КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 16-14-10065
НазваниеНовые подходы к исследованию резистентности клеток человека к лекарствам, действующим на уровне трансляции
РуководительШатский Иван Николаевич, Доктор химических наук
Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва
Период выполнения при поддержке РНФ | 2016 г. - 2018 г. |
Конкурс№13 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология
Ключевые словабиосинтез белка, инициация трансляции, факторы инициации, ингибиторы, приобретенная резистентность, модельные клеточные системы, рибосомный профайлинг
Код ГРНТИ34.15.00
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Проект направлен на создание универсальных методических разработок для решение задач, имеющих серьезную практическую перспективу: 1) выяснение путей возникновения резистентности клеток к химиотерапевтическим препаратам, которые воздействуют прямо или опосредованно на функционирование ключевых факторов инициации трансляции; 2) выяснение еще неизвестных механизмов инициации трансляции, включая те, которые возможно используются мРНК, кодирующими белковые факторы выживания или апоптоза клеток после обработки лекарствами. Предлагаемые разработки будут сочетать генноинженерные методы и рибосомный профайлинг, основанный на полногеномном секвенировании нового поколения (NGS).
Еще 10 - 15 лет назад трансляция рассматривалась как второстепенный процесс в генной экспрессии. Главная роль отводилась транскрипции, то есть синтезу мРНК. В настоящее время отношение исследователей к трансляции и ее регуляции кардинально изменилось. Стало очевидно, что быстрый ответ эукариотических клеток на внешние воздействия, включая стрессы и обработку лекарствами, возможен только путем быстрого изменения эффективности трансляции определенных индивидуальных мРНК клетки. Одни из них отвечают за ее спасение, другие за элиминирование путем апоптоза. Это очень важный факт, потому что в настоящее время в клиниках испытывается целый ряд антираковых препаратов, которые ингибируют белковые факторы, вовлеченные в инициацию синтеза белка, тем самым подавляя пролиферативный потенциал клеток человека. В ходе химиотерапии, клетки часто приобретают резистентность к использованным лекарствам, механизмы которой как правило не ясны. К тому же нельзя исключить, что резистентность может достигаться несколькими путями. Один из случаев резистентности, резистентность к лекарствам против киназы mTOR, будет детально анализироваться в рамках данного проекта: для этого будет создан специальный новый метод, который может найти широкое применение. mTOR инактивирует репрессор кеп-связывающего фактора eIF4E, 4E-BP, тем самым усиливая активность eIF4E в рекрутировании мРНК на рибосомы. В ходе проекта будет разрабатываться и другая задача, тесно связанная с предыдущей. До сих пор мало что известно каким образом достигаются специфические изменения в трансляции определенных мРНК и почему определенные внешние воздействия негативно влияют на трансляцию одних мРНК и мало влияют на работу других матриц. Фактически нам известен только один доказанный механизм инициации трансляции для клеточных мРНК. Это механизм кеп-зависимой инициации, представленный во многих учебниках. Постулированный много лет назад другой механизм, основанный на использовании так наз. клеточных IRES'ов, пока не получил надежного экспериментального подтверждения. Наличие альтернативных механизмов инициации трансляции подкрепляется существованием ряда белковых факторов, которые явно вовлечены в трансляцию, но которым не находится определенного места в существующей кеп-зависимой модели инициации синтеза белка у эукариот. Мы планируем создать новый экспериментальный инструмент и протестировать его на нескольких факторах инициации трансляции, функция которых не известна или же очень плохо изучена. Тем самым мы приблизимся к пониманию различного поведения отдельных матричных РНК при разных воздействиях на клетку.
Ожидаемые результаты
Мы планируем создать разработки, которые позволят на полногеномном уровне понять как работают разные мРНК в условиях подавления факторов инициации трансляции лекарствами и как приобретается устойчивость к этим препаратам. Параллельно будет выясняться функция некоторых факторов инициации, роль которых в трансляции индивидуальных мРНК пока не ясна. Такие факторы вероятно используются матрицами с неканоническим механизмом инициации синтеза белка и могут послужить мишенью для разработки новых лекарств. Таким образом, результаты нашей работы могут оказаться полезными для медицинской биологии и клинических испытаний. Нам кажется, что проект претендует на самый высокий мировой уровень исследований.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Методом CRISPR-CAS9 в хромосомы клеток человека 293T вставлена ДНК,кодирующая так наз. белок-таймер под контролем CMV промотера и получена стабильная линия, экспрессирующая этот белок. Вновь синтезированный белок-таймер имеет синюю флуресценцию, а после созревания приобретает красный цвет. Таким образом отсутствие синей флуоресценции говорит об отсутствии синтеза таймера. Данная конструкция создана для получения в дальнейшем линии клеток, устойчивой к лекарству торину. который используется при лечении онкологических заболеваний. Показано, что в созданной линии белок-таймер в присутствии торина не синтезируется и синяя окраска отсутствует. Предполагается, что устойчивые к торину линии клеток, которые планируется получить в ближайшее время, вновь начнут синтезировать таймер, что будет сопровождаться появлением синей окраски. Такие клетки будут исследоваться для установления молекулярных механизмов резистентности к торину с помощью молекулярно биологических методов и метода рибосомного профайлинга. Предложенный подход может использоваться для анализа возникновения резистентности и к другим лекарствам, что важно для практической онкологии.
