КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 15-15-00100

НазваниеНовые пути активации врожденного иммунного ответа на инфекционную ДНК

РуководительПолторак Александр Николаевич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Петрозаводский государственный университет", Республика Карелия

Года выполнения при поддержке РНФ 2015 - 2017  , продлен на 2018 - 2019. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словаТолл-подобные рецепторы, врожденный иммунитет, бактериальная ДНК, воспаление, бактериальные инфекции, грамм-отрицательные бактерии, стимулятор генов интерферона, макрофаги, цитокины, лимфоциты, нокаутные и трансгенные мыши, секвенирование.

Код ГРНТИ34.15.33; 34.15.23


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Распознавание цитоплазматической ДНК сенсором ДНК STING является одним из основных механизмов защиты от внутриклеточных патогенов, включая вирусы и бактерии. Исследуя роль STING в макрофагах, мы обнаружили, высокую экспрессию STING в Т-клетках на уровне мРНК и белка. Последующие исследования в Т-клетках, которые привели нас к наблюдениям, потенциально сравнимым с научным открытием в области иммунного ответа. Во-первых, мы обнаружили, что Т-клетки секретируют типа I ИФН в ответ на активацию STING с помощью DMXAA (аналог ДНК и STING-агонист). Во-вторых, используя STING-нокаутных мышей, мы обнаружили, что делеция STING значительно снижает способность Т-клеток пролифeрировать в ответ на стимуляцию TCR. Поскольку активация STING в ответ на DMXAA также ингибировала Т-клеточную пролиферацию, эти результаты позволили нам предположить, что неактивированный STING способствует активации TCR за счет взаимодействия с одним из компонентов TCR. После распознавания ДНК и активации STING покидает ER (ЭР-эндоплазматический ретикулум), что приводит к ингибированию TCR-опосредованной активации. Сам факт синтеза IFN типа I Т-клетками в ответ на их активацию аналогом ДНК подтверждает существование искомой активации Т-клеток через врожденный иммунный ответ, что обладает революционным потенциалом. Актуальность представляемого проекта состоит в том, что продукция ИФН-I Т-клетками, активированными DMXAA, может иметь важное значение для лечения, например, ВИЧ-пациентов на ранних стадиях, когда положительный терапевтический эффект ИФН наиболее выражен (ключевая проблема П6-3-2). Кроме того, DMXAA потенциально может быть использован для ингибирования пролиферации Т-клеток у пациентов с лимфомами (ключевая проблема П6-2-3) . Наконец, антиген-специфические Т-клетки могут быть активированы с помощью DMXAA и адресованы в сторону конкретных тканей-мишеней, будучи, таким образом более мобильным и надежным средством доставки ИФН по сравнению с макрофагами (ключевая проблема П6-3-2). Новизна исследований заключается в следующем: 1. STING ЯВЛЯЕТСЯ КОМПОНЕНТОМ TCR: Наши данные показывают, что как активация STING с помощью DMXAA, так и генетическая делеция в STING-/- Т-клетках ингибируют активацию TCR. Совместно, эти данные свидетельствуют о том, что STING, будучи компонентом EР, способствует сигнальной активации TCR. С другой стороны, после активации DMXAA STING покидает EР и ингибирует TCR-активацию. Эти данные хорошо вписываются в биологический контекст, согласно которому повреждение цитоплазматической ДНК в Т-клетках может являться для них сигналом, останавливающим клеточный рост. 2. DMXAA ЯВЛЯЕТСЯ НОВЫМ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ АКТИВАТОРОМ Т-КЛЕТОК: (1) Активация опосредованного STINGом сигнального пути является совершенно новым и не охарактеризованным Т-клеточным фенотипом. (2) Тот факт, что Т-клетки способны производить тип I ИФН является наблюдением, сравнимым с открытием, давая возможность предположить, что Т-клетки могут реагировать на цитозольную ДНК.

