Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В течение 2016 года работа проводилась в рамках трех блоков задач: 1. Поиск и характеристика ферментов целлюлозо-деградирующего комплекса; 2. Исследования структурно-функциональных особенностей ферментов из мицелиального гриба Fusarium proliferatum LE1; 3. Изучение биологической активности образцов сульфатированных полисахаридов на трех клеточных линиях. В 2015 году после публикации черновика генома G. candidum 3C (Genome Announc. 2014 Oct 2;2(5). pii: e00956-14. doi: 10.1128/genomeA.00956-14), ранее использованного нами в качестве продуцента целлобиогидролазы (Borisova et al. FEBS J. 2015; 282(23):4515-37. doi: 10.1111/febs.13509), при сравнении геномных последовательностей из аннотированного генома G. candidum CLIB 918 (ATCC 204307; Morel et al. Sci Rep. 2015 Jun 25;5:11571. doi: 10.1038/srep11571), появились сомнения о правильности идентификации таксономического положения гриба G. candidum 3C, т. к. были обнаружены множественные различия двух этих штаммов. В связи с этим нами было принято решение повторно идентифицировать мицелиальный гриб, известный как G. сandidum 3С. Для этой цели были выбрана стратегия, основанная на комбинировании методов молекулярной филогенетики вместе с микробиологическими методами. В первую очередь, в геноме были найдены специфические для аскомицетовых грибов генетические маркеры: ITS (internal transcribed space), 18S SSU и 28S LSU (18S small subunit и 28S large subunit ribosomal DNA), RPB2 (RNA polymerase II subunit). Затем, с использованием инструментов BLAST были обнаружены схожие нуклеотидные последовательности других организмов. Далее данные были подготовлены для анализа в программе Unipro UGENE с помощью алгоритмов множественного выравнивания из программных пакетов TCOFFEE. Филогенетический анализ проводился в программе RAxML после тестирования моделей нуклеотидных замен данных в программе jmodeltest2. Первым результатом анализа набора филогенетических деревьев стал вывод о справедливости нашей гипотезы о разном происхождении исследуемого микроорганизма и представителей рода Geotrichum. Дальнейший анализ, основанный на всех доступных последовательностях маркера 18S SSU для класса Leotiomycetes, позволил предположить, что данный гриб следует относить к представителям рода Scytalidium, мицелиальных грибов класса Leotiomycetes. Был осуществлен мультигенный анализ с использованием специфических генетических маркеров 18S SSU, ITS, 28S LSU, RPB2, приведший нас к предварительному выводу о том, что исследуемый микроорганизм принадлежит к виду Scytalidium album. Был проанализирован набор аминокислотных последовательностей генов, кодирующих ферменты лигноцеллюлолитической системы, размещенные в БД CAZy (www.cazy.org/), и нуклеотидных последовательностей целевого генома Scytalidium sp. (бывш. G. candidum). На основе анализа сформирован предварительный список предполагаемых генов, кодирующих ферменты лигноцеллюлитического комплекса, найденных в геноме мицелиального гриба Scytalidium sp.: найдены 9 последовательностей, кодирующих бета-глюкозидазы из сем. 1, 2 гена, кодирующих бета-галактозидазы (сем. 2), 2 - бета-N-ацетилглюкозаминидазы, (сем. 3); 3 - мультифункциональные бета-ксилозидазы (сем. 3); 2 - бета-глюканазы и 1 - целлобиогидролаз (сем. 7); 3 - эндо-ксиланазы из сем. 10; 9 - эндо-ксиланазы из сем. 11; а также представители семейств гликозидгиролаз 15 (глюкоамилаза), 16 (гиалуронидаза, эндо-глюканазы и эндо-бета-галактаназа), и 31 (альфа-глюкозидазы). Кроме того, обнаружены представители семейств вспомогательных ферментов (Auxiliary Activities): лакказы (сем. АА1), алкоголь-оксидазы и целлобиоздегидрогеназы (сем. АА3 и АА8). Из культурального фильтрата штамма Trichoderma atroviride IMI 206040 в результате разработанной схемы очистки был получен ферментный препарат с целлобиогидролазной активностью. После обработки папаином был получен каталитический домен ЦБГ и обе формы фермента были идентифицированы масс-спектрометрическим методом и отнесены к 7-му семейству гликозидгидролаз по классификации CAZy (www.cazy.org/). Белковая последовательность ЦБГ из T. atroviride IMI 206040 была депонирована в БД