КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-14-00191

НазваниеРазработка технологии создания de novo рекомбинантных биологических антидотов пролонгированного действия для терапии нарушений деятельности нервной системы

РуководительСмирнов Иван Витальевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2016 - 2018

КонкурсКонкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словаЭкспрессия генов в СНО клетках, локусы прикрепления к ядерному матриксу, MAR, модификация белков полисиаловыми кислотами, биокатализ, бутирилхолинэстераза, серпины, фармакокинетика, антидоты к фосфорорганическим отравляющим токсинам (ФОТ), пестицидам, нервно-паралитическим ядам, нокаутные мыши по гену бутирилхолиэстеразы.

Код ГРНТИ34.15.63


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Антитела обладают рядом неоспоримых преимуществ в качестве терапевтических препаратов, среди которых низкая иммуногенность, высокая стабильность в кровотоке и возможность вводить большие дозы препарата без заметных побочных эффектов. Благодаря этому на фармацевтическом рынке антитела занимают второе место по объему производства после вакцин. В настоящее время приняты для клинического применения около 40 препаратов антител. Создание гибридного антитела с интегрированным активным центром фермента, способного деградировать или нейтрализовать фосфорорганические нейротоксины, является уникальной фундаментальной задачей, имеющей при этом очевидное прикладное применение, что позволит вплотную подойти к проблеме «каталитической вакцины». Востребованность антидотов к фосфорорганическим токсинам (ФОТ) обусловлена все возрастающим бесконтрольным применением пестицидов, опасностью техногенных катастроф и достаточно высокой вероятностью террористических атак. До 10% всех случаев бытовых отравлений приходится на долю отравлений бытовыми инсектицидами, противомоскитными препаратами, которые так же относятся в ФОТ. За последние 60 лет исследований методы медикаментозного лечения отравлений фосфорорганическими токсинами активно развивались. Тем не менее, они все еще несовершенны, так как позволяют избежать смерти, но не потери трудоспособности и необратимых поражений головного мозга. Альтернативным подходом в терапии и профилактике отравлений ФОТ является использование биологических антидотов. Из всех антидотов против ФОТ только бутирилхолинэстераза плазмы крови человека получила статус «New development drug» от Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) в 2006 г. Согласно “амилоидной гипотезе” базовой причиной прогрессии болезни Альцгеймера являются отложения бета-амилоида. При болезни Альцгеймера, бутирилхолинэстераза и ацетилхолинэстераза, но в особенности бутирилхолинэстераза, выявляются в бета-амилоидных бляшках и нейрофибриллярных клубках. Есть все основания полагать, что снижение активности этих ферментов благотворно скажется на развитии патологического процесса. По всей видимости, при болезни Альцгеймера бутирилхолинэстераза является лучшей целью для ингибирования, чем ацетилхолинэстераза. Естественно, необходимо получить достаточно стабильные и нетоксичные ингибиторы фермента, действующие in vivo. Основная идея данного проекта заключается в создании подходов к регуляции in vivo активности холинэстераз. Повышение активности этих биокатализаторов в организме человека с одной стороны позволяет защитить индивида от воздействия фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ), боевых отравляющих веществ, пестицидов и инсектицидов, а с другой стороны функциональное ингибирование активности этих ферментов может быть оправдано при терапии ряда тяжелых патологией нервной системы, в частности таких, как болезнь Альцгеймера. Предлагаемая в данном проекте платформа будет базироваться на конкретных фармпрепаратах: (i) биокатализаторах с измененными кинетическими параметрами, позволяющими акцептировать и/или трансформировать нейротоксичные фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ) и (ii) ингибиторах холинэстераз, полученных с помощью подходов комбинаторной биологии на основе природных ингибиторов протеаз - серпинов. Работа требует создания препаратов на основе рекомбинантных белков с пролонгированным периодом полувыведения из организма. В этой связи одним из условий успешного выполнения проекта будет работа с животными, в частности с линейными мышами spf стауса со средне-статистическим уровнем бутирилхолинэстеразы и мышами, нокаутными по гену бутирилхолинэстеразы.

