Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. Впервые осуществлен ультразвук-ассистируемый синтез стабильного гидрозоля магнетита при нейтральных значениях pH и без использования стабилизирующих добавок и пептизаторов. 2. Полученные гидрозоли были использованы для энтрапирования широкого спектра высокомолекулярных соединений. В результате соконденсации получены магнитные биокомпозиты, содержащие нерелизируемые биомолекулы. Исследование механизмов активации данных систем показало, что несмотря на полную локализацию активных молекул в объеме ксерогелей они способны проявлять свою каталитическую функцию, существенно возрастающую с ростом температуры. Многие энтрапированные ферменты показывают рост каталитической активности вплоть до температур, при которых нативные формы денатурируют в растворе, полностью теряя свою первоначальную активность. Результаты подкреплены фундаментальными квантово-химическими расчетами. 3. Впервые получены керамические тромболитические материалы на основе магнетита и бемита. В качестве тромболитических ферментов исследовались как фибрин-специфичные активаторы плазминогена урокиназного типа, так и неспецифичная стрептокиназа. Исследована поведенческая модель взаимодействия энтрапированных форм ферментов с высокомолекулярным плазминогеном. Объяснен механизм активации фибринолизиса. 4. Тромболитические материалы были получены как форме тонких керамических покрытий для сосудистых имплантатов, так и в форме стабильных наноколлоидов для инъекций. Показано, что эффективность магнитотромболитической терапии может превышать несколько тысяч раз по сравнению с обычными ферментами.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1.В ходе реализации данного этапа проекта особое внимание было уделено способу получения тромболитических и антиатеросклеротических магнитных коллоидов. В частности, большое внимание было обращено на разработку высокоэффективных методов получения наносфер магнетита, заполненных активным препаратом. Для этой цели был впервые описан способ получения магнетитового геля прямым гелеобразованием гидрозоля магнетита, что позволило осуществить получение наносфер, прибегая к использованию метода микроэмульсий. Гелеобразование происходит под влиянием депротонирующего агента и приводит к образованию плотного и сильномагнитного геля. Полученный гидрогель состоит из 10 нм магнетитовых наночастиц, связанных межчастичными связями Fe-O-Fe, и демонстрирует высокую степень биосовместимости в соответствии с исследованием цитотоксичности, проведенным на клеточных линиях HeLa и MSC. Наносферы магнетита содержащие тканевый активатор плазминогена в дальнейшем подвергались испытанию на тромболизис. Процесс тромболизиса начинался по истечении 30 минут после контакта компонентов, активизируя взаимодействие плазмина с фибрином. Вместе с подходом, подразумевающим использование микроэмульсий, был разработан новый метод получения магнитных наносфер, получаемых за счет контролируемой дестабилизации устойчивого гидрозоля магнетита, приводящий к образованию агрегатов различного размера с последующей их стабилизацией цитратной оболочкой. Полученные агрегаты проявляют быстрый магнитный отклик и обладают низкой цитотоксичностью (проверенной на клеточных линиях Hela), что открывает широкие перспективы разработанных систем в медицине. 2.Для разработки потенциальных агентов для борьбы с атеросклеротическими бляшками, были проведены работы по созданию магнитных золь-гель композитов на основе каркасной матрицы магнетита и ферментов, обладающих протеазной и гидролазной активностью. В качестве ферментов были выбраны коллагеназа, трипсин и папаин. Помимо ферментативного лизиса бляшек, рассматривался вопрос о возможном применении фотосенсибилизаторов, позволяющих генерировать активные формы кислорода при облучении светом, что приводит к гибели и лизису клеток, подвергнутых воздействию. Для создания магнитоуправляемых фотосенсибилизаторов были выбраны два вещества: применяемый в клинической практике хлорин Е6 и его полусинтетическое производное борфторхлорин. По результатам исследований был также разработан протокол инкубирования фрагментов атеросклеротических бляшек. Разработанная методика позволяет сохранять структуру и состав атеросклеротических бляшек в течение как минимум 21 дня после операции. Для исследования антиатеросклеротической активности к постоперационным бляшкам добавляли коллоидный раствор, содержащий 1 % масс. наночастиц магнетита с энтрапированным фотосенсибилизатором хлорин Е6, после чего проводили облучение лазером с длинной волны 630 нм и мощностью 50 мВт. Измеренная токсичность свободного фотосенсибилизатора оказалась примерно в 2 раза выше, чем для иммобилизированной формы, однако, будучи сконцентрированным при помощи магнитного поля гибридный препарат демонстрирует цитотоксичность близкую к свободному фотосенсибилизатору. Исследование изменений структуры атеросклеротической бляшки выполнялось путем воздействия на них иммобилизированного фотосенсибилизатора с последующим гистологическим исследованием тонких срезов биоткани. Исследование структуры срезов атеросклеротических бляшек показало, что фрагмент подверженный воздействию фотодеструкции демонстрирует более рыхлую структуру, которую можно отнести к следствию токсического воздействия на клетки гладкой мускулатуры в структуре бляшки. 3.