Genbank под номером EHK46168.1. Были получены пригодные для сбора диффракционных данных кристаллы выделенного каталитического домена ЦБГ из T. atroviride, TatCel7A_CD. Обе структуры, апо-структура (TatCel7A_CD apo) и структура ЦБГ с лигандом целлотриозой (TatCel7A_CD С3), были получены с разрешением 1.7 Å и отнесены к пространственной группе P21. Было показано, что две молекулы целлотриозы связываются в активном центре фермента в субсайтах -6/-5/-4 и +1/+2/+3, что указывает на непродуктивное связывание этого субстрата в активном центре целлобиогидролазы. Получены предварительные сравнительные данные по термостабильности четырех целлобиогидролаз, точнее их каталитических доменов (TatCel7A_CD, ThaCel7A_CD, TreCel7A_CD и GcaCel7A_CD (Borisova et al., FEBS J. 2015). Обнаружено, что GcaCel7A_CD демонстрирует наилучшую способность к рефолдингу после тепловой обработки. Была получена полная нуклеотидная последовательность гена арилсульфатазы и определено, что ген арилсульфатазы размером в 1760 п.н. состоит из двух экзонов и одного интрона. Кодирующая последовательность ДНК, соответствующая кДНК, была внесена в базу данных GenBank под номером KX826945. Белок, кодируемый данным геном, состоит из 552 аминокислот, его расчётная молекулярная масса составляет 63 кДа. Также в его аминокислотной последовательности был обнаружен консервативный пептид Cys-X-Pro-X-Arg, указывающий на то, что данный белок, действительно, является сульфатазой. Проведен детальный анализ биохимических и физико-химических свойств рекомбинантной арилсульфатазы и выяснены ее функциональные особенности. Стандартными методами молекулярной биологии было определено, что ген мажорной α-L-фукозидазы состоит из 2092 пар оснований и включает в себя пять интронов. Нуклеотидная последовательность области, кодирующей белок, которая соответствует мРНК, депонирована в GenBank (номер доступа GenBank: KX589258). Закодированный геном мажорной α-L-фукозидазы препротеин состоит из 607 аминокислот, в том числе из 20-остатков сигнального пептида. Стандартными методами молекулярной биологии было определено, что ген минорной альфа-L-фукозидазы, обнаруженной в геноме F. Proliferatum, имеет размер 1620 п.н. и не содержит интронов. Кодирующая последовательность ДНК была внесена в базу данных GenBank под номером KY250433. Белок, кодируемый данным геном, состоит из 541 аминокислоты и имеет расчётную молекулярную массу 61 кДа. Анализ аминокислотной последовательности фермента показал, что данный белок содержит сигнальную последовательность, т. е. является секреторным. На данный момент получена конструкция экспрессионного вектора, содержащая ген минорной альфа-L-фукозидазы. Мы показали, что исследуемая мажорная альфа-L-фукозидаза способна переносить L-фукозный мотив на гидроксильную группу сахаридной части пара-нитрофенил-гликозидов, использованных для реакций трасгликозилирования в качестве акцепторов. В ЯМР-экспериментах с исследованием трансгликозилирующей активности мажорной альфа-L-фукозидазы с алифатическими спиртами были определены значения эффективности (е) реакций трансгликозилирования для каждого акцептора. Согласно полученным данным, наиболее высокое значение отношение констант скоростей относится к реакции с 1-пропанолом в качестве акцептора, что может говорить о сильном гидрофобном взаимодействии последнего с активным центром фермента. Был осуществлен сравнительный анализ биологической активности полученных образцов сульфатированных полисахаридов на клеточных линиях HeLa G-63, Hep G2 и Chang liver. Сравнение действия фракций фукоидана на клетки показало, что фракции, характеризующиеся повышенным содержанием сульфатов, преимущественным расположением сульфогрупп в положении С4 фукозного остатка и низким содержанием уроновых кислот, ингибировали пролиферацию клеток наиболее активно. Среди сравниваемых клеточных линий наибольшую чувствительность к фукоидану из F. vesiculosus проявили опухолевые клетки печени Hep G2, тогда как немалигнизированные клетки Chang liver оказались наименее восприимчивы.