Ожидаемые результаты
Согласно представленным в заявке данным, роль STING в Т-клеточных функциях по-разному проявляется в отсутствие и при наличии активации STINGа цитозольной ДНК. Соответственно, ожидаемые результаты будут получены из экспериментов с активированным STINGом (№ 1) или неактивированным (№ 2). 1. Мы продолжим изучение STING-опосредованной сигнальной активации в Т-клетках. В частности, мы предлагаем: а) Охарактеризовать ответ на DMXAA в Т-клетках на транскрипционном уровне: для этого мы оценим уровень транскриптов на геномном уровне используя РНК-сиквенс следующего поколения. б) Сравнить ответ на DMXAA в различных подтипах Т-клеток, что позволит оценить специфичность STING-опосредованного сигнального пути. с) Изучить регуляторные способности DMXAA - активированных Т-клеток : мы выясним возможный эффект активированных DMXAA Т- клеток на воспалительный ответ миелоидных клеток. d ) Проверить роль Т-клеточного ответа на ДНК in vivo: мы используем Listeria инфекцию, которая секретирует ДНК в цитоплазму инфицированной клетки. Мы перенесем Т-клетки от потомков STING-/- и OVA II-трансгенных мышей на RAG - / - реципиентов и оценим их регуляторный эффект. Значимость ожидаемых результатов. Предложенные эксперименты помогут охарактеризовать Т-клеточные реакции на DMXAA на уровне транскрипции; оценить эффект активации ДНК на эффекторные функции Т клеток, на их развитие и дифференцировку. Эксперименты с Listeria инфекцией помогут проверить Т-клеточных ответ на ДНК в естественных условиях. Все предложенные эксперименты характеризуются абсолютной новизной, поскольку Т-клеточные ответы на ДНК практически не изучены, а соответствующие результаты не опубликованы. Поэтому мы уверены, что предложенные исследования способны совершить "переворот" в области изучения иммунного ответа на патогены и факторы ассоциированные с патогенами, применяющиеся в производстве вакцин, и, следовательно, представляют передовые открытия. Эксперименты по переносу Т-клеток in vivo помогут обосновать соответствующие исследования на человеческой модели. 2. Будет изучена роль STING в пролиферации и дифференцировке Т-клеток. В частности: а) Будет определено, на каком уровне STING оказывает свой эффект на сигнальную активацию TCR. Это будет сделано с использованием клеточной линии Jurkat, у которой делетирован STING -/-; будут также использованы первичные Т-клетки из STING-дефицитной мышиной линии. б) Будет изучена локализация STING в Т-клетках : Используя флюоресцирующие компоненты микрокластеров, такие как SLP76 или Zap70 мы исследуем возможность ко-локализации флюоресцентно-меченого STING вместе с этими компонентами. в) Будет определено, как делеция STING влияет на антиген-специфическую активацию Т-клеток. Будет измерена продукция цитокинов (IFN- γ или IL - 2) в ответ на OVA стимуляции в OT2 STING KO клетках; будет также оценен эффект DMXAA на продукцию цитокинов контрольными Т-клетками; будет изучена пролиферация Т-клеток в ответ на антиген-специфическую активацию. Значимость ожидаемых результатов. Эти данные помогут установить роль STING как компонентa TCR-активации, и возможное участие STING в формирование микро-кластеров. Исследования в этом направлении, также как и изложенные выше, будут первыми в области изучения роли STING в активации TCR и потому являются уникальными исследованиями. Кроме того, широкое распространение дефектной аллели STING в человеческой популяции позволяет предположить что эта аллель может оказывать эффект на Т-клеточные функции, усиливая таким образом прикладной характер предложенных исследований. В мировой литературе отсутствуют публикации о роли STING в Т-клетках за исключением только одной работы, в которой упоминается обнаружение STING как компонента микро-кластеров иммунных комплексов без какого-либо механистического описания.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Трансмембранный белок эндоплазматического ретикулума STING (Stimulator of Interferon Genes), известный как молекулярный сенсор цитоплазматической ДНК, играет важную роль в распознавании внутриклеточных патогенов и активации интерферон (тип I) -зависимого пути в клетках миелоидного ряда. Наши исследования показали, что в Т-лимфоцитах обнаруживается высокий уровень экспрессии STING, однако, практически ничего не известно о его роли в процессах дифференцировки / активации Т-клеток, для которых не характерны продукция интерферонов (IFN) I типа и экспрессия IFN-зависимых генов. Эксперименты по определению молекулярного и механистического уровней взаимодействия STING с сигнальным каскадом, активирующим TCR, выполненные на Т-лимфоцитах, нокаутных по STING и обработанных частицами Dynabeads с анти-CD3/CD28 