Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За период 2016 г. выполнены все поставленные задачи и получены следующие результаты: 1. На основе метода иммуно-ПЦР (иПЦР) с использованием надмолекулярных комплексов, состоящих из биотинилированной с 5`- и 3`-концов одноцепочечной ДНК и стрептавидина,  разработана система детекции природных IgM антител к дисахариду LeC. Чувствительность предлагаемого метода  составила 4 нг/мл (~100 пг в образце), что на два порядка выше по сравнению с рутинным ИФА; линейный диапазон определяемых концентраций  пригоден для количественного анализа содержания антител в сыворотке крови. Концентрация анти-LeC антител, определяемых в исследуемых сыворотках методом иПЦР, составила от 3 до 60 мкг/мл. Показано, что концентрация антител была выше (p≤0.0005) в сыворотках крови доноров (n=45; 31.3 ±4,3 мкг/мл) по сравнению с сыворотками больных с диагностированным раком молочной железы (n=38; 17.0 ±4,1 мкг/мл). По результатам работ по данному направлению опубликована статья:  Maerle A.V., D.V. Voronina, K.L. Dobrochaeva, O.E. Galanina, L.P. Alekseev, N.V. Bovin, S.K. Zavriev, D.Yu. Ryazantsev. Immuno-PCR technology for detection of natural human antibodies to Lec disaccharide. Glycoconjugate Journal 2016. In press. 2. Был сконструирован и синтезирован ряд ПЦР-зондов типа «молекулярный маячок» (Molecular Beacons, MB), имеющих одинаковую последовательность, комплементарную ДНК-матрице и различающийся по длине и GC-составу стебель. Длина стебля зондов варьировалась от 4 до 8 п.н. Все зонды содержали на 5`-конце краситель JOE в качестве флуорофора, присоединенный посредством гибкого 6-аминогексанол (6-aminohexanol, AH) и жесткого транс-4-аминоциклогексанол (trans-4-aminocyclohexanol, ACH) линкеров, и несли 1 или 2 тушителя флуоресценции BHQ1 на 3`-конце. С помощью количественной ПЦР при двух температурах отжига (55oC и 64oС) мы сравнили две серии зондов MB1-MB9, меченные флуорофорами FAM или JOE. Зонды, меченные JOE, демонстрировали в 2-3 раза большее увеличение флуоресценции по сравнению с аналогичными, меченными FAM. Флуоресценция зонда МВ7 с длинным стеблем (8 п.н.) была сопоставима как с FAM, так и с JOE. Для уменьшения начального уровня флуоресценции зондов с JOE мы сконструировали MB с двумя парами гасителей на их 3’-конце и сравнили их с аналогичными, меченными FAM. Зонд МВ9 с BHQ1-BHQ1 гасителями демонстрировал экстремально низкий фон флуоресценции как с FAM, так и с JOE, как с гибкими, так и с жесткими линкерами. Разгорание зондов при гибридизации также было идентично для МВ1-МВ8. У зонда МВ9, у которого была увеличена способность к гашению, наблюдалось низкое, хотя и достаточное, увеличение уровня флуоресценции в количественной ПЦР как при 55oC, так и при 64oС. Тем не менее, зонды с JOE, усиленные дополнительным BHQ1, оказались не намного лучше в количественной ПЦР по сравнению с МВ2 и МВ6 с одним гасителем (в отличие от зондов с FAM). Полученные результаты свидетельствуют о том, что применять зонды типа МВ9 для увеличения чувствительности кПЦР не имеет смысла, так как прирост разгорания недостаточно велик. В дальнейшем планируется использовать новые флуоресцентные красители. По результатам работ по данному направлению опубликована статья:  Tsybulsky D.A., M.V. Kvach, D.Y. Ryazantsev, .I.O. Aparin, A.A. Stakheev, I.A. Prokhorenko, Y.V. Martynenko, S.V. Gontarev, A.A. Formanovsky, T.S. Zatsepin, V.V. Shmanai, V.A. Korshun, S.K. Zavriev. Molecular beacons with JOE dye: Influence of linker and 3’ couple quencher. 2016. Mol. and Cell. Probes, V. 30, I. 5, PP. 285-290. 