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Было определено новое таксономическое положение криптического вида мицелиального гриба, ранее известного, как Geotrichum candidum 3C, являющимся эффективным продуцентом лигноцеллюлолитических ферментов. На основе анализа данных поискового алгоритма BLAST для последовательностей филогенетических маркеров 18S SSU, 28S LSU, RPB2, ITS и построенного мультигенного филогенетического дерева с использованием маркеров 18S SSU, ITS и RPB2, а также подробных исследований морфологических характеристик исследуемого штамма и его биохимических особенностей с использованием микроскопии, стандартных методов культивирования микроорганизмов и сравнительных исследований представителей рода Scytalidium было предложено называть его Scytalidium candidum comb. nov. 3C. Штамм микроорганизма депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (RCAM) под регистрационным номером RCAM04653. В результате структурной аннотации генома S. candidum 3C и последующей функциональной аннотации CAZy-мов (углевод-активных ферментов по классификации CAZy, http://cazy.org) были обнаружены предполагаемые последовательности генов, кодирующих такие белки. Установлено, что общее количество генов, кодирующих CAZy-мы, составляет 197, из них идентифицировано 110 гликозидгидролаз, 52 гликозилтрансферазы, 29 окислительных ферментов и 6 углеводэстераз. Кроме того, было найдено 25 нуклеотидных последовательностей, кодирующих субстрат-связывающие домены. Установлено, что в условиях культивирования S. candidum 3C на среде с бумагой секретируются, в основном, целлюлазы, включающие эндо-β-1,4-глюканазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы. Установлено наличие пептидов, идентичных 39 гликозидгидролазам, трем белкам без известной ферментативной функции, принадлежащим этой же категории семейств, 11 окислительным ферментам и трем гликозилтрансферазам. С помощью специально синтезированных тио-субстратов выявлено шесть гемицеллюлаз: четыре β-ксиланазы из 10-го семейства и две β-глюканазы из 7-го и 55-го семейств гликозидгидролаз. Обнаруженный набор нуклеотидных последовательностей ферментов лигноцеллюлолитического комплекса позволяет утверждать, что мицелиальный гриб S. candidum 3С конкурентоспособен по своей эффективности с такими известными продуцентами подобных ферментов, как Trichoderma reesei и Aspergillus niger. Полученные нами результаты дают возможность более подробно и направленно исследовать комплекс ферментов мицелиального гриба S. candidum 3С, разрушающих полисахариды растительной стенки. Выделены и детально охарактеризованы три целлобиогидролазы (ЦБГ) из штаммов рода Trichoderma. Установлено, что первоначальный гидролиз бактериальной целлюлозы был быстрее с TatCel7A, чем ThaCel7A или TreCel7A. Для выявления корреляций структуры и функции ферментов ЦБГ из штаммов рода Trichoderma были применены подходы структурного и вычислительного анализа. Три фермента продемонстрировали небольшие, но существенные вариации в мотивах туннель-образующих петель А1 и А3 в области активного сайта. Методы молекулярной эволюции показали, что целлобиогидролазы из седьмого семейства гликозидгидролаз имеют высокую консервативность аминокислотных последовательностей, необходимую для осуществления их основной функции – деградации целлюлозы, в то время как мишенями эволюции являются участки первичной структуры, поддерживающие петли, образующие целлюлоз-связывающий туннель. Было сделано предположение, что комбинация мотивов петли A1 и A3 является основным определяющим фактором эффективности целлобиогидролаз в деградации целлюлозы, в то время как гибкость петли A4 может повлиять на связывание на сайте продукта. Из культуральной жидкости мицелиального гриба S. candidum 3C была выделена и очищена до гомогенного состояния секретируемая β-ксиланаза, имеющая две основные формы гликозилирования. На основании анализа аминокислотной последовательности фермент был классифицирован, как представитель 10 семейства гликозидгидролаз. Установлено, что фермент обладает наибольшей активностью в очень кислом диапазоне рН 3 — 3,5 и сохраняет более 90 % активности в диапазоне рН 3 - 7. Анализ продуктов реакции трансгликозилирования с использованием о-нитрофенил ксилобиозида в качестве субстрата методом ТСХ и ВЭЖХ, показал появление о-нитрофенил ксилоолигосахаридов