антителами, показали, что STING не является компонентом сигнального каскада, индуцируемого Т-клеточным рецептором, и не участвует в антиген-независимой активации Т-клеток. Существенной разницы в пролиферации в ответ на анти-CD3 / CD28-антитела между WT (C57Black6 – WT = wild type) и КО-типами Т-клеток обнаружено не было. Стимуляция PMA или иономицином не вносила корректировку в пролиферацию STING-/- Т-клеток. Результаты дают основание предполагать, что в Т-лимфоцитах STING может играть специфическую, ранее не известную роль. Такой ролью может являться роль основного детектора клеточной инфекции или другая дополнительная роль в активации врожденного иммунного ответа. С помощью флюоресцирующих компонентов микрокластеров, таких как SLP76 и Zap70, проведена оценка внутриклеточной локализации STING в Т-клетках, изучены условия активации STING (с использованием DMXAA – 5,6 dimethlyxanthenone-4-acetic acid) и их влияние на ко-локализацию. Результаты по активации Т-клеток DMXAA показали, что WT В6 Т-клетки быстро отреагировали на DMXAA повышенным фосфорилированием киназы р-TBK1 и фактора р-IRF3, в то время как в STING - / - Т-клетках подобного эффекта не отмечено. В Т-клетках КО-типа обнаружено почти идентичное WT Т-клеткам фосфорилирование TBK1 и IRF3. Вместе с тем, для Т-клеток характерна более быстрая активация STING: ТВК-1 фосфорилирование детектируется через 5-10 минут, IRF3 фосфорилирование – через 30 минут после обработки DMXAA, тогда как в макрофагах изменения в р-TBK1 и р-IRF3 начинаются только после 30-60 минут стимуляции. WT Т-клетки в ответ на DMXAA дозозависимо продуцируют IFNβ (IFN I тип) и IFNγ (IFN II тип), в STING - / - Т-клетках IFNβ не детектируется, хотя они производят небольшое фоновое количество IFNγ, сравнимое с нестимулированными WT Т-клетками. Различие в экспрессии генов между WT В6 и STING - / - Т-клетках до и после стимуляции DMXAA выявило значительную активацию нескольких интерферон-активируемых генов (ISG), в том числе IFN I типа, Ccl5, Cxcl10, Mx1, Ifit 1, Ifit2, Ifit3в WT B6, но не в STING - / - Т-клетках. CD4 + и CD8 + Т-клетки также ответили на DMXAA стимуляцией фосфорилирования TBK1 и IRF3 и синтезом IFNβ, но только CD4 + Т-клетки синтезом IFN-γ. Индукция пролиферации Т-клеток в ответ на анти-CD3/CD28 антитела в условиях активации STING-зависимого пути DMXAA показала, что в ответ на обработку анти-CD3 антителами, сорбированными в лунках планшета, пролиферировали только WT, но не STING-/- T-клетки, причем добавление DMXAA ингибировало пролиферацию WT-клеток. Аналогичный эффект отмечался при совместной обработке указанных Т-клеток сорбированными анти-CD3+анти-CD28. Наконец, обработка клеток микросферами, покрытыми анти-CD3/CD28 антителами, приводила к индукции пролиферации как WT, так и STING-/- T-клеток, однако, DMXAA подавлял пролиферацию только в WT, но не в STING-/- T-лимфоцитах. Данные позволяют с уверенностью утверждать, что утрата STING настолько негативно сказывается на пролиферации, что только покрытые анти-CD3/CD28 частицы предоставляют сигнал достаточной силы, чтобы индуцировать пролиферацию в STING-/- T-клеток. В то же время, активация STING под действием DMXAA приводит к ингибированию пролиферации WT T-клеток, простимулированных антителами, сорбированными на планшете или связанными с микросферами. Основываясь на полученных данных, мы предлагаем модель, в которой STING служит в качестве части платформы, вовлеченной в TCR-индуцированную активацию; в результате связывания DMXAA активирует STING, который отдаляется от платформы, нарушая при этом TCR сигнальный каскад и ингибируя пролиферацию. Модель объясняет, почему и генетический дефект, и DMXAA-индуцированная активация STING ингибируют Т-клеточную пролиферацию. Результаты по исследованию транскрипционного ответа на активацию STING DMXAA на геномном уровне (РНК-секвенирование) демонстрируют неожиданные различия в уровне экспрессии генов нестимулированных WT В6 и STING - / - Т-клеток: нестимулированные STING - / - Т-клетки показывают более высокие уровни CD8-хемокина Xcl1, гранзимов, TNFα, перфорина, LTA и транскрипционного фактора Eomes, то есть генов, ассоциированных с фенотипом цитотоксических Т-клеток. Учитывая тот факт, что у STING-/- мышей дифференцировка CD4 и CD8 T-лимфоцитов в тимусе протекает без видимых отклонений, можно предположить участие STING в модулировании процессов активации наивных CD8 Т-клеток. Однако, несмотря на ассоциацию STING с CD8-фенотипом, как CD4-, так и CD8-позитивные WT клетки, выделенные из периферических лимфоузлов, в равной степени отвечали на DMXAA фосфорилированием TBK1 и IRF3 и продукцией IFNβ. Обнаруженные различия требуют дальнейшего, более детального изучения.