Ожидаемые результаты
В результате реализации проекта будут созданы принципиально новые и не имеющие аналогов в мире типы биокатализаторов, представляющие собой структурный гибрид активного центра фермента, заключенного в антиген-связывающий домен антитела. Полученный биокатализатор будет сочетать в себе свойства высокопроцессивного фермента, высокую стабильность и низкую иммуногенность антитела в кровотоке. Параллельно будут созданы библиотеки активного центра фермента бутирилхолинэстеразы с целью получения вариантов фермента, способного с высокой эффективностью гидролизовать фосфорорганические нейротоксины (экотиофат, газы VX и VR, зоман, пестициды паратион и малатион) и препараты, применяемые в анестезии (например, сукцинилхолин). Для поиска высокоспецифичных ингибиторов холинэстераз будут созданы библиотеки природных ковалентных ингибиторов протеаз – серпинов. Для обеспечения эффективности биотехнологического производства будут оптимизированы генетические конструкции для экспрессии целевых продуктов на основе включения ДНК фрагментов, соответствующих последовательностям прикрепления ядерного матрикса (Matrix attachment regions, MAR), последовательностей IRES и F2A пептида. Эти структурные изменения генов позволят получать несколько полипептидных цепей с одного транскрипта, таким образом, в частности, будет проведено совершенствование конструкта для экспрессии бутирилхолинэстеразы, полученного авторским коллективом на предпроектном этапе. Разработанный ранее коллективом автором метод прижизненного анализа биораспределения и биодеградации бутирилхолинэстеразы [1] будет адаптирован и использован для всех полученных в ходе реализации проекта продуктов. Будет проведена оптимизации условий выделения и очистки, а также разработки методов генно-инженерной или химической модификации рекомбинантных белковых препаратов с целью получения препаратов пролонгированного действия. Результаты работы будут протестированы в экспериментах на модельных животных в условиях острой и хронической нейротоксичности. В результате выполнения программы будет отлажена технология получения фармакологических препаратов биокатализаторов и ингибиторов холинэстеразной активности. Отлаженная схема может быть расширена и на другие препараты со схожими потребительскими свойствами. Данные разработки будут находиться на передовом уровне развития мировой медицинской биотехнологии в силу: (1) значительного интереса к объекту разработки у мировых лидеров направления [2, 3]; (2) необходимости прорывных технологий в области экспрессии рекомбинантных белков фармацевтической значимости в клетках млекопитающих [4-7]; (3) необходимости совершенствования методов получения терапевтических антител [8-10]; (4) востребованности разработок в области способов пролонгации действия рекомбинантных терапевтических белков, альтернативных методу пегилирования [11, 12]; (5) необходимостью развития новых методов дизайна активных центров биокатализаторов, в том числе, с применением подходов молекулярного докинга и квантово-механических расчетов, а также методов высокопроизводительного скрининга in vitro и in silico для созданных комбинаторных библиотек. Яркими примерами таких работ являются, создание de novo ферментов, катализирующих реакции, для которых не существует природных ферментов: реакция элиминации Кемпа [13] и ретро-альдольная реакция [14]. Потребительское значение разработки имеет большую ценность для национального суверенитета России, так как в ходе выполнения исследования будет создана передовая отечественная технология получения генетически кодируемых антидотов к ФОВ. Достаточно отметить, что данная проблема в США не решена, несмотря на колоссальные вложения в создание генномодифицированных животных для производства рекомбинантной бутирилхолинэстеразы в молоке [14]. По имеющимся у авторского коллектива данным, в США ведется разработка крупномасштабного производства бутирилхолинэстеразы из плазмы крови человека, что требует осуществления жесткого контроля конечного продукта на вирусные контаминации [16]. Необходимо отметить, что содержание бутирилхолинэстеразы в плазме крови составляет около 5 мг/л, в то время как коллектив авторов имеет приоритет в создании клона-продуцента тетрамерной бутирилхолинэстеразы человека на основе клеток линии CHO с уровнем продукции более 70 мг/л культуральной среды [1]. 1. Terekhov, S.S., et al., Excessive Labeling Technique Provides a Highly Sensitive Fluorescent Probe for Real-time Monitoring of Biodegradation of Biopolymer Pharmaceuticals in vivo. Acta Naturae, 2014. 