерная микроскопия, гистологический анализ ткани с оценкой характера ангиогенеза, анализ ангиогенеза in vitro, оценка митохондриального биогенеза в клетках in vitro, фармакологическая модуляция активности HIF-1, MCT1, гамма-секретазы, реакций гликолиза, GPR81 рецепторов лактата, а также методы статистической обработки полученных данных. Экспериментально подтверждена гипотеза о стимулирующем действии лактата (в физиологической для ткани головного мозга концентрации) на процессы формирования ГЭБ в раннем постнатальном периоде, реализуемом за счет увеличения экспрессии в клетках эндотелия и периваскулярной астроглии VEGFR2, GPR81, RAGE, определяющих рецепцию проангиогенных молекул (VEGF, лактат и Aβ, соответственно), увеличения экспрессии белков плотных контактов. Аβ в нетоксичной концентрации проявляет проангиогенную активность и способствует формированию ГЭБ в раннем постнатальном периоде, т.е. обладает синергичным с лактатом действием, дополнительно стимулирует появление CD34+ васкулогенных клеток в эндотелии и экспрессию RAGE рецепторов в клетках астроглии. Подавление продукции и MCT1-зависимого транспорта лактата в астроцитах нейроваскулярной единицы ассоциировано с аберрантным ангиогенезом и нарушением структурно-функциональной целостности ГЭБ. Перинатальная гипоксия дополнительно способствует проявлению проангиогенной активности лактата в клетках развивающегося ГЭБ, вызывает драматическое снижение пролиферации, миграции CD34+ васкулогенных клеток в участки поврежденного эндотелия, нарушение экспрессии AQP4 и снижение продукции метилглиоксаля на Р7. Однако ангиогенная активность лактата нивелируется к Р14, что соответствует максимуму альтерации эндотелиального слоя. В целом, Р14 после перенесенного перинатального повреждения характеризуются неэффективным барьерогенезом вследствие нарушения транспорта лактата в нейроваскулярной единице, а присутствие в среде инкубации экзогенного лактата дополнительно нарушает формирование межклеточных контактов в эндотелии сосудов гиппокампа, что может свидетельствовать о том, что редуцирование активности эндогенного лактата в этот период важно для предотвращения дополнительного повреждения эндотелия. К 21 суткам постнатального развития продуцируемый астроцитами лактат способствует реализации механизмов репаративного ангиогенеза. Aβ, действуя совместно с лактатом после перенесенного перинатального повреждения головного мозга, подавляет миграцию CD34+ васкулогенных клеток, стимулирует пролиферацию клеток ГЭБ, но редуцирует уровень НАД+, препятствует восстановлению экспрессии белков плотных контактов и полярности астроцитов к P21, провоцируя аберрантный (ангио)барьерогенез. В целом, продукция Аβ клетками астроглии важна для ангиогенеза в физиологических условиях, но способствует повышению проницаемости ГЭБ. Экспрессия лактатных транспортеров MCT1 и MCT4 в клетках эндотелия в норме и после перинатального повреждения головного мозга является "точкой приложения» разнонаправленных эффектов лактата и Аβ в развивающемся ГЭБ. Мы обнаружили, что поддержание целостности эндотелиального слоя в развивающемся ГЭБ in vitro достигается при сохранном гликолизе в астроцитах, активности MCT1, ограничении активности гамма-секретазы и реализации биологической активности GPR81 лактатных рецепторов, стимуляция которых в клетках астроглиальной природы приводит к подавлению продукции тромбоспондинов TS1, TS2 и VEGF, снижению митохондриального биогенеза в эндотелиальных клетках. Подавление функциональной активности HIF-1 модулирует структурно-функциональную целостность ГЭБ, продукцию эндогенного лактата, пролиферацию клеток, экспрессию мРНК и синтез белков с ангиогенной активностью (VEGF, TS2, MMP2, MMP9, АРР), но отличается при физиологическом (ангио)барьерогенезе и репаративном (ангио)барьерогенезе после перенесенной перинатальной гипоксии или стресса раннего периода жизни. Экспериментально показано, что фотополимеризованные желатиновые скаффолды, полученные методом голографии, способствуют ангиогенезу в культуре церебральных эндотелиоцитов in vitro. Результаты второго этапа дополняют экспериментальные находки, сделанные in vivo, и раскрывают новые механизмы астроцит-эндотелиального метаболического сопряжения в развивающемся ГЭБ в (пато)физиологических условиях. По результатам второго этапа проекта в 2015 году опубликованы 7 статей в изданиях, индексируемых Web of Science/Scopus (всего в 2014-2015 гг. – 8), 3 статьи в изданиях, индексируемых только в РИНЦ (всего в 2014-2015 гг. – 4), глава в 1 монографии. Результаты работы в 2015 году представлены на 4 научных форумах.