 

Публикации

1. Poltorak A., Kurmyshkina O.V., Larkin B., Surpris G., Ilyukha V.V., Volkova T.O. Type I interferon-associated signaling in T cells: The novel functions of STING Cytokine, 76 (1); 78-79 (год публикации - 2015).

2. Surpris G., Chan J., Thompson M., Ilyukha V., Liu B.C., Atianand M., Sharma S., Volkova T., Smirnova I., Fitzgerald K.A., Poltorak A. Novel Tmem173 allele reveals importance of STING N-terminus in trafficking and type I IFN production The Journal of Immunology, 196 (2); 547-552 (год публикации - 2016).

3. Полторак А. Н., Илюха В. В., Курмышкина О. В., Вижуева Е. М., Волкова Т. О. НОВЫЕ ФУНКЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ДНК-СЕНСОРА STING ПРИ ИММУННОМ ОТВЕТЕ Российский иммунологический журнал, 9 (18); № 3 (1); 163-165 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В первой серии экспериментов данного этапа нами было продолжено изучение молекулярного и механистического уровней взаимодействия STING с сигнальным каскадом, активирующим TCR (T cell Receptor). Исследования показали, что генетическая делеция STING сильно замедляет Т-клеточную пролиферацию в ответ на активацию TCR. Интересно, что активация STING через DMXAA также ингибирует TCR-индуцированную пролиферацию. Оба наблюдения приводят к разработке новой модели, в которой STING способствует TCR сигналингу, возможно, взаимодействуя с одним из последующих компонентов пути, но диссоциирует от TCR вслед за узнаванием DMXAA и последующей активацией. Следовательно, DMXAA становится инструментом тонкой настройки при TCR-активации в Т-клетках. Далее была оценена тканевая специфичность экспрессии STING. Эксперименты позволили сделать вывод о преимущественной экспрессии STING в иммунокомпетентных клетках (макрофаги, дендритные клетки) и органах (тимусе, селезенке). Тот факт, что STING экспрессируется на высоком уровне в лимфоидных тканях и, конкретно, в Т-лимфоцитах, заставляет задуматься о том, что он может являться активным участником сигнальных Т-клеточных каскадов и играть незаменимую в определенных условиях роль. Тем не менее, другие клетки (эпителиальные, эндотелиальные, нервные и др.) также экспрессируют STING. В них роль STING вполне может объясняться участием в процессах пролиферации, дифференцировки, апоптоза. Нами показано, что клетки В6 мышей (гепатоциты) являются высоковосприимчивыми к Fas-индуцированному апоптозу, за счет продуцирования более высоких уровней cFLIPR (короткой изоформы белка) по сравнению с гепатоцитами линии MSM (продуцируют длинную изоформу cFLIPL). cFLIPL связывает каспазу 8, предотвращая апоптоз. На каком этапе в данный процесс может вовлекаться STING (и может ли) требует дальнейшего детального изучения. Наиболее интересными моделями в данном варианте нами рассматриваются искусственно зараженные бактериальной или вирусной инфекцией мыши дикого и нокаутного типа в условиях стимуляции STING. Вторая серия экспериментов включала исследование влияния STING на развитие Т-клеток. Исследовали популяции тимоцитов и периферических Т-клеток (CD4+, CD8+, популяции Treg), выделенных из лимфоузлов мышей дикого и/или нокаутного типа. Полученные данные показали, что отсутствие STING не влияет на развитие Т-клеточных органов. Между CD4 + Foxp3 + регуляторными Т-клетками из pLN у C57BL/6 и STING - / - мышей различий также не выявлено. Кроме того, дикие и STING дефицитные мыши одинаково экспрессируют Т-клеточный рецептор (TCR), и отсутствие STING не изменяет TCR-стимулированную экспрессию CD69 и CD25. Тем не менее, добавление DMXAA оказывает влияние на экспрессию данных маркеров у C57BL/6 мышей, особенно CD25 после 40 часовой стимуляции. Нами был обнаружен факт различного соотношения подтипов Т-клеток по уровню STING, и сделан важный вывод, подтверждающий предположение о ведущей роли STING в активации Т-клеток. Кроме того, мы сравнили уровень CD25 (рецептор для IL-2) у диких и конгенных мышей. MOLF Т-клетки в данном эксперименте производили более высокие уровни IFNβ и IL-2 по сравнению с WT B6 и MOLF STING. B6 конгенные Т-клетки продуцировали