6(4): p. 54-9. 2. Gupta, R.D., et al., Directed evolution of hydrolases for prevention of G-type nerve agent intoxication. Nat Chem Biol, 2011. 7(2): p. 120-5. 3. Masson, P., et al., A collaborative endeavor to design cholinesterase-based catalytic scavengers against toxic organophosphorus esters. Chem Biol Interact, 2008. 175(1-3): p. 273-80. 4. Kishnani, P.S., et al., Recombinant human acid [alpha]-glucosidase: major clinical benefits in infantile-onset Pompe disease. Neurology, 2007. 68(2): p. 99-109. 5. Barngrover, D., Fabrazyme--recombinant protein treatment for Fabry's disease. J Biotechnol, 2002. 95(3): p. 280-2. 6. Jacobs, L.D., et al., Intramuscular interferon beta-1a for disease progression in relapsing multiple sclerosis. The Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG). Ann Neurol, 1996. 39(3): p. 285-94. 7. Schwartz, R.S., et al., Human recombinant DNA-derived antihemophilic factor (factor VIII) in the treatment of hemophilia A. recombinant Factor VIII Study Group. N Engl J Med, 1990. 323(26): p. 1800-5. 8. Scott, A.M., J.D. Wolchok, and L.J. Old, Antibody therapy of cancer. Nat Rev Cancer, 2012. 12(4): p. 278-87. 9. Leavy, O., Therapeutic antibodies: past, present and future. Nat Rev Immunol, 2010. 10(5): p. 297. 10. Kiewe, P. and E. Thiel, Ertumaxomab: a trifunctional antibody for breast cancer treatment. Expert Opin Investig Drugs, 2008. 17(10): p. 1553-8. 11. Gregoriadis G et al., Polysialic acids: potential in improving the stability and pharmacokinetics of proteins and other therapeutics. Cell Mol Life Sci. 2000 Dec;57(13-14):1964-9. 12. Smirnov, I.V., et al., Chemical Polysialylation of Recombinant Human Proteins. Methods Mol Biol, 2015. 1321: p. 389-404. 13. Rothlisberger, D., et al., Kemp elimination catalysts by computational enzyme design. Nature, 2008. 453(7192): p. 190-5. 14. Jiang, L., et al., De novo computational design of retro-aldol enzymes. Science, 2008. 319(5868): p. 1387-91. 15. Huang, Y.J., et al., Recombinant human butyrylcholinesterase from milk of transgenic animals to protect against organophosphate poisoning. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(34): p. 13603-8. 16. Lockridge O., Human butyrylcholinesterase deficiency and function of butyrylcholinesterase. IV международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань 2015.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Для анализа архитектуры активного центра известных ферментов, гидролизующих фосфорорганические соединения и совмещение активных центров выбранных ферментов с активным центром антител на первом этапе был проведен выбор наиболее подходящего фермента, способного гидролизовать фосфорорганические соединения. В результате анализа литературы было найдено 4 группы ферментов, способных к гидролизу фосфорорганических соединений. Все ферменты были использованы в качестве потенциальных биологических антидотов при терапии отравления фосфорорганическими токсинами. Группа 1, включает в себя параоксоназу из плазмы крови человека [Mackness et al., Gen. Pharmacol, 1998] и диизопропилфторфосфатаза (ДФФаза) из каракатицы Loligo vulgaris [Blum et al., J Am Chem Soc, 2006]. В группу 2 входит фермент ангидролаза фосфорорганических кислот из Alteromonas sp (АФК). [Vyas et al., Biochemistry, 2010] Группа 3 - метилпаратионгидролаза из Pseudomonas sp (МПГаза). [Dong et al., J Mol Biol, 2005] Группа 4 - фосфотриэстераза из Pseudomonas diminuta (ФТЭаза) [Benning et al., J Biol Chem, 2000]. Для решения поставленной в проекте задачи, было проведено совмещение структур антитела A17 (PDB 2XZC) и структур ферментов, используя в качестве точки совмещения атом фосфора. После совмещения в структуре абзима при помощи написанного на языке Python скрипта, использующего модуль pymol, был выполнен автоматический поиск наиболее подходящих для замен соседних остатков. Было установлено, что наиболее подходящей структурой активного центра является структура фермента диизопропилфлуорофосфатазы из каракатицы Loligo vulgaris. Это обусловлено наиболее компактным размещением всех необходимых для катализа аминокислотных остатков и минимально возможный размер активного центра упрощает его воссоздание в остове другого белка. В результате совмещения активных центров были обнаружены позиции аминокислотных остатков для замены с целью реконструкции активного центра. В качестве критерия были выбраны близость Сα атомов и направление аминокислотных радикалов. После этого проводили минимизацию энергии структуры антитела А.17 с