КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-25-00065

НазваниеВалидизация TAAR2, TAAR5 и TAAR6 рецепторов следовых аминов в качестве потенциальных новых лекарственных мишеней для лечения заболеваний мозга

РуководительГайнетдинов Рауль Радикович, Кандидат медицинских наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Года выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016 

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований коллективами существующих научных лабораторий (кафедр)»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-106 - Нейробиология

Ключевые словафармакология, нейробиология, трансляционная медицина, шизофрения, болезнь Паркинсона, депрессия, трансгенные модели животных, оптогенетика, следовые амины, GPCR рецепторы, моноамины

Код ГРНТИ34.15.43


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Открытие в 2001 году нового класса моноаминергических GPCRs – «trace amine» связанных рецепторов (TAARs, 9 генов идентифицированы у человека, TAAR1-TAAR9) проложила путь для понимания функциональной роли эндогенных следовых аминов в физиологии и патологии млекопитающих. Следовые амины (β-фенилэтиламин, тирамин, триптамин и октопамин) структурно близки к классическим моноаминам и играют важную роль в физиологии беспозвоночных, но их функции в организме млекопитающих остаются неизвестными. Определение роли этих аминов и их рецепторов в физиологии млекопитающих могли бы объяснить многие загадки патологии и фармакологии моноаминергической синаптической передачи. Сочетание современных электрофизиологических и трансгенных подходов с классической фармакологией, биохимией и исследованием поведения может предоставить уникальную возможность в анализе физиологической роли TAARs у млекопитающих (Sotnikova et al. 2009). Создание новых пород мутантных мышей с отсутствием отдельного trace amine рецептора (TAAR) обеспечивает относительно простой подход для исследования роли следовых аминов и их рецепторов. Данное исследование будет проводиться на недавно созданных линиях мышей с выключенными генами рецепторов TAAR5, используя сочетание биохимических, нейрохимических, фармакологических, электрофизиологических и поведенческих подходов. Кроме того, в проекте будут проведены аналогичные исследования новых мутантных мышей, лишенных TAAR рецепторов (TAAR2 and TAAR6) (Sotnikova et al. 2009; Sotnikova et al. 2008). Другим инновационным подходом для понимания физиологической роли этих рецепторов будет использование принципов оптогенетики для селективной активации нейронов экспрессирующих TAAR рецепторы. Идентификация новых лигандов этих рецепторов будут проводиться in vitro с помощью BRET подхода (Barak et al. 2008; Espinoza et al. 2011; Espinoza et al. 2013). Также предполагается использовать метаболомные подходы к обнаружению trace amines в различных экспериментальных и патологических состояниях а также биохимические и протеомные подходы к пониманию внутриклеточных сигнальных механизмов, участвующих в действии TAARs. Эти исследования должны в конечном итоге привести к созданию новых лекарственных препаратов и инновационных подходов для лечения болезней человека.