одинаковое количество этих цитокинов. В STING - / - Т-клетках синтезировалось больше IFNβ и IL-2, чем в WT, но меньше, чем в MOLF Т-клетках. Результаты проведенного сравнительного анализа транскриптомов стимулированных Т-лимфоцитов методом РНК-секвенирования показали, что Т-клетки дикого типа в ответ на стимуляцию STING с помощью DМХАА активируют ряд цитокинов из семейства интерферонов, в том числе IFN α1, 2, 4, 5, которые обычно не ап-регулируются миелоидными клетками. Анализ сигнальных путей выявил STING-специфическую активацию апоптозных путей в Т-клетках. Оказалось, что апоптозные пути характеризуются общим паттерном, так же как и продукция цитокинов. В частности, активация Т-клеток дикого типа DМХАА приводит к активации апоптоза, а в нокаутных клетках такой активации нет. На основе этих данных было сделано предположение, что активация STING в Т-клетках приводит к клеточной смерти. Поэтому далее мы проанализировали конкретные транскрипты генов, ответственных за клеточную смерть или пролиферацию, и обнаружили, что действительно основные регуляторы и индукторы клеточной смерти активируются в ответ на DМХАА. Подобная смерть характерна именно для Т-клеток, поскольку макрофаги не предрасположены к апоптозу. В итоге при стимуляции синтетическим агонистом DMXAA возможна принципиальная активация STING/TBK1/IRF3 сигналинга в мышиных CD4/CD8 Т-клетках с последующей индукцией экспрессии множества интерферон-стимулирующих генов (ISG), что ставит вопрос о подобной активации в физиологических условиях. Но даже если предположить, что STING-зависимая индукция IFN/ISG в Т-клетках не является физиологически значимой, она, тем не менее, приобретает особую важность при терапевтических воздействиях с использованием высокоаффинных синтетических агонистов STING. Третья серия экспериментов была направлена на изучение эффекта STING-опосредованной активации на функции Т-клеток. Оценена специфичность действия DMXAA на различные подтипы Т-клеток путем индукции дифференцировки Th1 клеток с помощью IL-12 (IL-4), Th2 клеток с помощью IL-4 (IL12) и Th17 с помощью IL-6, IL23 и TGF-β, с последующей обработкой DMXAA. Результаты показали, что STING/IFN-β зависимая продукция цитокинов индуцирует дифференцировку Treg лимфоцитов и подавляет Th1 ответ. Важным оказался и тот факт, что MOLF-линия характеризуется дефектами в отношении противовирусного иммунитета. Для определения гена, который несет IFN-дефект, нами была создана панель мышей F2 (B6xMOLF), и изучен их ответ на CDN, HSV и L. monocytogenes. Все исследуемые варианты были связаны с Tmem173 – геном, кодирующим STING. Мы обнаружили множественные полиморфизмы в STING MOLF – L47V, A48G, S53L, S103F, I114M, Y115C, Y126S и 6-аa делеций 116-122 в NTD, с одной заменой, N210D, в CTD STING. Структурный анализ с использованием Smart Motifs и ELM программного обеспечения показал, что эти полиморфизмы будут влиять на вторичную структуру белка и нарушать трансмембранные участки связывания STING. Так, удалось обнаружить естественный мутантный вариант STING, не отвечающий на активацию DMXAA запуском экспрессии IFN I типа. Весьма неожиданно, АК-замены (L47V, A48G, and S53L), делающие MOLF-вариант гена нефункциональным при стимуляции DMXAA, располагаются в N-концевом домене, а не лиганд-связывающем, и сопряжены с нарушением траффика STING из ЭПР в аппарат Гольджи. Более того, нами показано, что MOLF-аллель является гипоморфной, так как не влияет на уровень продукции IL-6 и некоторых других NFkB-регулируемых цитокинов, и не влияет на распознавание макрофагами РНК-вирусов, что указывает на значимость N-концевого домена не только в активации STING, но и в переключении сигнала, исходящего от ДНК-сенсоров. Проведенный генетический скрининг показал, что N-концевой домен отвечает не просто за заякоривание STING в мембране ЭПР, но также необходим для его правильной активации и транслокации, хотя ранее выполнение этой функции присваивали лиганд-связывающему CTD. Таким образом, все запланированные исследования данного этапа выполнены в полном объеме.