дистанционными ограничениями на расстояния между всеми Сα и Сβ атомами выбранных для внесения мутаций остатков. В результате конформация остова изменялась таким образом, чтобы туда точно помещался референсный активный центр. Значение силы дистанционных ограничений подбиралось эмпирически из диапазона 103 – 108 с логарифмическим шагом в 1. Для дальнейшей работы использовалась структура с лучшим RMSD по отношению к Сα-атомам активного центра. Значения RMSD, число и сила дистанционных ограничений представлены в таблице 2. Для полученных вариантов проводили дополнительный мутагенез с целью заполнения координационной сферы катиона Ca2+. Для двадцати лучших вариантов проводили QM/MM анализ протекания реакции, анализировали вероятность успеха протекания реакции (successful rate, SR), т.е. отношение количества запусков QM/MM системы приводящих к образованию продукта, к общему количеству запусков. В результате расчетов были предложены три варианта для экспериментальной проверки mut_231, mut_255, mut_432. С использованием последовательных ПЦР с перекрывающийхся праймеров и клонирования в вектор pFUSE по сайтам NcoI-XhoI (для тяжелой цепи) и XhoI-AvrII (для легкой цепи) были получены генетические конструкции для экспрессии гибридных антител в виде scFv-Fc в клетках линии HEK293T. На основании, полученных расчетов была создана библиотека активного центра БуХЭ, в которой замене подвергались остаток E325 и окружающие его остатки A328, F329, N397 и F398. Библиотека была создана с использованием перекрывающихся праймеров и клонирована в вектор pPic9k-α-SfiI-FLAG-anchor с использованием сайтов рестрикции SfiI. После трансформации клеток дрожжей P.pastoris штамм GS115 была получена клеточная библиотека БуХЭ с заякоренным на поверхности биокатализатором. Полученная библиотека инкапсулировалась в капли двойной эмульсии с использованием микрофлюидных чипов с диаметром каналов 60 мкм совместно с субстратами: экотиофатом и флуоресцентным субстратом HCAAME (Hydroxy-2-oxo-2H-chromen-3-ylcarbamoyl)acrylic acid methyl ester, Millipore) или параоксон-резоруфином (Par-R). Было отобрано по 2000 событий для субстрата HCAAME и 438 событий для субстрата Par-R. Уровень сигнала для Par-R был существенно ниже. Отобранная фракция переносилась на чашку с YPD-агаром. После чего по 50 единичных колоний переносили в 24-луночный планшеты с жидкой средой YPD для наработки клеточной массы и криоконсервирования для последующих экспериментов. Основную роль в процессе ингибирования гидролаз серпином ААТ играет петля 368-393. Основным местом разрыва пептидной связи при обработке ААТ трипсином является связь между остатками M382 и S383. Анализ литературы показал, что аминокислотные остатки P3-P1 – придают специфичность для протеазы. В случае ААТ это остатки 380-IPM-382. Таким образом они являются первыми кандидатами для мутагенеза. С другой стороны, остатки P15-P8 являются очень важными для конформационной транслокации петли после образования комплекса ацил-фермент, особую роль отмечают для остатка P14. Таким образом, остатки 368-GTEAAGAM-375 не должны входить в библиотеку. Показано, что петля может незначительно различаться по количеству аминокислотных остатков (+/- 2 а.о.). Было проведено компьютерное моделирование стадии не ковалентного взаимодействия ААТ и БуХЭ, в результате которого было установлено, что длинны петли 368-393 не достаточно для контакта с каталитическим остатком S198 активного центра БуХЭ. Эти данные также были подтверждены анализом связывания БуХЭ и серпина ААТ с использованием системы BiaCore T200. В результате проведенных компьютерных исследований и анализа литературных данных было решено проводить мутагенез в положениях P7-P4’+3 (376-FLEAIPMSIPP-386) c введением 1, 2 или 3 остатков глицина для увеличения длинны петли. Были созданы генетические конструкции для фаг-дисплея на основе вектор pHEN2 и фагов M13. Предварительный трех раундовый скрининг показал, что наблюдается некоторое обогащение библиотеки, однако уровень его недостаточный (Рис. 6). В результате было решено сменить систему фагового дисплея на T7Select. Первый раунд отбор ожидается в начале 2017 года. Для оптимизации генетических конструкций для экспрессии целевых продуктов БуХЭ и его мутантных форм были проведены модификации генетических конструкций pFUSE-MAR-PRAD-F2A-BChE. Были получены конструкции pFUSE-2Xb-globin-PRAD-F2A-BChE и pFUSE-5'lyzozyme-MAR-PRAD-F2A-BChE. Конструкции содержали исуляторную последовательности бета-глобина курицы и последовательность 5' lyzozyme MAR курицы, соответственно.

