КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 15-14-00026

НазваниеИзучение феномена низкого генетического разнообразия ВИЧ-1 и выявление лекарственной устойчивости у циркулирующих штаммов вируса в России

РуководительКозлов Андрей Петрович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ

2015 г. - 2017 г.

Конкурс№6 - Конкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаВИЧ-1, ген env, феномен "генетического бутылочного горлышка", глубокое секвенирование РНК

Код ГРНТИ34.15.31

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Эпидемия СПИДа длится более 40 лет: считается, что первые массовые случаи заражения ВИЧ- инфекцией произошли в конце 1970-х годов. С тех пор распространение СПИДа достигло уровня эпидемии. Каждый год в мире отмечается прирост около 2,5 млн новых случаев инфицирования. Общая тенденция ухудшения эпидобстановки по ВИЧ/СПИД отмечается практически по всем странам. Изучение молекулярно-генетических особенностей передачи ВИЧ между индивидуумами создает основу для разработки вакцины против ВИЧ. В ряде исследований было установлено, что при передаче ВИЧ половым путем инфицирование реципиента в 80% случаев происходит только одним вирусным вариантом, который каким-то образом отбирается из гетерогенной популяции вирусных вариантов, присутствующих в организме донора [Keele et al., 2008; Haaland et al., 2009; Abrahams et al., 2009]. Этот так называемый эффект "генетического бутылочного горлышка"(genetic bottleneck) при половом заражении ВИЧ объясняется низкой эффективностью проникновения вируса через слизистые оболочки, а также возможным селективным давлением, которое вирусная популяция испытывает, оказываясь в слизистых донора или реципиента. Второй по распространенности путь передачи ВИЧ связан с совместным использованием игл или шприцев при инъекционном употреблении наркотиков. В настоящее время изучено мало случаев парентеральной передачи ВИЧ, и полученные разными исследователями результаты имеют противоречивый характер. Несколько лет назад мы, совместно с американскими коллабораторами из Университета Северной Каролины, провели такое исследование передающихся вариантов ВИЧ-1 в образцах крови 13 потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) с острой или ранней стадиями ВИЧ-инфекции и обнаружили передачу одного вирусного варианта в девяти (70%) случаях. Эти данные были получены с помощью метода SGA (single genome amplification), представляющего собой амплифицирование вирусного гена env из единичных копий вирусного генома методом предельных разведений. Мы показали, что причиной низкого уровня генетического разнообразия вирусной популяции у пациентов с острой и ранней ВИЧ-инфекцией не может являться низкое разнообразие ВИЧ-1 у пациентов с хронической стадией ВИЧ, и предположили существование пока неизвестного селектирующего фактора при парентеральной передаче ВИЧ [Masharsky et al., 2010]. В данном проекте мы планируем продолжить изучение особенностей парентеральной передачи ВИЧ на более высоком методологическом уровне с использованием глубокого секвенирования РНК на секвенаторе последнего поколения. Используя новейшее оборудование, мы также разработаем широкомасштабную систему выявления лекарственной устойчивости среди недавно- и хронически-инфицированных пациентов. 1. Keele BF, Giorgi EE, Salazar-Gonzalez JF, Decker JM, Pham KT, Salazar MG, Sun C, Grayson T, Wang S, Li H, Wei X, Jiang C, Kirchherr JL, Gao F, Anderson JA, Ping LH, Swanstrom R, Tomaras GD, Blattner WA, Goepfert PA, Kilby JM, Saag MS, Delwart EL, Busch MP, Cohen MS, Montefiori DC, Haynes BF, Gaschen B, Athreya GS, Lee HY, Wood N, Seoighe C, Perelson AS, Bhattacharya T, Korber BT, Hahn BH, Shaw GM. Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 May 27;105(21):7552-7