 

Публикации

1. Poltorak A., Kurmyshkina O., Volkova T. Stimulator of interferon genes (STING): A "new chapter" in virus-associated cancer research. Lessons from wild-derived mouse models of innate immunity Cytokine Growth Factor Rev., 29; 83-91 (год публикации - 2016).

2. Ram D.R., Ilyukha V., Volkova T., Buzdin A., Tai A., Smirnova I., Poltorak A. Balance between short and long isoforms of cFLIP regulates Fas-mediated apoptosis in vivo PNAS, 113(6); 1606-1611 (год публикации - 2016).

3. Surpris G., Poltorak A. The expanding regulatory network of STING-mediated signaling Curr Opin Microbiol., 32; 144-150 (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В первой серии экспериментов данного этапа был проведен биохимический анализ роли STING в TCR активации, в том числе с использованием DMXAA. Определили возможный эффект STING на активацию РLCγ и ERK киназ, регулируемых в ответ на анти-CD3 сшивание Т-клеточного рецептора. PLCγ является одной из самых ранних ступеней TCR–активации, ERK расположена ниже по пути передачи сигнала. Показано, что DMXAA, индуцируя фосфорилирование TBK1 и IRF3 в WT, но не STING-/- Т-клетках, повышает фосфорилирование p38 и p65, а также PLCγ. Полученные данные дополнены анализом NFкB активации. Изменений в фосфорилировании белка p105, ингибирующего NFкB, после активации STING зарегистрировано не было, но поскольку активация TCR вызывает фосфорилирование p105 и деградацию активного фактора транскрипции p50, было интересно, повлияет ли DMXAA также на этот путь. Фосфорилирование p105 было слабо индуцировано стимуляцией TCR через 60 мин, как в клетках дикого типа, так и в STING-/-, но было сильнее и быстрее в клетках дикого типа при добавлении DMXAA. Обнаруженная разница между Т-клетками дикого и нокаутного типа в активации пролиферации, позволяет сделать вывод о преимущественном участии STING в реализации сигналов от одного из рецепторов (CD3 или CD28), но не одновременном, поскольку Т-клетки от STING-дефицитной линии мышей при одновременной активации CD3 и CD28 могут пролиферировать. Но, ни о каком аддитивном эффекте при активации TCR и использовании DMXAA говорить не приходится. Таким образом, STING-/- и WT Т-клетки проявляли сходные уровни фосфорилирования ERK и p65 после стимуляции CD3 и CD28, то есть удаление STING не приводит к серьезным дефектам активации. Для исключения основных различий в развитии Т-клеток, сравнили CD4-CD8-, CD4+ CD8+ тимуса и периферических лимфатических узлов (pLN), одиночные положительные популяции Т-клеток CD4+ и CD8+, а также уровни экспрессии TCR в CD4+ и CD8+. Значительных различий между Т-клетками дикого типа и STING-/- мышами обнаружено не было. Также не обнаружено различий в интактных, регуляторных клетках и клетках памяти у диких и STING-/- мышей, все демонстрировали сравнимые уровни CD69 и CD25 после активации TCR. Вторая серия экспериментов была посвящена изучению регуляторных способностей DMXAA-активированных Т-клеток. В данной части эксперимента использовали IFNR-дефицитных мышей, что позволило установить роль аутокринного интерферона на TCR-индуцированную пролиферацию Т-клеток. Интерферон способен ингибировать TCR-пролиферацию, а IFNR-дефицитные мышиные Т-клетки не способны к пролиферации, поэтому предполагалось, что воздействие на STING в данном варианте будет оказывать внутренний IFN. Тем не менее, эксперименты показали, что в отличие от макрофагов, аутокринный IFN не влияет на передачу сигнала через STING в Т-клетках. Таким образом, хотя активация STING в Т-клетках запускает множество путей метаболизма, подобных описанным в клетках врожденного иммунитета, она также имеет уникальные воздействия, которые могут привести к специфичным для Т-клеток эффектам. Показано, что pLN T-клетки разрастались одинаково в ответ на стимуляцию TCR, DMXAA блокировал это размножение в WT, но не в STING-/- T-клетках. IFNAR-/- Т-клетки также не размножались в присутствии DMXAA, не реагируя на аутокринный IFN-I. Поэтому далее была изучена STING-зависимая активация IFN и индукция апоптоза в Т-клетках. Секвенирование РНК интактных WT B6 и STING-/- CD3+ Т-клеток, стимулированных анти-CD3 и анти-CD28, только DMXAA, или тем, и другим одновременно, показало, что DMXAA увеличивал экспрессию ISG в клетках дикого типа, но не в STING-/- Т-клетках. Анализ сигнальных путей показал STING-зависимое увеличение апоптоза и каспазного