3. На основе реакции циклоприсоединения азидов и алкинов разработана методика синтеза ковалентно-связанного конъюгата антитело/одноцепочечный олигонуклеотид (60 н.). При этом антитело по аминогруппе модифицировали сульфотетрафторфениловым эфиром азидокапроновой кислоты, а олигонуклеотид с введенной NH2-группой модифицировали сукцинимидным эфиром дибензоциклооктина, после модификации компоненты смешивали в соотношении 1/10 (антитело/олигонуклеотид). Пока не удалось разработать оптимальную методику очистки конъюгата от непрореагировавшего олигонуклеотида и точно оценить выход. Но даже с не до конца очищенным конъюгатом удалось провести удачную иПЦР, что свидетельствует о том, что присоединение молекулы ДНК к антителу не влияет на его аффинность.  4. Были протестированы коммерчески-доступные антитела к IgE человека, по результатам ИФА в сэдвич-варианте с коммерческими антителами к IgE человека (SouthernBiotech, USA) на клонах мышиных моноклональных антител: BЕ5, 4G7 и 4H10 (Сорбент, Москва), были отобраны антитела клона ВЕ5, которые далее были очищены от примесей, биотинилированы и использованы далее как для проведения иммуно-ПЦР, так и для ИФА. 5. Были наработаны рекомбинантные аллегены клещей домашней пыли D. farina Der f 1 и Der f 2, грибов Alternaria alternata Alt a 1 и Aspergillus fumigatus Asp f 2 и Asp f 3. Получены  культуры клещей и грибов, из которых получены экстракты. 6. В ходе данной работы планировалось провести ИФА с образцами сывороток больных на IgE к аллергенам с целью отбора сывороток с высоким титром для дальнейшей работы. Было решено также провести ИФА для выявления и других иммуноглобулинов в сыворотках (IgA1, IgA2, IgG4) для прояснения вопроса о прямом (mu-epsilon) или последовательном (mu-gamma-epsilon, mu-alpha-gamma-epsilon) переключении B-клеток на производство IgE.  Показано различие в иммунном ответе у аллергиков с аллергией к клещам домашней пыли (КДП) и альтенарии. Сыворотки больных с аллергией к КДП показали существенное повышение титра Der f 2 специфичных IgE, но не IgG, IgG4, IgA1 и IgA2. Не было показано корреляции между разными Ig классами. Это свидетельствует о прямом mu-epsilon переключении B-клеток. Иммунный ответ против аллергена Alt a 1 оказался отличным от ответа на КДП. Он характеризовался высоким уровнем продукции IgE и IgG4, корреляцией между уровнями IgE и IgA2, а также зависимым от возраста повышением уровня Alt a 1 специфичного IgG, что не сказывается на образовании IgE. Титры IgE и IgA2 антител, а также локализация генов, кодирующих ε/α2, свидетельствуют о прямом mu-epsilon переключении и позднее о mu-epsilon-alpha2 переключении классов. Эти результаты могут объясняться двумя независимыми иммунными ответами, один из которых аллергический, инициированный за пределами центральных органов иммунной системы, в слизистой ткани, и другой - центральный - формируемый в лимфатических узлах, куда прорастающие конидии доставляются антиген-презентирующими клетками. Наши результаты показывают, что эти два типа ответа, не коррелируют и не влияют друг на друга. В данном случае наблюдается как прямое, так и последовательное переключение B-клеток. Таким образом, наше исследование показало высокую вероятность прямого mu-epsilon переключения классов Ig как в случае аллергии к альтернарии, так и к КДП, которое происходит, скорее всего, вне лимфатических узлов в слизистой оболочке носовой полости или бронхов.  По результатам, полученным в пунктах 4-6 была опубликована статья Svirshchevskaya E., G. Fattakhova, S. Khlgatian, D. Chudakov, E. Kashirina, D. Ryazantsev, O. Kotsareva, S. Zavriev. Direct versus sequential immunoglobulin switch in allergy and antiviral responses. Clinical Immunology 170 (2016) 31–38.  Также был опубликован обзор: Рязанцев Д. Ю., Д. В. Воронина, С. К. Завриев. Иммуно-ПЦР: достижения и перспективы. 2016. Успехи биологической химии, т. 56, с. 377-410 (Ryazantsev D.Y., Voronina D.V., Zavriev S.K. Immuno-PCR: achievements and perspectives. Biochemistry (Moscow) 2016. In press.)