 

Публикации

1. Залевский А.О., Головин А.В. Многоступенчатое гибридное QM/MM моделирование ферментов: дело BuChE Acta Naturae, Acta Naturae, Спецвыпуск, 2, с. 79 (год публикации - 2016).

2. Костин Н. Н., Пономаренко Н. А., Исаев В.А., Руденская Г. Н., Бобик Т. В., Габибов А.Г., Смирнов И.В. Получение препаратов рекомбинантного серпина камчатского краба Paralithodes camtscliaticus для биомедицинских исследований Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, - (год публикации - 2017).

3. Костин Н.Н., Шурдова Е.М., Руденская Г.Н., Бобик Т.В., Смирнов И.В. ИССЛЕДОВАНИЕ СЕРПИНА PARALITHODES CAMTSCHATICUS Acta Naturae, Спецвыпуск, Т. 1, С. 210 (год публикации - 2016).

4. Смирнов И.В., Степанова А.В., Терехов С.С., Мокрушина Ю.А., Залевский А.О., Карцева О., Александрова Н., Головин А.В., Габибов А.Г. Recombinant long-acting bioscavenger based on human butyrylcholinesterase for the treatment of nerve agent toxicity FEBS Journal, 283 (Suppl. 1) (2016) (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Получение гибридного антитела-фермента способного к гидролизу фосфорорганических соединений имеет важное фундаментальное значение, ни одной лаборатории мира не удалось перенести каталитический центр из белкового фолда фермента в фолд другого белка, однако наша компетенция, подкреплённая работами по созданию биокатализаторов с использованием методов квантово-механических расчетов и возможностями суперкомпьютера Ломоносов, позволит решить эту проблему. В результате выполнения проекта в 2017 году была проведена экспрессия вариантов гибридного антитела-фермента mut_231, mut_255 и mut_432 для экспрессии в виде scFv-Fc, уровень экспрессии гибридных антител составил 0,4-1 мг/л. Однако формат экспрессии гибридных антител в виде scFv-Fc был признан нецелесообразным в виду низкого выхода рекомбинантного продукта поэтому были созданы конструкции для экспрессии гибридного антитела-фермента в виде полноразмерного антитела, которые будут использованы для котрансфекции клеток HEK293F и повторной оценки экспрессии и функциональной активности гибридных антител. С помощью методов квантово-механических расчетов были установлены атомистический механизм реакции взаимодействия, полученных ранее вариантов новых каталитических антидотов на основе БуХЭ – БуХЭ-14 и БуХЭ-15. Таким образом, мы смогли наблюдать канонический SN2-синхронный гидролиз ковалентного сопряженного комплекса. На самом деле мы также смогли наблюдать восстановления протонирования каталитического Ser198 из His438, полностью восстанавливая исходное состояние фермента. Разработанный метод был использован для более широкого поиска позиций для замен, в результате было установлено, что наиболее значимые замены для создания модифицированной библиотеки являются положения W82, а также петли 116-121 и 280-288 активного центра БуХЭ. Была создана библиотека серпина антитрипсина с пятью равномерно рандомизированными положениями с дополнительным 7.8X покрытием. Был создан специальный промежуточный вектора для предварительной сборки библиотеки. Вектор были создан на основе плазмиды pUC57, содержащей ААТ, фланкированный сайтами EcoRI и HindIII, и готовый к перестановке полученной библиотеки в геном фага. На данном этапе полученные библиотеки были собраны в вирионы и проведено три раунда отбора на рекомбинантную БуХЭ человека. Была проведена наработка фермента БуХЭ препаративных количествах. В результате было получено 75 мг очищенного препарата фермента, который был использован для экспериментов на животных. Была продолжена работа по оптимизации продукции функционально активных ингибиторов гидролаз. Полученный таким образом протокол рефолдинга для серпина PC позволил получить выход растворимого белка до 80%. По результатам, полученным в рамках отработки наработки, выделения, очистки и характеризации препаратов ингибиторов сериновых гидролаз была подготовлена к публикации статья в журнал Fish and Shellfish Immunology, IF2016 3.148. Статья отправлена в редакцию и проходит рецензирование. В связи с тем, что одной из основных задач проекта является создание эффективных биологических антидотов против отравления ФОТ на основе ферментов и антител, то важно учитывать возможные проблемы, связанные с возможным быстрым выведением его из организма. Для антител характерна относительна высокая стабильность в кровотоке и низкая иммуногенность. Для ферментов это проблема существует. Для решения этой проблемы был разработан протокол поиска условий полисиалирования, с помощью которого было получено три серии препарата со степенью очистки от исходных соединений более 98%, и которые обладали активность 78%, 91%, 87% от активности исходного препарата аргиназы, соответственно. Соотношение белок:ПСА составило 8.1+/-0.5 для всех серий. Данный протокол будет использован на дальнейших этапах работы по проекту для создания препаратов с пролонгированным биологическим эффектом. Бытовые отравлений фосфорорганическими пестицидам и инсектицидами на основе фосфорорганических соединений является социально-значимой проблемой. Такое отравление имеет характер хронического и в большинстве случаев не приводит к летальным исходам, но вызывает длительную потерю трудоспособности и инвалидизацию. Для тестирования препаратов биологических антидотов была создана мышиная модель хронического травления параоксоном. В настоящее время не описано мышиных моделей хронического травления фосфорорганическими пестицидами. Была отработана модель хронического травления мышей параоксоном и для дальнейших исследований протективной активности препаратов наиболее эффективно использовать дозировку параоксона 2 мг/кг.