Для получения магнитоуправляемого гемостатического препарата использовался разработанный в ходе первого этапа выполнения проекта магнетитовый гидрозоль. Энтрапирование тромбина в магнетитовую золь-гель матрицу было осуществлено методом контролируемой соконденсации с наночастицами магнетита. Полученные данные свидетельствуют о том, что время до гемостаза на системе с наведенными магнитным полем наночастицами оказалось в несколько раз меньше по сравнению с контролем. Еще более выдающиеся данные были получены при измерении массы потерянной крови: в 15.5 раз меньше по сравнению с контролем при соответствующем содержании фибриногена в крови. По результатам эксперимента показано, что гемостатический коллоид сам по себе способствует ускорению процесса гемостаза, но при этом не вызывает системной коагуляции крови. Вместе с тем, его локализация за счет наложения внешнего магнитного поля приводит к усилению гемостатической активности в требуемой области, что само по себе открывает новые горизонты для малоинвазивной гемостатической терапии. 4. В ходе выполнения данного этапа был также представлен универсальный метод по ренатурации ферментов. Подход основан на использовании высокозаряженных наночастиц, которые после электростатического взаимодействия с денатурированными молекулами белка, предотвращают их агрегацию и делают процесс рефолдинга контролируемым и управляемым. Метод показал высокую эффективность, способность ренатурировать сразу несколько ферментов in situ затратив минимальный промежуток времени и количество реактивов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения проекта были получены принципиально новые тромболитические магнитные наноконтейнеры с возможностью точного контроля размера. Синтез наноконтейнеров включал в себя три стадии: образование стабильной микроэмульсии, гелеобразование гидрозоля магнетита и промывка получаемых сфер. Образованные сферы обладали хорошо развитой пористой структурой с высокой удельной площадью поверхностью. В качестве тромболитических ферментов изучали прямой активатор плазминогена урокиназного типа и непрямой активатор стрептокиназного типа. При формировании наносфер в присутствии ферментов они надежно удерживались в объеме материала. Биосовместимость полученных материалов была исследована на клеточных линиях HeLa и мезенхимальных стволовых клетках, в результате было показано, что концентрации до 260 мкг/мл являются малотоксичными. Цитотоксичность не превышала таковую для наночастиц магнетита, что говорит о высокой биосовместимости синтезированных гибридных систем. Предварительная оценка ферментативной активности гибридных композитов проводилась при помощи колориметрических тестов по измерению уровня активного плазмина с использованием хромогенного субстрата. Было установлено, что препарат на основе стрептокиназы, как в тестах на специфическую активность, так и в случае с реакцией на хромогенный субстрат, оказался малоактивен, и не вызывал разрушения модельных сгустков даже через 24 часа инкубирования. Для исследования активности наносфер с урокиназой, были приготовлены искусственные тромбы из цельной человеческой крови. Без магнитного нацеливания, тромболитический композит оказался в 11 раз менее эффективным по сравнению с эквивалентным количеством свободного фермента, однако при наложении внешнего магнитного поля происходило увеличение скорости разложения тромба в среднем на 430% вследствие повышения локальной концентрации действующего вещества. При этом профиль кинетической кривой лизиса свидетельствовал о том, что инкапсулированный фермент обладал намного большей стабильностью в присутствии ингибиторов, что говорит о повышении стабильности урокиназы в составе наноконтейнеров и возможности создания на их основе тромболитических препаратов пролонгированного действия. В рамках гранта был также создан тромболитический препарат, состоящий исключительно из биосовместимых компонентов: тромболитического препарата урокиназы, адсорбированной на магнитные наночастицы, покрытые гепарином (ГП) в качестве кросслинкера. Главным отличием от ранее описанного метода по созданию тромболитических наноконтейнеров является упрощенный способ синтеза. С помощью созданных магнитных носителей удалось увеличить эффективность действия урокиназы как минимум в 20 раз в терминах скорости времени растворения тромба. Адсорбция урокиназы на магнетит проводилась посредством промежуточного линкера – гепарина. Гепарин увеличивает гидрофильность поверхности магнетита, биосовместим, а также проявляет антикоагулянтные свойства. В нашей композиции нам удалось добиться такого сочетания гепарина и урокиназы, при котором гепарин не проявляет своих ингибирующих свойств. Факт ингибирования урокиназы гепарином малоизвестен, но тем не менее, имеет место быть. Это важный факт, который в данный момент не учитывается при совместном использовании антикоагулянтов и урокиназы в клинической практике. Проведенный эксперимент по изучению влияния магнитного нацеливания показал, что скорость растворения тромба при накладывании магнитного поля возрастает минимум в 2 раза. Снижение площади тромба на 60% достигалось за 35 минут с использованием только УК, за 12минут с использованием МГ@УК и 7 минут с использованием МГ@УК и наложением магнитного поля. Препарат также не вызывает присущих тромболитикам геморрагических осложнений и отличается широтой терапевтических доз.