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Работа по синтезу конъюгата продолжалась с 2016 года. В начале 2017 года мы столкнулись с неожиданной проблемой сильной контаминации помещений олигонуклеотидом. Поэтому мы были вынуждены синтезировать новый олигонуклеотид с аминогруппой для конъюгации и вынести синтез и очистку конъюгата в отдельное здание. Для получения конъюгата антитела (AB) и одноцепочечного олигонуклеотида размером 60 н. (SSO) в работе использовалась реакция азид-алкинового циклоприсоединения, промотируемого напряжением. Предварительно в АВ вводили азидную группу, а в амино-SSO вводили дибензоциклооктин. В качестве модифицирующего агента для AB был выбран сульфотетрафторфениловый эфир азидокапроновой кислоты; для модификации SSO с введенной при синтезе NH2-группой использовали N-гидроксисукцинимидный эфир дибензоциклоактина (оба реагента от компании Lumiprobe, Россия). Для получения конъюгата модифицированные АВ и SSO смешивали (15 нмоль AB, 75 нмоль SSO, общий объем реакционной смеси 100 мкл при 5х избытке SSO). Реакцию проводили 2 часа при комнатной температуре. Очистку проводили в несколько этапов. Для избавления от непрореагировавшего AB использовали ионообменную хроматографию на колонке TSK-DEAE 5 pw. Полученные фракции концентрировали и наносили на гель-фильтрационную колонку Superdex 200 10/30 increase. Фракции анализировали методами ПААГ в 6% геле в неденатурирующих условиях. Были получены конъюгаты с разной степенью мечения AB – от 1 до 3. Полностью очистить конъюгат с одной меткой не удалось, далее в работе использовали конъюгат с двумя метками. Из кривых титрования, полученных в результате ИФА и иПЦР в двух вариантах: с прямым конъюгатом ДНК-антитело и с комплексом стрептавидин-ДНК следует, что данные, полученные в результате иПЦР с прямым конъюгатом, демонстрируют наиболее выраженный линейный тренд в полулогарифмических координатах по сравнению с ИФА и иПЦР с комплексом стрептавидин-ДНК. Коэффициенты вариации и значения R2 составили для ИФА -0.21 и 0.83, для иПЦР с комплексом стрептавидин-ДНК -1.145 и 0.96, для иПЦР с прямым конъюгатом - -1.40 и 0.98. Аналитическая чувствительность всех трех вариантов анализа была сравнима. Кроме того, в случае конъюгата BE5-ДНК наблюдалось неспецифическое связывание с компонентами сыворотки крови здоровых доноров, чего не наблюдали в случае использования комплекса BE5-стрептавидин-ДНК. иПЦР с конъюгатом на основе AB MA2 к IgM человека при определении дисахарида LeC показала чувствительность ниже ИФА (сравнивали по методикам, описанным в прошлогоднем отчете) на модельном разведении AB к LeC. Дальнейшие работы из-за низкой чувствительности не проводились. Мы полагаем, что модификация AB SSO может влиять на его активность. Сходная методика получения конъюгата описана в недавней статье [Gong et al., Simple Method To Prepare Oligonucleotide-Conjugated Antibodies and Its Application in Multiplex Protein Detection in Single Cells. Bioconjug Chem. 2016 Jan 20;27(1):217-25. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00613] с несколько лучшими результатами по чувствительности анализа. Модификация AB дибензоциклооктином представляется нам не самым лучшим вариантом. Однако авторы использовали реагент с более длинным пегелированным линкером, что обеспечило лучшую растворимость реагента и, возможно, снизило влияние SSO на AB. В следующем году мы планируем опробовать сходные реагенты для модификации. Возможно, использование другого линкера приведет к меньшему влиянию модификации на активность AB. 2. Целью данной работы (совместно с лабораторией углеводов ИБХ РАН) была попытка адаптировать разработанную нами ранее методику определения AB к дисахариду LeC для одновременной детекции AB к различным сахарам при небольшом количестве аналита (смыв с клеток) в формате микрочипа. Для этого на первом этапе мы попытались определить минимально определяемую концентрацию AB методом иПЦР в формате микрочипа, в сравнении с флуоресцентной