Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В отчетном году нами было проведено исследование свойств TAAR5 рецепторов. Эксперименты проводились как in vitro так и на животных, в том числе на мутантных мышах, лишенных рецепторов TAAR5. В исследованиях in vitro были идентифицированы лиганды рецепторов TAAR5 - несколько антагонистов и 1 агонист. Также были проведены исследования по изучению внутриклеточных сигнальных путей с использованием методики BRET. Были получены важные данные о распределении TAAR5 рецепторов в головном мозге. Кроме того, было проведено тестирование поведения на мышах, лишенных TAAR5 рецепторов. Получены данные о параметрах поведения показали, что TAAR5 рецепторы играют важную роль в модуляции поведения.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
За отчетный период были проведены следующие работы: 1. Были получены генетические конструкции для создания линий мышей, нокаутных по генам TAAR2 и TAAR6, при помощи современной системы редактирования геномов «CRISPR/CAS9», позволяющей получить трансгенных животных уже в первом поколении. С помощью данного метода была апробирована методика получения TAAR2-KO нокаутной линии мышей. Поскольку сравнение двух пород нокаутных животных, созданных разными методами, позволяет проводить более точную оценку измененных физиологических процессов, в рамках программы KOMP knockout mouse project repository мы получили сперму TAAR2 нокаутных мышей. В настоящее время проведено искусственное оплодотворение и получено потомство для дальнейшего размножения. 2. Были проведены работы по поиску веществ-лигандов рецепторов TAAR2 и TAAR6 при помощи метода BRET-скрининга (bioluminescence resonance energy transfer). На первом этапе данной работы была произведена оценка лиганд-рецепторного взаимодействия биогенных аминов различной структуры, некоторые из которых являются лигандами других рецепторов семейства TAAR. Интересно заметить, что для рецепторов TAAR2 был получен очень четкий ответ на определённые соединения, тогда как для рецепторов TAAR6 был получен слабый ответ только на одно соединение. На втором этапе проводили скрининг библиотек известных соединений состоящих из 1500 веществ. Для рецептора TAAR2 были обнаружены соединения, которые повышают внутриклеточную концентрацию цАМФ. Обратного агонизма и антагонизма химические соединения из этих библиотек не показали. Также не удалось получить ответ на возможность активации рецепторов TAAR6, что, по-видимому, свидетельствует о потенциальном вовлечении других молекулярных механизмов, в частности Ca2+-зависимых. 3. Был проведен анализ экспресcии генов рецепторов TAAR в образцах мозга человека с помощью метода ПЦР в реальном времени. Была обнаружена слабая экспрессия TAAR5, а также TAAR2 и TAAR6 мРНК во фронтальной коре мозга человека. 4. Были продолжены работы по исследованию свойств TAAR5. Мыши TAAR5-KO были протестированы в тестах, оценивающих дофамин-зависимое поведение. В этих тестах не выявлены отличия мутантных животных от контрольных, что позволяет предполагать отсутствие изменений в дофаминовой системе мозга мышей без TAAR5. В то же время, у мутантов были обнаружены изменения в экспериментах, оценивающих эмоциональное поведение животных. Было также обнаружено, что ряд селективных TAAR1 агонистов являются также антагонистами TAAR5 рецепторов. Аналогичная закономерность была также отмечена в случае представителя другой группы эндогенных TAAR1 агонистов – 3-iodothyronamine, что предполагает возможный вклад TAAR5 в эффекты этих TAAR1 агонистов и эти эффекты должны учитываться при интерпретации данных полученных с этими соединениями в экспериментах. 5. Агонист TAAR5 рецепторов был протестирован в хроническом эксперименте по влиянию на феномены группы процессов предшествующих вниманию, таких как сенсорный гейтинг и негативность рассогласования на крысах. 