с большей степенью полимеризации, чем исходный субстрат возникающих в результате трансгликозилирующей активности фермента. Методами электрофореза, вестерн-блота и изофокусирования показано, что с течением времени меняется не только удельная активность рекомбинантной сульфатазы из Fusarium proliferatum LE1, но и его масса и изоэлектрическая точка. Установлено, что при термообработке белка не происходит его диссоциация на субъединицы, а его инактивация происходит за счёт необратимых структурных изменений, происходящих целиком в тетрамере. Установлено, что холин-сульфат и 2-сульфоэтиламмоний являются субстратами для исследуемого фермента. При этом удельная активность рекомбинантной сульфатазы в гидролизе холин-сульфата составила 3.79·10-2 ед/мг. Показано, что замена цистеина, расположенного в активном центре сульфатазы, на аланин и треонин приводит к потери каталитической активности фермента, что позволяет сделать вывод о необходимости данной аминокислоты для осуществления катализа. Разработана схема получения минорной рекомбинантной альфа-фукозидазы из Fusarium proliferatum LE1 и определены ее основные физико-химические характеристики. Осуществлен сравнительный анализ биологической активности исходного фукоидана и частично деполимеризованных образцов на клеточных линиях Hep G2 и Chang liver. Было показано, что наибольшую эффективность в отношении обеих клеточных линий проявлял образец низкомолекулярного фукоидана, полученный после гидролиза в течение 5 мин. Как исходный фукоидан, так и низкомолекулярные образцы ингибируют пролиферацию обеих клеточных линий после 48 ч культивирования в их присутствии, причем по сравнению с немалигнизированными клетками Chang liver опухолевые клетки печени Hep G2 проявили большую чувствительность к фукоидану из F. vesiculosus. Показано, что уменьшение молекулярного веса полисахаридов при практически одинаковой степени сульфатирования способствует увеличению противоопухолевой активности.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение 2018 г. были выполнены работы в рамках трех блоках задач. В частности, в рамках работы по целлюлолитическим ферментам (Блок 1) в результате разработанной схемы выделения и очистки была получена новая высокоочищенная бета-ксиланаза, ранее обнаруженная в геноме мицелиального гриба Scytalidium candidum 3C (ScXynA) [Pavlov et al. Biochemistry (Moscow), (2018 г.) 83(11), 1399-1410]. Было установлено, что фермент представляет собой димерный белок с молекулярной массой 38 ± 5 кДа для каждой субъединицы, состоит из 369 аминокислот, содержащих 21 остаток сигнального пептида, имеет три предполагаемых сайта N-гликозилирования и один потенциальный сайт O-гликозилирования. Было установлено, что фермент ScXynA способен работать в диапазоне кислых значений рН и чрезвычайно стабилен в диапазоне рН 2,6-4,5. Обнаружено, что фермент ScXynA катализирует гидролиз различных ксиланов, неактивен по отношению к Авицел и CMC-целлюлозам, но катализирует гидролиз p-нитрофенил-β-D-целлобиозида и p-нитрофенил-β-D-ксилобиозида. Ранее обнаруженная трансгликозилирующая способность бета-ксиланазы в синтезе орто-нитрофенил бета-ксилоолигосахаридов с различной степенью полимеризации была тщательно исследована и установлены оптимальные условия для проведения этой реакции с целью получения максимального выхода целевых олигосахаридов. Структуры синтезированных орто-нитрофенил-ксилоолигосахаридов были уточнены методом ЯМР-спектроскопии. В общей сложности, в результате оптимизированного ферментативного синтеза, катализируемого фрементом ScXynA, мы получили 30% oNP-β-ксилололигосахаридов со степенью полимеризации (с.