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Молекулярные механизмы развития и повреждения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и нейроваскулярной единицы (НВЕ) головного мозга являются одной из наименее изученных областей современной нейробиологии, нейрохимии и неврологии, хотя нет сомнений в том, что расшифровка этих механизмов определяет прогресс в разработке новых терапевтических стратегий при заболеваниях головного мозга, связанных с нарушениями его развития, нейродегенерацией, нейровоспалением. В более общем смысле, эта проблема является центральной для понимания механизмов церебрального ангиогенеза в (пато)физиологических условиях. В фокусе наших исследований на третьем этапе проекта: 1) направленная регуляция межклеточных взаимодействий, проницаемости гематоэнцефалического барьера и (ангио)барьерогенеза in vitro за счет управления активностью астроцитов (фармакологическая модуляция, методы оптогенетики); 2) разработка новых технологических подходов к регуляции процессов церебрального ангиогенеза и барьерогенеза in vitro (с позиции формирования оптимального проангиогенного микроокружения); 3) оценка взаимосвязи характера изменения астроцит-контролируемых процессов в нейроваскулярной единице и проявления неврологической дисфункции после перенесенного в раннем периоде онтогенеза повреждения головного мозга, в том числе в контексте реализации феномена раннего программирования, определяющего характер и тяжесть неврологического дефицита после перенесенных на ранних этапах онтогенеза повреждений ткани головного мозга. Объектом исследования являлись крысы Wistar обоего пола возрастом 28-120 дней, в том числе перенесшие перинатальную гипоксию, стресс раннего периода жизни, иммобилизационный стресс; органотипические культуры гиппокампа, трехклеточная (эндотелиоциты, астроциты, нейроны) статическая модель НВЕ/ГЭБ in vitro, клетки астроглиальной и эндотелиальной природы, полученные от животных контрольной и экспериментальных групп. Для решения задач третьего этапа были выполнены моделирование перинатального повреждения головного мозга и когнитивного тренинга экспериментальных животных, оценка нейропластичности при предъявлении когнитивных стимулов, иммуногистохимическая оценка экспрессии молекул-маркеров в ткани головного мозга и в клеточных моделях in vitro, оценка проницаемости ГЭБ in vitro и in vivo, оценка ангиогенеза in vitro, выделение и культивирование клеток эндотелия микрососудов головного мозга, астроцитов и нейронов головного мозга, воспроизведение статических моделей НВЕ и ГЭБ in vitro, получение органотипических культур гиппокампа, нокдаун HIF-1 с использованием siRNA in vitro, оценка пролиферативной активности клеток методами импедансометрии, иммуногистохимии, проточной цитометрии, оценка митохондриальной активности клеток с использованием флуоресцентного зонда, анализ экспрессии генов методом ПЦР в режиме реального времени, трансфекция GFAP(+)-клеток в срезах гиппокампа и в первичной культуре астроцитов головного мозга GFAP-ChR2-mKate, электрофизиологические исследования клеток астроглиальной и эндотелиальной природы in vitro, изготовление желатиновых скаффолдов с заданной микроархитектоникой, изготовление микрофлюидных камер с градиентом концентрации проангиогенного фактора. Реализация этапа 2016 года позволила установить, что постоянное присутствие лактата в зоне роста клеток эндотелия церебральных микрососудов необходимо для ангиогенеза, тогда как постепенное снижение концентрации лактата способствует «переключению» механизмов ангиогенеза, определяемого пролиферативным потенциалом клеток эндотелия, на механизмы барьерогенеза, способствующие поддержанию структурно-функциональной целостности эндотелиального слоя. Эти механизмы опосредованы активностью GPR81 лактатных рецепторов, транскрипционного фактора HIF-1, CD147/MCT1 комплекса, ответственного за транспорт лактата. Длительная стимуляция GPR81 лактатных рецепторов в клетках церебрального эндотелия in vitro подавляет транспорт лактата за счет снижения экспрессии CD147/MCT1 и способствует интенсификации митохондриального биогенеза, увеличению пролиферативной активности клеток эндотелия. Гипоксическое повреждение астроцитов имеет своим результатом увеличением экспрессии HIF-1, CD147, VEGF, MMP9, а также лиганда CD147 – циклофилина А, подавление эффектов которого в отношении церебральных эндотелиоцитов стимулирует их пролиферацию. Такой же стимулирующий эффект в отношении пролиферации эндотелиоцитов оказывает длительная стимуляция GPR81 лактатных рецепторов, что объясняет особенности повреждения и восстановления эндотелия при гипоксии in vitro: присутствие астроглии – продуцента лактата, циклофилина А, VEGF и MMP9 - приводит к более выраженным нарушениям