Ожидаемые результаты
Валидизация TAAR2, TAAR5 и TAAR6 как новых лекарственных мишеней для лечения заболеваний мозга могут открыть новые фармакологические подходы для терапии заболеваний ЦНС. На сегодня роль этих рецепторов в нейрональной деятельности остается неизвестной и предлагаемые исследования ответят на этот вопрос согласно высочайшим мировым стандартам. Результаты данной работы будет иметь прямое практическое применение в плане разработки новых фармацевтических агентов для терапии заболеваний мозга, а также других нарушений, и , таким образом, иметь важное экономическое и социальное значение.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В отчетном году нами было проведено исследование свойств TAAR5 рецепторов. Эксперименты проводились как in vitro так и на животных, в том числе на мутантных мышах, лишенных рецепторов TAAR5. В исследованиях in vitro были идентифицированы лиганды рецепторов TAAR5 - несколько антагонистов и 1 агонист. Также были проведены исследования по изучению внутриклеточных сигнальных путей с использованием методики BRET. Были получены важные данные о распределении TAAR5 рецепторов в головном мозге. Кроме того, было проведено тестирование поведения на мышах, лишенных TAAR5 рецепторов. Получены данные о параметрах поведения показали, что TAAR5 рецепторы играют важную роль в модуляции поведения.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
За отчетный период были проведены следующие работы: 1. Были получены генетические конструкции для создания линий мышей, нокаутных по генам TAAR2 и TAAR6, при помощи современной системы редактирования геномов «CRISPR/CAS9», позволяющей получить трансгенных животных уже в первом поколении. С помощью данного метода была апробирована методика получения TAAR2-KO нокаутной линии мышей. Поскольку сравнение двух пород нокаутных животных, созданных разными методами, позволяет проводить более точную оценку измененных физиологических процессов, в рамках программы KOMP knockout mouse project repository мы получили сперму TAAR2 нокаутных мышей. В настоящее время проведено искусственное оплодотворение и получено потомство для дальнейшего размножения. 2. Были проведены работы по поиску веществ-лигандов рецепторов TAAR2 и TAAR6 при помощи метода BRET-скрининга (bioluminescence resonance energy transfer). На первом этапе данной работы была произведена оценка лиганд-рецепторного взаимодействия биогенных аминов различной структуры, некоторые из которых являются лигандами других рецепторов семейства TAAR. Интересно заметить, что для рецепторов TAAR2 был получен очень четкий ответ на определённые соединения, тогда как для рецепторов TAAR6 был получен слабый ответ только на одно соединение. На втором этапе проводили скрининг библиотек известных соединений состоящих из 1500 веществ. Для рецептора TAAR2 были обнаружены соединения, которые повышают внутриклеточную концентрацию цАМФ. Обратного агонизма и антагонизма химические соединения из этих библиотек не показали. Также не удалось получить ответ на возможность активации рецепторов TAAR6, что, по-видимому, свидетельствует о потенциальном вовлечении других молекулярных механизмов, в частности Ca2+-зависимых. 3. Был проведен анализ экспресcии генов рецепторов TAAR в образцах мозга человека с помощью метода ПЦР в реальном времени. Была обнаружена слабая экспрессия TAAR5, а также TAAR2 и TAAR6 мРНК во фронтальной коре мозга человека. 4. Были продолжены работы по исследованию свойств TAAR5. Мыши TAAR5-KO были протестированы в тестах, оценивающих дофамин-зависимое поведение. В этих тестах не выявлены отличия мутантных животных от контрольных, что позволяет предполагать отсутствие изменений в дофаминовой системе мозга мышей без TAAR5. В то же время, у мутантов были обнаружены изменения в экспериментах, оценивающих эмоциональное поведение животных. Было также обнаружено, что ряд селективных TAAR1 агонистов являются также антагонистами TAAR5 рецепторов. Аналогичная закономерность была также отмечена в случае представителя другой группы эндогенных TAAR1 агонистов – 3-iodothyronamine, что предполагает возможный вклад TAAR5 в эффекты этих TAAR1 агонистов и эти эффекты должны учитываться при интерпретации данных полученных с этими соединениями в экспериментах. 5. Агонист TAAR5 рецепторов был протестирован в хроническом эксперименте по влиянию на феномены группы процессов предшествующих вниманию, таких как сенсорный гейтинг и негативность рассогласования на крысах. 6. Для оценки эффектов TAAR лигандов нами разрабатывается многоканальная радиотелеметрическая система измерения биопотенциалов с вводом оцифрованных данных в компьютер в масштабе реального времени (МРТС-БП). Создаваемое устройство позволит в хронических экспериментах с вживлёнными электродами сопоставлять отклонения в поведении и в электрических реакциях гамма-диапазона в мутантных линиях мышей, дефицитных по TAARs, а также проследить их реакции на различные вещества, в том числе агонисты/антагонисты изучаемых рецепторов. Устройство МРТС-БП позволяет в режиме реального времени оценить субсекундные характеристики гамма-ритма в сочетании с поведенческими парадигмами на этом же животном. Таким путём можно получить данные о роли TAARs для оценки их физиологических функций. Создаваемая отечественная система с миниатюрным вживляемым чипом позволит вести электрофизиологические исследования на животных на высоком методическом уровне, независимо от импорта, с целью развития наукоемких медицинских технологий.

 

Публикации

1. Chiellini G, Nesi G, Digiacomo M, Malvasi R, Espinoza S, Sabatini M, Frascarelli S, Laurino A, Cichero E, Macchia M, Gainetdinov RR, Fossa P, Raimondi L, Zucchi R, Rapposelli S. Design, Synthesis, and Evaluation of Thyronamine Analogues as Novel Potent Mouse Trace Amine Associated Receptor 1 (mTAAR1) Agonists. J Med Chem., Jun 25;58(12):5096-107 (год публикации - 2015).