п.) 4-10. С наивысшим выходом (18,5%) был получен оNP-β-ксилотетраолигосахарид, его структура была идентифицирована с помощью ЯМР-спектроскопии. С целью объяснить функциональные особенности новой бета-ксиланазы компьютерными методами была построена пространственная модель фермента по гомологии с простарнственными структурами близкородственных ксиланаз 10-го семейства CAZy. Было установлено, что у ксиланаз сем-ва GH10 субсайты -2, -1 и +1 очень консервативны в конформационном плане, основные различия между белками вдоль связывающей щели находятся в -3 и +2, +3, +4 субсайтах. Более открытый -3 субсайт делает вход для лиганда удобным, что также важно и для размещения группы o-NP. Мы предположили, что перенос донора на акцепторный сахарид обусловлен более открытой конфигурацией связывающей щели, в то время как участок гидролиза -1, + 1 достаточно закрыт ее контуром. Таким образом, полученные результаты оказываются крайне важными для понимания механизма катализа данной ксиланазой, что, в свою очередь, делает перспективы практического применение изучаемого фермента высоко вероятными. В рамках исследований ферментов из мицелиального гриба Fusarium proliferatum LE1 были проведены работы по трем ферментам: сульфатазе и двум альфа-L-фукозидазам. В результате, используя ранее построенную теоретическую пространственную модель структуры рекомбинантной сульфатазы из F. proliferatum LE1 [Korban et al. Protein Eng Des Sel. 2017; 30(7):477-488. doi: 10.1093/protein/gzx033], были осуществлены мутации в аминокислотной последовательности белка для доказательства участия C-конца фермента в формировании тетрамера белка. По нашим предположениям, удаление аминокислот 501-558 должно было привести к удалению межбелкового интерфейса в центральном канале тетрамера и, следовательно, к экспрессии моносубъединичного белка; а замена глутаминового аминокислотного остатка в 101 положении на триптофан должна была создать помехи для связывания белковых частей на их комплементарных участках поверхности. В результате, анализ четвертичной структуры мутантных ферментов методом нативного гель-электрофореза показал, что делеция C-конца действительно приводит к экспрессии моносубъединичного белка, в то время как мутация Q101W приводит к экспрессии смеси тетрамера и мономера. Также было показано, что обе мутации приводят к потере детектируемой активности в реакции гидролиза пара-нитрофенил сульфата, проводимой при оптимальных условиях. Из полученных совокупных данных можно сделать вывод, что активность фермента в отношении п-нитрофенил сульфата зависит от множества факторов: условий, при которых выделялся и хранился белок, от его конформации и четвертичной структуры. Из этого же штамма был выделен ген, кодирующий α-L-фукозидазу FFpI, и клонирован в плазмиду pPICZα. В результате была получена высокопроизводительная индуцибельная система экспрессии α-L-фукозидазы путем трансформации P. pastoris данным вектором и разработана схема выделения и очистки фермента. Были определены основные физико-химические и биохимические характеристики α-L-фукозидазы FfpI, в частности, была определена константа конкурентного ингибирования Ki реакции гидролиза фукозой и получены значения кинетических параметров реакции гидролиза пропилфукозида в качестве субстрата. В ходе экспериментов была показана способность данного фермента катализировать реакцию трансгликозилирования, в результате которой происходит перенос фукозильного остатка на молекулы п-нитрофенил фукопиранозидом (pNPFuc), п-нитрофенил α-D-глюкопиранозидом (pNPGlc), пара-нитрофенил-α-D-галактозидом (pNPGal), пара-нитрофенил-β-D-ксилозид (pNPXyl), а также метанола, этанола и пропанола. Были построены модели двух α-L-фукозидаз (рекомбинантной (минорной) FFpI, мажорной FpFucA, дикого типа), обнаруженных в грибе F. proliferatum LE1, и проведен сравнительный анализ структуры данных ферментов. Для каждого из ферментов были определены каталитические аминокислотные остатки. По результатам докинга модельного субстрата pNPFuc в активном центре FFpI установлено, что а.к.о. E42 находится на расстоянии 4,7Å до гликозидной связи. Это позволяет сделать вывод, что данный остаток может выполнять роль кислотно-основного катализатора, что расходится с известными литературными данными. Кроме того, выявлены структурные различия активных центров FFpI и FpFucA, что может служить возможным объяснением разницы в функциональных свойствах. Очевидно, что полученные теоретические данные следует подвергнуть тщательной проверке в экспериментах с сайт-направленным мутагенезом. Ранее, в работе по характеристике α-L-фукозидазы дикого типа, выделенной из F. proliferatum LE1 (FpFucA) [Shvetsova, 2017, Biochimie, 132: 54-65], мы показали, что данный