 

Публикации

1. Костин Н.Н., Бобик Т.В., Смирнов И.В., Руденская Г.Н., Габибов А.Г. АНАЛИЗ СПЕЦИФИЧНОСТИ И ЛОКАЛИЗАЦИИ СЕРПИНА КАМЧАТСКОГО КРАБА PARALITHODES CAMTSCHATICUS Acta Naturae, СПЕЦВЫПУСК, стр. 23 (год публикации - 2017).

2. Мокрушина Ю.А., Головин А.В., Степанова А.В., Смирнов И.В., Блэкберн Д.М., Габибов А.Г. МОДЕРНИЗИРОВАННЫЙ КМ/ММ МЕТОД: КАК УВЕЛИЧИТЬ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ С ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ СОЕДИНЕНИЯМИ Acta Naturae, СПЕЦВЫПУСК, стр. 132 (год публикации - 2017).

3. Мокрушина Ю.А., Степанова А.В., Головин А.В., Смирнов И.В., Габибов А.Г. Computer-based rational design of improved functionality for antibody catalysts toward organophosphorus compounds FEBS Journal, FEBS Journal 284, (2017), 314 (год публикации - 2017).

4. Паликов В.А., Терехов С. С., Дьяченко И.А., Пантелеев С. В., Мокрушина Ю. А., Кнорре В.Д., Шамборант О.Г., Смирнов И. В., Габибов А. Г. Мышиная модель для оценки субхронической токсичности фосфорорганических пестицидов Acta Naturae, - (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Был завершен цикл исследований, посвященный разработке алгоримов описания кинетических механизмов каталитического гидролаза фосфорорганических субстратов бутирилхолинэстеразой. Таким образом, выяснен механизм действия каталитического антидота на основе БуХЭ при отравлении фосфорорганическими соединениями (ФОС). Полученные результаты были опубликованы во Frontiers Pharmacology (Q1) и в ряде интернет-изданий https://indicator.ru/news/2018/09/11/protivoyadie-ot-himicheskogo-oruzhiya/, https://www.gazeta.ru/science/news/2018/09/11/n_12020899.shtml. Показано, что разработанный метод in silico реконструкции активного центра доказал принципиальную возможность переноса активного центра фермента в структуру антитела, однако, он требует существенного улучшения. Мутантное антитело #432, предсказанное вычислительными методами, способно взаимодействовать с параоксоном, но эффективность такой реакции крайне низка. Оптимизация метода расчета на основе алгоритма DFTb позволило предсказать мутант параоксоназного антитела А17 с заменой лейцина на лизин в 47 положении легкой цепи, что повысило эффективность взаимодействия с параоксоном более чем в двести раз. Результаты были представлены на международной конференции FEBS 2018, г. Прага, Чехия. Было проведено структурно-функциональное исследование нового серпина камчатского краба P. Camtschaticus. Посредством профилирования активности пептидаз гемоцитов и плазмы мы обнаружили, что серпин PC ингибирует по меньшей мере две R/K-специфические активности, и показали, что он ингибирует индукцию фенолоксидазной активности (РО) в гемоцитах. Результаты работы были опубликованы в журнале FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY (Q1) и представлены на международной конференции FEBS 2018, г. Прага, Чехия. Разработана биомодель, позволяющая оценить