каскада, уменьшение индукции IL-2 и остановку клеточного цикла. Хотя активация TCR сама по себе в WT B6 и STING-/- Т-клетках вызывала увеличение активности антиапоптотических (BCL2) и уменьшение активности проапоптотических генов (BAX), введение DMXAA меняло эту картину. Активация STING привела к подавлению BCL2 и повышению BAX в T-клетках дикого типа. Поразительно, что ни один из этих путей не активировался DMXAA в макрофагах: сравнение между макрофагами и Т-клетками показало большее сходство между STING-/- Т-клетками и макрофагами, чем STING-/- и Т-клетками дикого типа. Предположили, что это может быть связано с тем, что макрофаги должны быть устойчивы к STING-инициированному апоптозу для инициации дальнейших иммунных реакций. Одним из механизмов DMXAA STING-инициированного апоптоза может быть накопление в ЭПР белков с дефектной структурой, поскольку обнаружили значительное повышение экспрессии генов, участвующих в реакциях сворачивания белков, в частности Bip / HSPA5 и GADD34. Далее TCR-активированные Т-клетки, обработанные DMXAA, были окрашены аннексином V и йодидом пропидия (PI). Добавление DMXAA к активированным анти-CD3 и анти-CD28 WT T-клеткам приводило к появлению высокого числа аннексин V+ PI+ клеток по сравнению с их аналогами без DMXAA, STING-/- Т-клетки были по большей степени аннексин V- PI-. Затем мы обработали клетки ингибитором панкаспазы zVAD-fmk и/или ингибитором некроптоза Nec1, чтобы охарактеризовать тип гибели. Результаты показали, что только при использовании комбинации ингибиторов, гибель Т-клеток была остановлена, что указывает на возможное переключение (в зависимости от условий) процессов гибели Т-клеток, обработанных DMXAA, с апоптоза на некроптоз. В третьей серии экспериментов изучена роль Т-клеточного ответа на DMXAA in vivo. Проведено внутривенное введение мышам DMXAA в течение двух дней с последующей изоляцией Т-клеток и их детальным анализом. Изменений в популяциях интактных Т-клеток и Т-клеток памяти из периферических лимфоузлов и селезенки, указывающих на их гибель, отмечено не было, но констатировался IFN-I ответ. Поэтому реакция Т-клеток на активацию STING in vivo требует дальнейшего детального изучения, а результаты нашего исследования еще раз доказывают то, что требуется тщательное изучение влияния агонистов STING на Т-клетки всякий раз, когда эти агонисты проверяются на возможный терапевтический эффект. Параллельно эксперимент был выполнен на мышах, зараженных Listeria monocytogenes. Данный паразит является внутриклеточным, высвобождает ДНК в процессе внутриклеточного размножения. Результаты показали, что листериоз провоцирует выработку циклических динуклеотидов, которые активируют STING, вызывают синтез IFNβ, негативно влияющего на развития клеточного иммунитета. Путь STING/IFNβ в данном контексте используется для дифференцировки Т-регуляторных лимфоцитов, повышения толерогенного микроокружения и снижения гипервоспаления в организме, т.е. бактерия пытается «обмануть» иммунную систему. Следует отметить, что в Т-клетках, имеющих мутацию в гене Tmem173, продукция IFNβ в ответ на инфицирование Listeria monocytogenes резко снижена. У STING-/- мышей по сравнению с диким типом обнаружен более сильный защитный иммунитет на инфицирование Listeria monocytogenes. Полученные результаты говорят о том, что STING-/- мыши благополучно запускают воспалительный ответ, размножение Т-клеток не прекращается, большая часть Listeria monocytogenes элиминируется, данные Т-клетки прекрасно реагируют на цитозольную (инфекционную) ДНК. Таким образом, исследования, проведенные нами в рамках проекта, доказывают, что STING имеет свои собственные уникальные функциональные эффекты в клетках адаптивного иммунитета, не свойственные таковым в клетках врожденного иммунитета. Все запланированные исследования данного этапа выполнены в полном объеме. Информационные ресурсы сети Интернет: http://rscf.ru/ru/node/2371 http://openscience.news/posts/935-rossiyskie-uchenye-issledovali-sting-oposredovannuyu-immunoterapiyu-raka https://scientificrussia.ru/articles/biohimiki-iz-rossii-i-ssha-obnaruzhili-pobochnyj-effekt-novogo-metoda-immunoterapii-opuholej http://fano.gov.ru/ru/press-center/card/?id_4=38342 http://www.sib-science.info/ru/institutes/uchenye-belok-sting-mozhet-21072017 http://www.nanonewsnet.ru/news/2017/belok-sting-mozhet-izmenit-immunoterapiyu-raka