2. Cichero E, Espinoza S, Tonelli M, Franchini S, Sorbi C, Gainetdinov RR, Brasili L and Fossa P. Homology modelling-driven studies leading to the discovery of first Trace Amine-Associated Receptor 5 (TAAR5) antagonists MedChemComm, - (год публикации - 2015).

3. Cotter R, Pei Y, Mus L, Harmeier A, Gainetdinov RR, Hoener MC, Canales JJ. The trace amine-associated receptor 1 modulates methamphetamine's neurochemical and behavioral effects. Front Neurosci., Feb 13;9:39. (год публикации - 2015).

4. Espinoza S, Ghisi V, Emanuele M, Leo D, Sukhanov I, Sotnikova TD, Chieregatti E, Gainetdinov RR. Postsynaptic D2 dopamine receptor supersensitivity in the striatum of mice lacking TAAR1. Neuropharmacology, Jun;93:308-13. (год публикации - 2015).

5. Espinoza S, Lignani G, Caffino L, Maggi S, Sukhanov I, Leo D, Mus L, Emanuele M, Ronzitti G, Harmeier A, Medrihan L, Sotnikova TD, Chieregatti E, Hoener MC, Benfenati F, Tucci V, Fumagalli F, Gainetdinov RR. TAAR1 Modulates Cortical Glutamate NMDA Receptor Function. Neuropsychopharmacology., Aug;40(9):2217-27 (год публикации - 2015).

6. Gurevich EV, Premont RT, Gainetdinov RR. G protein-coupled receptor kinases: from molecules to diseases. FASEB J., Feb;29(2):361-4. (год публикации - 2015).

7. А. А. Александров, Е. С. Дмитриева, Л. Н. Станкевич Корреляция между дозированием сенсорной информации, негативностью рассогласования и временем реакции Журнал высшей нервной деятельности, том 65, No 5, с. 1–9 (год публикации - 2015).

8. Е.С. Дмитриева, А.А. Александров Влияние утомления на временные параметры сенсорного гейтинга Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова, Т. 101. №7. С. 843-850 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За отчетный период были проведены следующие работы: 1. Были получены генетические конструкции для создания линий мышей, нокаутных по генам TAAR2 и TAAR6, при помощи современной системы редактирования геномов «CRISPR/CAS9», позволяющей получить трансгенных животных уже в первом поколении. С помощью данного метода была апробирована методика получения TAAR6-KO нокаутной линии мышей. Получено TAAR6 нокаутное животное – мозаик. В настоящее время ведутся работы по скрещиванию животных, с целью получения гомозиготных TAAR6-KO мышей. 2. Были проведены работы по поиску веществ-лигандов рецепторов TAAR2 и TAAR6 при помощи метода BRET-скрининга (bioluminescence resonance energy transfer). На первом этапе данной работы была произведена оценка лиганд-рецепторного взаимодействия биогенных аминов различной структуры, некоторые из которых являются лигандами других рецепторов семейства TAAR. Интересно заметить, что для рецепторов TAAR2 был получен очень четкий ответ на определённые соединения, тогда как для рецепторов TAAR6 был получен слабый ответ только на одно соединение. На втором этапе проводили скрининг библиотек известных соединений состоящих из 1500 веществ. Для рецептора TAAR2 были обнаружены соединения, которые повышают внутриклеточную концентрацию цАМФ. Обратного агонизма и антагонизма химические соединения из этих библиотек не показали. Отработаны методы изучения клеточного сигналинга для экспериментов in vivo. 3. Был проведен анализ экспресcии рецепторов TAAR2 в мозге мышей при помощи taar2:LacZ нокаута. Была обнаружена тканеспецифичная экспрессия TAAR2. 4. Агонист TAAR5 рецепторов был протестирован в хроническом эксперименте по влиянию на феномены группы процессов предшествующих вниманию, таких как сенсорный гейтинг и негативность рассогласования на крысах. Обнаружено, что введение агониста TAAR5 рецепторов приводит к уменьшению коэффициента сенсорного гейтинга и увеличению амплитуды негативного рассогласования. Также можно утверждать, что внутрибрюшинные инъекции агониста TAAR5 рецепторов значимо влияют на мощность ЭКоГ крыс в свободном поведении. 5. Для оценки эффектов TAAR лигандов нами разработана многоканальная радиотелеметрическая система измерения биопотенциалов с вводом оцифрованных данных в компьютер в масштабе реального времени (МРТС-БП). Создаваемое устройство позволит в хронических экспериментах с вживлёнными электродами сопоставлять отклонения в поведении и в электрических реакциях гамма-диапазона в мутантных линиях мышей, дефицитных по TAARs, а также проследить их реакции на различные вещества, в том числе агонисты/антагонисты изучаемых рецепторов. Устройство МРТС-БП позволяет в режиме реального времени оценить субсекундные характеристики гамма-ритма в сочетании с поведенческими парадигмами на этом же животном. Таким путём можно получить данные о роли TAARs для оценки их физиологических функций. Создаваемая отечественная система с миниатюрным вживляемым чипом позволит вести электрофизиологические исследования на животных на высоком методическом уровне, независимо от импорта, с целью развития наукоемких медицинских технологий. Получены опытные образцы.