детекцией при разных концентрациях анти-LeC АВ. В итоге были получены результаты, показывающие очень высокий фоновый уровень (Cq 19-20). По-видимому, при данной методике приготовления микрочипа на полимере неспецифично сорбировалось большое количество SSO. С целью снижения фонового уровня проводился подбор условий: повышали время промывки, варьировали концентрации реагентов, подбирали состав буфера для блокировки. Удовлетворительных результатов добиться не удалось (подробный анализ результатов не приводится). В дальнейшем для решения данной проблемы мы планируем использовать двухмерные микрочипы. Для того, чтобы избавиться от этапа срезания ячеек мы планируем использовать реакцию RCA (Rolling circle replication - амплификация по типу катящегося кольца). Данный метод позволяет использовать одну реакционную смесь для всех ячеек (так как исходный олигонуклеотид можно иммобилизовать) при постоянной температуре, что упрощает процедуру и не требует использования термоциклера и специального пластика. 3. Используя более 100 сывороток крови здоровых доноров и аллергиков с аллергией на кошачью перхоть, грибы A. alternata, клещей домашней пыли и пыльцу берёзы мы показали, что иПЦР может быть более точна по сравнению с ИФА для количественной оценки специфического IgE в сыворотках. Мы показали, что чувствительности детекции специфического IgE методами иПЦР и ИФА сравнимы, однако при тестировании низкотитровых сывороток чувствительность иПЦР выше в 3-4 раза. Также методом иПЦР проводился анализ иммуноглобулинов субкласса IgG1 к вирусу Эпштейн-Барра (EBV) в 18 образцах человеческих сывороток. Чувствительность определения IgG1 методом иПЦР была несколько выше – в 6-16 раз больше чем ИФА. Наряду с этим, при иПЦР-анализе, в отличие от ИФА, зависимость уровня сигнала от степени разбавления сывороток анализе носит линейный характер. Следовательно, с помощью иПЦР анализа можно проводить более точную количественную оценку содержания специфических иммуноглобулинов в сыворотках крови людей. Разная чувствительность иПЦР к низким и высоким по титру IgE сывороткам может быть объяснена различной авидностью этих сывороток. Сыворотки с высоким уровнем IgE распознаются ИФА и иПЦР с сопоставимой чувствительностью, приводящей к сопоставимым титрам. Эти данные находятся в противоречии с результатами, опубликованными ранее несколькими группами исследователей, которые демонстрировали 64-100-кратную чувствительность иПЦР (по сравнению с ИФА) в зависимости от типа аллергена [Rahmatpour et al. Application of immuno-PCR assay for the detection of serum IgE specific to Bermuda allergen. Mol Cell Probes 32, 1-4 (2017); Lee et al. Detection of serum IgE specific to mite allergens by immuno-PCR. Immune Network 8, 82-89 (2008); Wiltshire et al. Detection of multiple allergen-specific IgEs on microarrays by immunoassay with rolling circle amplification. Clin Chem 46(12), 1990-1993 (2000)]. Это несоответствие может быть результатом различных систем обнаружения (гель-электрофорез или иммуно-CAP по сравнению с ПЦР «в реальном времени» (кПЦР)); низкое количество сывороток; незнание титров IgE. В настоящее время по иПЦР с детекцией результата методом кПЦР для обнаружения IgE было опубликовано только ограниченное число работ. Дополнительные исследования, возможно, прояснят этот вопрос. 