6. Для оценки эффектов TAAR лигандов нами разрабатывается многоканальная радиотелеметрическая система измерения биопотенциалов с вводом оцифрованных данных в компьютер в масштабе реального времени (МРТС-БП). Создаваемое устройство позволит в хронических экспериментах с вживлёнными электродами сопоставлять отклонения в поведении и в электрических реакциях гамма-диапазона в мутантных линиях мышей, дефицитных по TAARs, а также проследить их реакции на различные вещества, в том числе агонисты/антагонисты изучаемых рецепторов. Устройство МРТС-БП позволяет в режиме реального времени оценить субсекундные характеристики гамма-ритма в сочетании с поведенческими парадигмами на этом же животном. Таким путём можно получить данные о роли TAARs для оценки их физиологических функций. Создаваемая отечественная система с миниатюрным вживляемым чипом позволит вести электрофизиологические исследования на животных на высоком методическом уровне, независимо от импорта, с целью развития наукоемких медицинских технологий.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За отчетный период были проведены следующие работы: 1. Были получены генетические конструкции для создания линий мышей, нокаутных по генам TAAR2 и TAAR6, при помощи современной системы редактирования геномов «CRISPR/CAS9», позволяющей получить трансгенных животных уже в первом поколении. С помощью данного метода была апробирована методика получения TAAR6-KO нокаутной линии мышей. Получено TAAR6 нокаутное животное – мозаик. В настоящее время ведутся работы по скрещиванию животных, с целью получения гомозиготных TAAR6-KO мышей. 2. Были проведены работы по поиску веществ-лигандов рецепторов TAAR2 и TAAR6 при помощи метода BRET-скрининга (bioluminescence resonance energy transfer). На первом этапе данной работы была произведена оценка лиганд-рецепторного взаимодействия биогенных аминов различной структуры, некоторые из которых являются лигандами других рецепторов семейства TAAR. Интересно заметить, что для рецепторов TAAR2 был получен очень четкий ответ на определённые соединения, тогда как для рецепторов TAAR6 был получен слабый ответ только на одно соединение. На втором этапе проводили скрининг библиотек известных соединений состоящих из 1500 веществ. Для рецептора TAAR2 были обнаружены соединения, которые повышают внутриклеточную концентрацию цАМФ. Обратного агонизма и антагонизма химические соединения из этих библиотек не показали. Отработаны методы изучения клеточного сигналинга для экспериментов in vivo. 3. Был проведен анализ экспресcии рецепторов TAAR2 в мозге мышей при помощи taar2:LacZ нокаута. Была обнаружена тканеспецифичная экспрессия TAAR2. 4. Агонист TAAR5 рецепторов был протестирован в хроническом эксперименте по влиянию на феномены группы процессов предшествующих вниманию, таких как сенсорный гейтинг и негативность рассогласования на крысах. Обнаружено, что введение агониста TAAR5 рецепторов приводит к уменьшению коэффициента сенсорного гейтинга и увеличению амплитуды негативного рассогласования. Также можно утверждать, что внутрибрюшинные инъекции агониста TAAR5 рецепторов значимо влияют на мощность ЭКоГ крыс в свободном поведении. 5. Для оценки эффектов TAAR лигандов нами разработана многоканальная радиотелеметрическая система измерения биопотенциалов с вводом оцифрованных данных в компьютер в масштабе реального времени (МРТС-БП). Создаваемое устройство позволит в хронических экспериментах с вживлёнными электродами сопоставлять отклонения в поведении и в электрических реакциях гамма-диапазона в мутантных линиях мышей, дефицитных по TAARs, а также проследить их реакции на различные вещества, в том числе агонисты/антагонисты изучаемых рецепторов. Устройство МРТС-БП позволяет в режиме реального времени оценить субсекундные характеристики гамма-ритма в сочетании с поведенческими парадигмами на этом же животном. Таким путём можно получить данные о роли TAARs для оценки их физиологических функций. Создаваемая отечественная система с миниатюрным вживляемым чипом позволит вести электрофизиологические исследования на животных на высоком методическом уровне, независимо от импорта, с целью развития наукоемких медицинских технологий. Получены опытные образцы.