 

Публикации

1. Chiellini G, Nesi G, Sestito S, Chiarugi S, Runfola M, Espinoza S, Sabatini M, Bellusci L, Laurino A, Cichero E, Gainetdinov RR, Fossa P, Raimondi L, Zucchi R, Rapposelli S. Hit-to-lead optimization of mouse Trace Amine Associated Receptor 1 (mTAAR1) agonists with a diphenylmethane- scaffold: Design, Synthesis, and biological study Journal Of Medicinal Chemistry, - (год публикации - 2016).

2. Espinoza S., Sukhanov I., Illiano P., Gerasimov A., Sotnikova T.D., Ferrer I., Leo D., Gainetdinov R.R. Neuronal functions of trace amine-associated receptor 5 (TAAR5) Society for Neuroscience, Program#/Poster#: 170.07/BBB19; Topic: G.04. Mood Disorders: Depression and Bipolar Disorders (год публикации - 2016).

3. Gainetdinov R.R., Gerasimov A., Lukin A., Korenkova O., Efimova E., Espinoza S., Krasavin M.Y. Identification and development of novel Trace Amine-Associated Receptors ligands for experimental and pharmacological applications Society for Neuroscience, Program#/Poster#: 187.18/LLL25; Topic: I.05. Biomarker and Drug Discovery (год публикации - 2016).

4. Tonelli M., Espinoza S., Gainetdinov R.R., Cichero E. Novel biguanide-based derivatives scouted as TAAR1 agonists: Synthesis, biological evaluation, ADME prediction and molecular docking studies The European Journal of Medicinal Chemistry, - (год публикации - 2016).

5. Александров А.А., Дмитриева Е.С., Станкевич Л.Н., Князева В.М., Шестакова А.Н. The Development of Muscle Fatigue Suppresses Auditory Sensory Gating (P50) during Sustained Contraction Frontiers in Systems Neuroscience, 10:44. (год публикации - 2016).

6. Александров А.А., Князева В.М., Станкевич Л.Н., Дмитриева Е.С., Шестакова А.Н. Mismatch negativity affects muscle fatigue during repeated contraction trials of different durations Frontiers in physiology, 7:13. (год публикации - 2016).

7. Белов Д.Р., Вольнова А.Б., Ахмедиев Д.О. Движение волны эпилептиформной активности в ЭКоГ бодрствующих крыс на модели локальной корковой эпилепсии Журнал высшей нервной деятельности, том 66, №6, с. 1-12 (год публикации - 2016).

8. Белов Д.Р., Милютина Е.А., Колодяжный С.Ф. Саккады и предсаккадные потенциалы при игре в Тетрис Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, Т. 102. №10. С. 000-000.2016 (год публикации - 2016).

9. Дмитриева Е.С., Александров А.А. Корреляция процессов, предшествующих вниманию и времени реакции Седьмая международная конференция по когнитивной науке 20.06.16-24.06.16 Светлогорск, с. 252-253 сборника тезисов (год публикации - 2016).

10. Курзина Н.П., Аристова И.Ю., Вольнова А.Б. Формирование когнитивных карт при выработке инструментальной двигательной реакции у крыс Седьмая международная конференция по когнитивной науке 20.06.16-24.06.16 Светлогорск, с. 374-375 сборника тезисов (год публикации - 2016).