фермент обладает способностью катализировать реакции трансгликозилирования. В качестве акцепторов были использованы алифатические спирты, а также pNP-гликозиды. В работе 2018 г. в качестве донора и акцептора для реакции трансгликозилирования был использован пропилфукозид (FOP) в качестве акцептора без хромофорной метки для получения дифукозидов, не сульфатированных фрагментов фукоиданов, ферментативным способом с использованием свободного фермента FpFucA. Кроме этого, была выполнена иммобилизация FpFucA и полученный иммобилизованный ферментный препарат FpFucA был использован в реакциях гидролиза с хромогенным субстратом п-нитрофенил фукопиранозидом (pNPFuc), а также для реакций трансгликозилирования с FOP и pNPFuc в качестве донора и акцептора. Исходя из данных о структуре фукоиданов, в их дефрагментации могут принимать участие разные ферменты, специфичные к определённым участкам молекулы. Аналогично целлюлолитическому комплексу ферментов, данный комплекс может включать комбинацию гликозидгидролаз экзо- и эндо-действия: фукоиданазы (эндо-действия), фукозидазы (экзо- действия); сульфатазы, а также глюкозидазы, маннаназы, ксилозидазы, галактозидазы и галактаназы. Для ферментативного гидролиза фракции фукоидана из бурых водорослей Fucus vsiculosis мы использовали коктейль ферментов из лабораторной коллекции, включая фукозидазу FpFucA и сульфатазу. Мы установили, что при использовании FpFucA совместно с гликозидазами происходит отщепление и накопление трёх моносахаридов D-Xyl, L-Fuc и D-Gal со значительно более высоким количеством моносахарида L-Fuc по сравнению с вариантами обработки фукоидана только фукозидазой или коктейлем без фукозидазы. Данный факт подтверждает участие FpFucA в гидролизе молекулы фукоидана сложного состава. При этом, согласно полученным данным, можно высказать предположение о том, что при использовании FpFucA без дополнительных гликозидгидролизующих ферментов происходит освобождение лишь доступных боковых остатков L-фукозы, в то время как при использовании комбинации гликозидгидролаз происходит синергетическое действие каждого из используемых ферментов. Мы продолжили наши исследования влияния фукоидана на биологические объекты. В рамках этой работы различными методами была определена молекулярная масса образцов нативного и частично деполимеризованного фукодана. Было установлено, что в нативном фукоидане низкомолекулярные и высокомолекулярные фракции находятся в приблизительно одинаковом соотношении, после кислотного гидролиза и последующего диализа содержание низкомолекулярных фракций уменьшилось примерно в 3 раза. При помощи конфокальной микроскопии было детектировано, что фукоиданы интернализируются клетками протестированных клеточных линий посредством эндоцитоза, причем немалигнизированные клетки печени Chang liver быстрее усваивают фукополисахариды по сравнению с опухолевыми Hep G2. Было показано, что тогда как нативный и частично деполимеризованный образцы вызывают время-зависимую гибель опухолевых клеток Hep G2, гибель немалигнизированных клеток Chang liver практически не наблюдается. Также при помощи проточной цитометрии было показано время-зависимое внутриклеточное накопление полисахаридов для клеток обеих клеточных линий. При помощи двойного окрашивания клеток красителями Yo-Pro и иодидом пропидия было показано небольшое увеличение количества клеток Chang liver и HepG2 в стадии раннего апоптоза через 24 ч культивирования с обоими образцами фукоидана. Окрашивание клеток акридиновым оранжевым показало, что после обработки сульфатированными фукополисахаридами в клетках Chang liver и HepG2 наблюдается время-зависимое образование везикул с кислым содержимым, что дает основания полагать, что фукоидан вызывает образование аутофагосом. Независимо от вида фукоидана число везикулоподобных структур в клетках Chang liver превышает таковое в клетках HepG2. Таким образом, на основании проведенных экспериментов было сделано предположение, что обработка фукоиданами индуцирует разные типы программируемой клеточной гибели в зависимости от типа клеток — в немалигнизированных клетках печени Chang liver преимущественно детектировалась аутофагия, в опухолевых Hep G2 — апоптоз.