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта мы планируем на новом методологичемком уровне получить данные о числе геномов, передающихся при парентеральном заражении ВИЧ, и изучить варианты ВИЧ, ответственные за парентеральную передачу инфекции. С помощью методов глубокого секвенирования будет изучено несколько тысяч вирусных вариантов для каждого образца, т.е. подавляющее большиство вирусных вариантов, циркулирующих в пациенте. Полученные результаты могут помочь обьяснить биологические механизмы высокой скорости распространения ВИЧ-1 среди ПИН. Также будут получены данные о распространенности мутаций лекарственной устойчивости ВИЧ в популяции. Будут получены следующие материалы и данные, которые будут иметь большое значение для разработки российской региональной вакцины против ВИЧ и проведения ее испытаний: 1. Расширенная коллекция образцов крови от пациентов с острой ВИЧ-инфекцией и эпидемиологически связанных с ними пациентов с хронической ВИЧ-инфекцией, дополненная поведенческой информацией, позволяющей установить путь заражения. 2. Нуклеотидные последовательности гена env ВИЧ-1, полученные методом глубокого секвенирования, от всего многообразия вирусных вариантов, обнаруженных в образцах крови пациентов от момента заражения до развития хронической ВИЧ-инфекции. Данные последовательности будут депонированы в GenBank для обеспечения доступа к ним всем заинтересованным исследователям. 3. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей, который позволит сделать более фундаментальный вывод о природе генетического бутылочного горлышка. 4. Нуклеотидные последовательности гена pol ВИЧ-1, полученные методом глубокого секвенирования, от всего многообразия вирусных вариантов, обнаруженных в образцах крови пациентов с острой и хронической ВИЧ-инфекцией. Данные последовательности будут депонированы в GenBank для обеспечения доступа к ним всем заинтересованным исследователям. 5. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей гена pol, которые позволят выявить превалирующие мутации лекарственной устойчивости ВИЧ. Данная информация будет полезна для системы здравоохранения, конкретно при назначении антиретровирусной терапии. По результатам исследования планируется опубликовать не менее 8 статей в российских и зарубежных научных журналах.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Методом глубокого секвенирования получены последовательности фрагментов генов env и pol ВИЧ-1 субтипа А с помощью секвенаторов MiSeq и IonTorrent Отработка анализа результатов глубокого секвенирования вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) ведется на результатах глубокого секвенирования последовательностей генов-маркеров ВИЧ-1, полученных с использованием подхода PrimerID. Отработаны: проверка качества исходных ридов (для этого используется программа FastQC), очистка данных от ридов низкого качества (проведено сравнение результатов, которые выдают программы FastQC и Trimmomatic; в дальнейшем решено выполнять данную задачу с использованием программы Trimmomatic; выбраны наиболее подходящие параметры работы для Trimmomatic). Ведется отработка методологии обработки тех данных, которые получаются при применении подхода PrimerID: сортировка последовательностей, амплифицированных с одной исходной матрицы (на данный момент используется алгоритм, разработанный Zhou et al., 2015; ведется усовершенствование данного алгоритма) и последующее создание консенсусных последовательностей (на данный момент используется алгоритм, разработанный Zhou et al., 2015). Отработка статистического анализа последовательностей, полученных в результате глубокого секвенирования вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) ведется на ампликонах, полученных путем SGA и последующего секвенирования, для образцов крови пациентов с острой стадией инфекции за 2011 год. Ампликоны выравнены и переведены в Nexuss-формат, который используется в качестве входных данных для многих алгоритмов (включая программу BEAST). На этих данных отработаны все возможные параметры программы байесова филогенетического анализа BEAST (включая выбор модели молекулярных часов; использование в наборе данных консенсусной последовательности или ее отсутствие и т. д.). На данный момент происходит оценка полученных результатов, их сопоставление. В результате будут выведены параметры программы BEAST, которые лучше всего работают для такого рода данных, а также искомая скорость мутаций. В первый год проекта мы собрали 59 новых проб крови, полученных от более 20 пациентов с острой и ранней ВИЧ-инфекцией, а также разработали схему дальнейшего анализа этих образцов с помощью коллекции материала, собранного в 2011 году. Мы адаптировали подход Primer ID для анализа вируса субтипа А, и в данный момент оптимизируем схему биоинформатического анализа больших массивов данных. Мы планируем расширить анализ вирусных изолятов из недавно собранных образцов и включить в него фрагменты генов env и pol. В рамках проекта состоялась одна зарубежная поездка: группа сотрудников Политехнического Университета прошла тренинг по биоинформатике в Университете Мюнхена.

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение 2016 года проводилась работа по пополнению коллекции образцов крови от пациентов с острой ВИЧ-инфекцией, для которых собрана необходимая эпидемиологическая информация, позволяющая установить потенциальный путь заражения (половой или парентеральный). Полученные образцы будут использованы в 2017 году для амплификации нуклеиновых кислот и последующего секвенирования (48 образцов). Из проанализированных и отобранных в 2015 году 59 образцов, для глубокого секвенирования и последующего анализа были использованы 24. Основные результаты: а) Создана программа «DeePrID Analyzer» для обработки результатов так называемого «массового параллельного секвенирования» («секвенирования следующего поколения» или «глубокого секвенирования») амплифицированного методом ПЦР определенного фрагмента генома ВИЧ, начиная от первичного fastq-файла, содержащего все сгенерированные компьютером секвенатора «прочтения» нуклеотидной последовательности (так называемые «риды»), до построения файла с выровненными консенсусными нуклеотидными последовательностями, соответствующими отдельным вирусным частицам, составляющим вирусную популяцию проанализированного биологического образца. б) Проведено сравнение результатов глубокого секвенирования с помощью двух альтернативных технологий. Существенных отличий между полученными результатами не обнаружено. Поскольку технология Illumina обладает большей производительностью в расчете на один запуск прибора и меньшей частотой ошибок секвенирования, количество качественных ридов, полученных с помощью данной технологии, и, следовательно, статистическая достоверность результатов заметно превышают соответствующие характеристики глубокого секвенирования с помощью технологии Ion Torrent. в) Для всех образцов, соответствующих острой стадии ВИЧ-инфекции, обнаружено тотальное доминирование одного генетического варианта в вирусной популяции. Минорные генетические варианты в большинстве случаев либо не обнаружены, либо составляют не более 0.1% вирусной популяции, что подтверждает гипотезу о существовании эффекта «бутылочного горлышка» при парентеральной передачи ВИЧ-инфекции. г) Полученные данные глубокого секвенирования достаточны для предварительной оценки уровня генетического разнообразия вирусной популяции проанализированных биологических образцов по фрагменту гена pol и позволят в следующем году осуществить поиск мутаций устойчивости к ингибиторам протеазы ВИЧ-1