 

Публикации

1. - Российские ученые установили, что белок STING может изменить иммунотерапию рака Новости Сибирской науки, 24 июля 2017 (год публикации - ).

2. - Биохимики из России и США обнаружили побочный эффект нового метода иммунотерапии опухолей Научная Россия, 18 июля 2017 (год публикации - ).

3. - Российские ученые исследовали STING-опосредованную иммунотерапию рака Открытая наука, 03 июля 2017 (год публикации - ).

4. - Белок STING может изменить иммунотерапию рака Nano News Net, 03 июля 2017 (год публикации - ).

5. - Российские ученые выяснили, что белок STING может изменить иммунотерапию рака Пресс-центр ФАНО России, 21 июля 2017 (год публикации - ).

6. - Ученые из России раскрыли побочные эффекты нового вида иммунотерапии рака РИА Новости, 03 июля 2017 (год публикации - ).

7. Bridget Larkin, Vladimir Ilyukha, Maxim Sorokin, Anton Buzdin, Edouard Vannier and Alexander Poltorak Cutting Edge: Activation of STING in T Cells Induces Type I IFN Responses and Cell Death The Journal of Immunology, Vol. 199. Issue 2. P. 397-402. (год публикации - 2017).

8. Ilyukha V.V., Schworer S., Poltorak A. Inflammatory Response Regulated a Kinase Activity of RIP1 Kinase Acta Naturae, Vol. 9. №1. Р. 81 (спецвыпуск) (год публикации - 2017).

9. Vladimir Ilyukha, Alexander Poltorak Genetic Analysis of DNA-responses Cytokine, Vol. 100. P. 171 (год публикации - 2017).