физиологические проявления воздействия пестицида параоксон при пероральном введении в режиме субхронической токсичности. Внутривенное введение биопрепарата рекомбинантной БуХЭ в дозе 20 мг/кг позволило полностью избежать смертности и способствовало быстрому восстановлению поведения мышей после отравления. Детализированное исследование нейрофизиологических характеристик, а также обратимости воздействия ФОС в рамках разработанной биомодели субхронической токсичности, представляет высокий интерес и является предметом дальнейших исследований. Результаты были опубликованы в журнале Acta Naturae (Q2).

 

Публикации

1. - Выяснен механизм действия противоядия от химического оружия Индикатор, - (год публикации - ).

2. - Установлен механизм действия противоядия для борьбы с химическим оружием Газета.ру, - (год публикации - ).

3. Злобин А., Мокрушина Ю., Терехов С., Залевский А., Бобик Т., Степанова А., Алисейчик М., Карцева О., Пантелеев С., Головин А., Белогуров А., Габибов А., Смирнов И. QM/MM Description of Newly Selected Catalytic Bioscavengers Against Organophosphorus Compounds Revealed Reactivation Stimulus Mediated by Histidine Residue in the Acyl-Binding Loop Frontiers in Pharmacology, Volume 9, Article 834 (год публикации - 2018).

4. Костин Н., Бобик Т., Руденская Г., Смирнов И., Габибов А. A serpin from the red king crab Paralithodes camtschaticus inhibits R/K-specific peptidases in hosts hemocytes and plasma FEBS Open Bio, V 8, Suppl. S1, p 493 (год публикации - 2018).

5. Костин Н.Н., Бобик Т.В., Шурдова Е.М., Зиганшин Р.Х., Сурина Е.А., Шагин Д.А., Шагина И.А., Кнорре В.Д., Исаев В.А., Руденская Г.Н., Габибов А.Г., Смирнов И.В. Cloning and characterization of serpin from red king crab Paralithodes camtschaticus FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY, Volume 81, Pages 99-107 (год публикации - 2018).

6. Мокрушина Ю., Головин А., Степанова А., Пипия С., Данилов Д., Смирнов И., Габибов А. Kinetic and thermodynamic description of computer-designed mutants of reactibody A17 as improved scavenger of organophosphorus compounds FEBS Open Bio, V 8, Suppl. S1, pp 446 (год публикации - 2018).

7. Паликов В.А., Терехов С. С., Паликова Ю.А., Хохлова О.Н., Казаков В. А., Дьяченко И.А., С. В. Пантелеев, Мокрушина Ю. А., Кнорре В.Д., Шамборант О.Г., И. В. Смирнов, Габибов А. Г. Мышиная модель для оценки субхронической токсичности фосфорорганических пестицидов ACTA NATURAE, Т. 10. № 4 (39) (год публикации - 2018).

8. Пипия С., Мокрушина Ю., Головин А., Смирнов И., Габибов А. Peculiarities of the stereospecific interactions of catalytic antibodies A5 and A21 with arylphosphonate X FEBS Open Bio, V 8, Suppl. S1, pp 445-446 (год публикации - 2018).

9. Смирнов И., Мокрушина Ю., Терехов С., Карцева О., Залевский А., Головин А., Габибов А. Principles for creating biocatalysts with predefined functional activities FEBS Open Bio, V 8, Suppl. S1, p 410 (год публикации - 2018).