4. Целью работы на данном этапе было изучение возможности применения синтетического аналога хромофора зелёного флуоресцентного белка M1029 (p-HOBDI-BF2; Baranov et al., Conformationally locked chromophores as models of excited-state proton transfer in fluorescent proteins. J Am Chem Soc. 2012 Apr 4;134(13):6025-32. doi: 10.1021/ja3010144 2012) в качестве флуоресцентной метки для линейного гидролизуемого зонда (TaqMan®) и оценка флуорогенных свойств зондов, меченых им, в количественной ПЦР. Продемонстрировано, что синтетический краситель на основе хромофора зеленого флуоресцентного белка может быть использован в качестве флуоресцентной метки для зондов типа TaqMan в количественной ПЦР, однако уровни разгорания таких зондов ниже, чем для зондов, меченых 6-FAM. Также в настоящей работе отмечен тот факт, что степени разгорания зондов с концевым мечением были выше, чем для зондов с внутренним мечением, что противоречит имеющимся на сегодняшний день представлениям. При детальном анализе результатов был обнаружен большой разброс в минимальных значениях флуоресценции для зондов с концевым мечением, чего не было отмечено для зондов со срединным мечением. Выяснение причин этого разброса и устранение выявленного противоречия станет одной из задач дальнейших исследований. 5. Наработка аллергенов КДП Der f 1, Der f 2, грибов A. alternata Alt a 1 и A. fumigatus Asp f 2 и Asp f 3 проводилась в рабочем режиме по ранее описанным методикам. Получены новые рекомбинантные аллергены: основной аллерген кошачьей перхоти Fel d 1 и основной аллерген березы Bet v 1 (совместно с лабораторией биотехнологии ИБХ РАН). Также для работы, на основе синтетитческого фрагмента гена был получен фрагмент белка EBNA-1 вируса Эпштейн-Барра (YP_401677, 381-639 аминокислота). 6. Иммуноглобулины класса E (IgE) являются основными, но не единственными эффекторными молекулами при развитии аллергических реакций. Помимо антител этого класса в аллергических процессах могут участвовать также иммуноглобулины класса G субклассов 1, 3 и 4. Иммуноглобулины класса А (IgA) являются одним из компонентов первой линии иммунной защиты организма и присутствуют, в основном, на слизистых оболочках. Поэтому, предположительно, IgA могут играть роль и в формировании аллергических реакций, в частности, на респираторные аллергены. В рамках данной работы была исследована возможность использования тест-систем для детекции IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 антител, проведен выборочный скрининг сывороточных аллерген-специфических иммуноглобулинов этих субклассов. Также был проведен скрининг сывороток на наличие иммуноглобулинов класса A. Скрининг сывороток на иммуноглобулины субклассов G1-G4 проводили на модели аллергической реакции на кошачью перхоть. В качестве сорбируемого аллергена использовали рекомбинантный аллерген Fel d 1. Использовали иПЦР тест-систему на основе биотинилированных моноклональных антител к человеческим иммуноглобулинам субклассов G1-G4. Связывание данных антител со специфическими к аллергену человеческими иммуноглобулинами детектировали с помощью комплекса биотинилированная ДНК-стрептавидин. Схема постановки эксперимента была идентична схеме, разработанной для детекции аллерген-специфических IgE. В качестве отрицательного контроля использовали фетальную коровью сыворотку (FBS). Скрининг сывороток на иммуноглобулины субклассов A1-A2 проводили в сыворотках больных аллергией на клещей домашней пыли (КДП) и плесневый гриб Alternaria alternata. В качестве сорбируемых аллергенов использовали рекомбинантные аллергены Der f 2 (КДП) и Alt a 1 (A. alternata). Схема проведения анализа была идентична схеме анализа на специфические иммуноглобулины E. В результате показано, что только одна сыворотка больного демонстрировала достоверный положительный сигнал при разбавлении в 100 на иммуноглобулины IgG1, специфические к кошачьему аллергену Fel d 1. Остальные сыворотки определились как отрицательные на специфические антитела IgG1. Специфические иммуноглобулины G других субклассов не были выявлены ни в одной сыворотке. Данные иПЦР анализа хорошо согласуются с аналогичными данными ИФА (иллюстрации не приводятся). Уровень иммуноглобулинов IgA1 и IgA2 не коррелирует с уровнем IgE. Скрининг показал возможность массированного тестирования сывороток методом иПЦР не хуже по чуствительности, чем ИФА (но и не лучше). В сыворотках аллергиков выявлены специфичные к аллергенам иммуноглобулины, отличные от IgE.