экспрессии белков плотных контактов в клетках эндотелия, но, одновременно, способствует восстановлению эндотелиоцитов после гипоксического повреждения. Мы обнаружили, что реализация механизмов нейропластичности в развивающемся головном мозге сопровождается изменениями экспрессии молекул-маркеров метаболической пластичности ГЭБ и маркеров нейровоспаления (HIF-1, GPR81, HMGB1, RAGE, CD147), а повышение локальной проницаемости ГЭБ в коре и гиппокампе головного мозга соответствуют характеру локальных изменений экспрессии c-fos (гена-маркера нейропластических процессов), пролиферации клеток; перенесенные перинатальная гипоксия или стресс раннего периода жизни индуцируют процессы репаративного ангиогенеза к P28, и именно этот период характеризуется максимальной эффективностью когнитивного тренинга у экспериментальных животных. Идентификация новых механизмов астроцит-эндотелиального метаболического сопряжения в ГЭБ/НВЕ обеспечило тестирование новых подходов к направленной коррекции функциональной активности клеток церебрального эндотелия in vitro (применение ингибитора циклофилина А, ингибитора MCT1, агониста GPR81), а также разработку новых технологических решений для формирования микроокружения in vitro, оптимального для процессов церебрального ангиогенеза. Так, применение желатиновых скаффолдов с заданной микроархитектоникой и насыщением лактатом формирует эффективное контролируемое проангиогенное микроокружение для клеток эндотелия микрососудов головного мозга, наличие спекл-структуры в фотополимеризованном матриксе способствует пролиферации, но не специализации клеток эндотелия; разработка и применение оригинальных микрофлюидных камер с возможностью формирования градиента концентрации ангиогенных факторов позволяют оценить особенности церебрального ангиогенеза in vitro. В соответствии с полученными данными, оценка ангиогенеза на лактат-насыщенных скаффолдах или в микрофлюидной камере in vitro позволяет охарактеризовать фрактальную размерность петель, формирующихся in vitro при пролиферации клеток эндотелия церебральных микрососудов, которая увеличивается в соответствии с градиентом концентрации лактата (уменьшение актуальной локальной концентрации лактата способствует формированию сложной геометрии формирующихся петель, что свидетельствует о превалировании процессов дифференцировки клеток над пролиферацией в этих условиях). В рамках реализации третьего этапа проекта нами реализован оптогенетический протокол in vitro, который доказал возможность опосредованного фотоактивированными астроцитами влияния на функциональную активность клеток церебрального эндотелия (изменение электрофизиологических свойств плазматической мембраны, подавление амплитуды калиевого тока и увеличение экспрессии генов, кодирующих HIF-1 и VEGFR2 в клетках эндотелия) после фотоактивации астроцитов в моделях НВЕ. Примененные технологические подходы демонстрируют новые возможности биоинженерии и оптогенетики применительно к решению задач цереброваскулярной (пато)физиологии, нейробиологии, нейрофармакологии. В целом, в соответствии с планом работ третьего этапа, мы оценили вклад клеток эндотелиальной и астроглиальной природы в формирование проангиогенного микроокружения в развивающемся ГЭБ, показали, что метаболическая пластичность астроглии и эндотелия определяет эффективность ангиогенеза, установили, что нейропластичность головного мозга ассоциирована с динамическими изменениями проницаемости ГЭБ, доказали возможность применения скаффолдов с заданной микроархитектоникой для формирования градиента проангиогенного фактора (лактата) в участках интенсивного церебрального ангиогенеза, определили новые возможности микрофлюидных технологий в изучении характеристик ангиогенеза с участием церебральных эндотелиоцитов, продемонстрировали эффективность оптогенетического подхода для индукции астроцит-опосредованного изменения функциональной активности клеток церебрального эндотелия. Полученные результаты существенно дополняют экспериментальные данные предшествующих этапов проекта, и свидетельствуют о достижении цели и решении задач исследования в целом. Авторским коллективом в 2016 году опубликованы 8 статей в изданиях, индексируемых Web of Science/Scopus (всего в 2014-2016 гг. – 16), 5 статей в изданиях, индексируемых только в РИНЦ (всего в 2014-2016 гг. – 9), 1 монография (всего в 2014-2016 гг. – 2). Результаты работы в 2016 году представлены на 3 научных форумах в Российской Федерации и за рубежом (всего в 2014-2016 гг. - 7). Следующие интернет-ресурсы содержат упоминания о настоящем проекте: http://www.mgzt.ru/n-76-ot-7-oktyabrya-2016-g/iz-ruk-v-ruki; http://www.poisknews.ru/special/university/21302/