Публикации

1. Козлов А.П., Скочилов Р.В., Тюсова О.В., Веревочкин С.В., Красносельских Т.В., Малов С.В., Шаболтас А.В HIV incidence and behavioral correlates of HIV acquisition in a cohort of injection drug users in St Petersburg, Russia. MEDICINE, Medicine: November 2016 - Volume 95 - Issue 44 - p e5238 doi: 10.1097/MD.0000000000005238 (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1097/MD.0000000000005238

2. Тюсова О.В., Козлов А.П., Веревочкин С.В., Ланкастер К., Шаболтас А.В., Машарский А.Э., Духовлинова Е.В., Миллер В.С., Хофман И.Ф. A Cohort Approach to Real Time Detection of Acute HIV infections among people who inject drugs in St. Petersburg, Russia AIDS Research and Human Retroviruses, - (год публикации - 2016)

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Были доработаны определенные этапы предложенного ранее pipeline для обработки результатов глубокого секвенирования фрагментов генов вируса HIV-1 с использованием метода PrimerID. В частности – объединение прямых (R1) и обратных (R2) ридов в единую последовательность и поиск консенсусных последовательностей, которые являются гибридами двух (или более) различных вирусных кДНК. 2. Мы проверили предложенный pipeline на искусственных данных, сгенерированных на основе разработанной модели, имитирующей реальные результаты секвенирования. Была показана большая эффективность предложенного pipeline для изучения состава вирусной популяции и обнаружения редких вирусных вариантов в сравнении с альтернативным pipeline. 3. Полученные с помощью обработки предложенным pipeline результатов секвенирования фрагментов гена env HIV-1 консенсусные последовательности были использованы для проверки гипотезы “ослабленного отбора”. В результате была показана интенсификация отбора в острой фазе инфекции, что подтверждает свидетельствует в пользу эффекта “генетического бутылочного горлышка”. 4. При помощи итогового варианта автоматизированного pipeline обработаны результаты глубокого секвенирования РНК ВИЧ пациентов, находящихся в острой фазе инфекции. Получены данные подтверждающие наличие эффекта "генетического бутылочного горлышка" при передаче ВИЧ у наркозависимых. 5. Среди проанализированных вариантов не было выявлено минорных вариантов последовательностей, несущих мутации, соответствующие клинически значимой первичной резистентности вируса к АРВП.

Публикации

1. Акулова Е.Б., Мурашев Б.В., Назаренко О.В., Веревочкин С.В., Машарский А.Э., Красносельских Т.В., Лиознов Д.А., Соколовский Е.В., Козлов А.П. Immune Responses Induced by Candidate Optimized HIV DNA Vaccine in Phase I Clinical Trial Madridge Journal of Vaccines, Vol 1, Issue 2, Pp. 31-40 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.18689/mjv.2017-107

2. Акулова Е.Б., Назаренко О.В., Казеннова Е.Н., Кетлинский С.А., Мурашов Б.В., Веревочкин С.В., Машарский А.Э., Тюсова О.В., Козлов А.П. The study of immune cell populations in injection drug users from St. Petersburg cohort Addiction, - (год публикации - 2017)

3. Васильева А.А., Бизин И.В., Талалов О.В., Фришман Д.И. Accurate HIV-1 population diversity analysis using deep sequencing with Primer ID approach BMC Bioinformatics, - (год публикации - 2017)

4. Духовлинова Е.В., Машарский А.Э., Васильева А.А., Порелло А., Жоу Ш., Веревочкин С.В., Тюсова О.В., Лабранч С., Монтефиоре Д., Фришман Д.И., Коен М., Миллер В., Хоффман И., Козлов А.П.,Сванстром Р. Characterization of the Transmitted Virus in an Ongoing HIV-1 Epidemic Driven by Injecting Drug Use AIDS Research and Human Retroviruses, - (год публикации - 2017)

5. Карнаухова Ю.К., Полев Д.Е. Круковская Л.Л., Машарский А.Э., Назаренко О.В., Макашов А.А., Козлов А.П. A new cancer-testis long noncoding RNA, the OTP-AS1 RNA Nature Communications, - (год публикации - 2017)

6. Лочел ХФ, Рименшнейдер М, Фришман Д, Хейдер Д Subtype A Coreceptor Tropism Classification in HIV-1 Bioinformatics, - (год публикации - 2017)

Возможность практического использования результатов
Гены env, полученные от пациентов с острой фазой ВИЧ-инфекции в рамках проекта, белки которых обладают более высокой чувствительностью к нейтрализации, планируется включить в состав нового поколения кандидатных вакцин против ВИЧ