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетном году работы по проекту проводились по трем основным направлениям. Продолжение работы по оптимизации методики синтеза ковалентного конъюгата. С помощью реакции SPAAC нами получены ковалентные конъюгаты ДНК-антитело: оптимизирована методика их получения и очистки; проанализирована возможность их использования в иммуно-ПЦР. Показано, что при модификации антитела по аминогруппам невозможно получить мономеченные антитела или антитела со строго определенным числом меток. Определённая по введенным по азидогруппе красителям степень мечения отражает картину лишь статистически. При этом для конъюгатов с 1 и 2 метками мы не обнаружили ощутимой разницы по чувствительности. Тогда как с увеличением степени мечения детектирующего антитела чувствительность метода ощутимо падает. Наши исследования показали, что получение преимущественно бимеченного конъюгата является более рациональным. Одно из использованных в данной работе моноклональных антител (anti IgE BE5) потеряло специфичность после конъюгации с олигонуклеотидом. Ранее мы использовали комплекс биотинилированной с 5`- и 3`-концов ДНК и стрептавидина, на данном этапе работы нам удалось добиться аналогичной чувствительности иПЦР при детекции IgM антител к LeC с использованием ковалентного конъюгата, однако процедура стала короче на два шага (на 1 час быстрее), что при рутинных анализах превращается в ощутимое преимущество. Таким образом, использование ковалентных конъюгатов ДНК-антитело позволяет сократить время проведения анализа и снизить его трудоемкость. Однако следует учитывать, что введение ДНК по модифицированной аминогруппе для некоторых антител может привести к потере специфичности. Разработка методики мультиплексного иПЦР-анализа антител к гликанам на основе реакции RCA. Нами отработаны условия реакции RCA с использованием меченого трифосфата dUTO-Cy5, проведен пробный анализ микрочипа с гликанами. Сигналы от конъюгата MA2-RCA103 детектируются, но они ниже, чем сигналы от антител (параметры сканирования были одинаковыми). По-видимому, в данном направлении требуется дальнейшая оптимизация условий реакции. Скрининг сывороток больных аллергией и здоровых доноров с использованием рекомбинантных белков на наличие аллерген-специфических иммуноглобулинов субклассов IgE, IgA1-2, IgG1-4 методом иПЦР. На данном этапе работ был проведен расширенный скрининг методом иПЦР иммуноглобулинов классов IgG1-4 и IgA1-2 в сыворотках здоровых доноров и больных аллергией на плесневый гриб A. alternata (аллерген Alt a 1), пыльцу березы (аллерген Bet v 1), кошачью перхоть (аллерген Fel d 1) и яичный белок (аллерген Gal d 1). В сыворотках аллергиков выявлены специфичные к аллергенам иммуноглобулины, отличные от IgE. Обнаружена корреляция медианных величин титров некоторых классов Ig от типа аллергена (респираторный или пищевой) в группах здоровых доноров и аллергиков. Также методом иПЦР проведен скрининг иммуноглобулинов классов IgM, IgG1-4 и IgA1-2 к вирусу Эпштейна-Барра (ВЭБ) в сыворотках крови здоровых доноров и больных аллергией на плесневый гриб A. alternata и клещей домашней пыли (КДП). Показали, что инфицирование как у больных, так и у доноров происходит в детстве; доля серо-положительных по ВЭБ индивидов была сравнимой в группах (75% и 74%). Доля больных с высокими титрами IgG1 среди больных с аллергией также была ниже (7%) по сравнению с донорами (18%), что соответствует меньшей вирусной нагрузке. При аллергии лучше работает локальный иммунитет, что выражается в повышении титров протективных IgA1 и IgM к ВЭБ в раннем возрасте по сравнению с донорами. Таким образом, результаты скрининга показали возможность массированного тестирования сывороток методом иПЦР, однако чувствительность данного метода оказалась сравнимой с ИФА.