Параллельно с этими исследованиями, были проведены эксперименты по установлению механизма функционирования белка DAP5 (Death Associated Protein 5), фактора инициации трансляции у животных, который, по-видимому, направляет кеп-независимый способ инициации трансляции. Считается, что кеп-независимый способ инициации трансляции используется в клетках животных при апоптозе, различных стрессовых воздействиях, включая химиотерапию, а в норме при дифференцировке клеток. Как работает DAP5 до сих пор не известно. В настоящее время наиболее популярная идея заключается в том, что этот белковый фактор обслуживает клеточные IRES-элементы. (IRES-элементы это такие структуры в 5' нетранслируемых областях (НТО) мРНК, которые позволяют протекать кеп-независимым механизмам инициации трансляции.) Наши данные, полученные в ходе выполнения этого проекта, не согласуются с этой теорией: белковый фактор DAP5 стимулирует трансляцию любых модельных мРНК, если их 5' НТО не содержат кепа на 5' конце, хотя разные РНК стимулируются в разной степени. Общий вывод состоит в том, что классический кеп-зависимый способ инициации и DAP5-опосредуемый механизм являются скорее всего конкурентными, а не взаимодополняющими механизмами, то есть последний работает тогда, когда отключен стандартный механизм.
Методом CRISPR-CAS9 получен нокаут по DAP5 в клеточной линии фибробластов мышей NIH3T3. Отсутствие в клетках NIH3T3 белка DAP5 не влияло драматическим образом на их рост и деление. Это согласуется с общим мнением, что DAP5-опосредованный механизм работает только при определенных условиях и не обязателен для пролиферативного роста клеток. Тем не менее, нами получены данные о том, что отдельные мРНК в большей степени зависят от DAP5, чем большинство других. Их трансляция стимулируется даже в том случае, когда они содержат кеп, то есть находятся в естественном состоянии. Сделано предположение, что существуют некие элементы в структуре мРНК, которые повышают способность мРНК использовать DAP5-зависимый механизм инициации трансляции. Природа этих элементов в настоящее время изучается.
Публикации
1. Теренин И.М., Смирнова В.В., Андреев Д.Е., Дмитриев С.Е., Шатский И.Н. A researcher's guide to the galaxy of IRESs. Cellular and Molecular Life Sciences, Birkhauser Verlag (Basel, Switzerland), - (год публикации - 2016) https://doi.org/10.1007/s00018-016-2409-5
Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Методом профайлинга протестирован новый мощный ингибитор киназ MNK1 и 2 Sel201, который особенно эффективен против меланомы.
2. Получен новый инструмент для количественного изучения взаимодействия фактора eIF4E c кепом. Это слитный белок нанолюциферазы с eIF4E, фермент совершенно не влияет на свойства этого инициирующего фактора.
3. С помощью математической модели предложена гипотеза о том, что определяющими факторами, влияющими на функцию uORF при стрессе это ее длина и контекст стартового кодона uORF. Это то, что можно будет проверить экспериментально. Подобные опыты планируются.
4. Обнаружена новая крайне необычная рамка считывания, перекрывающаяся с геном митохондриальной ДНК-полимеразы и кодирующая белок с мол. массой около 30 кД, названный нами PolGX. Удивительно, но стартовый кодон PolGX CUG почти столь же эффективен, что и AUG, благодаря особому контексту. Показано, что PolGX связывается с белком С1QBP, у которого есть сигнал митохондриальной локализации. Тем не менее, комплекс PolGX с C1QBP отправляет последний в ядрышко, где C1QBP, по-видимому, принимает участие в сборке цитоплазматических рибосом. Работа готовится к печати.
6. Открыт новый механизм регуляции трансляции, который назван "механизмом формирования молекулярной памяти". С помощью этого механизма регулируется трансляция Amd1 – ключевого фермента в регуляции полиаминов. Этот механизм открыт в том числе с помощью биохимических экспериментов, проведенных членом этого научного коллектива, Д.Е. Андреевым. Работа уже принята для публикации в журнале Nature.
7. Открыта регуляция по обратной связи для мРНК eIF4G2: фактор стимулирует трансляцию мРНК, кодирующего мРНК-связывающий белок PCBP2 (PolyC Binding Protein 2), а последний при накоплении связывается с 5'НТО мРНК eIF4G2 и подавляет его трансляцию.
Публикации
1. Иорданова М.М., Лофран Г., Жданов А.В., Мариотти М., Кинири С.Д., О'Коннор П., Андреев Д.Е., Тзани И., Сафферт П., Мишел А.М., Гладышев В.Н., Папковский Д.Б., Аткинс Д.Ф., Баранов П.В. AMD1 mRNA employs ribosome stalling as a mechanism for molecular memory formation Nature, - (год публикации - 2017)
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Предложена новая модель инициации синтеза белка в клетках млекопитающих, которая может открыть целое новое направление в исследованиях биосинтеза белка. Работа опубликована в авторитетном журнале Trends in Biochemical Sciences: Шатский И.Н., Теренин И.М., Смирнова В.В., Андреев Д.Е. (Shatsky I.N., Terenin I.M., Smirnova V.V., Andreev D.E.) Cap-Independent Translation: What's in a Name Trends in Biochemical Sciences (2018 г.)
Публикации
1. Андреев Д.Е., Арнольд М., Кинири С.Д., Лофран Г., Микел А.М., Рачинский Д., Баранов П.В. TASEP modelling provides a parsimonious explanation for the ability of a single uORF to derepress translation during the integrated stress response. Elife, 7. pii: e32563 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.7554/eLife.32563
2. Шатский И.Н., Теренин И.М., Смирнова В.В., Андреев Д.Е. Cap-Independent Translation: What's in a Name Trends in Biochemical Sciences, 43(11):882-895 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.tibs.2018.04.011
3. Андреев Д.Е., Дмитриев С.Е., Лофран Г.,Теренин И.М., Баранов П.В., Шатский И.Н. Translation control of mRNAs encoding mammalian translation initiation factors. Gene, 651:174-182 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.gene.2018.02.013
Возможность практического использования результатов
В перспективе такая возможность имеется, для использования в медицине, но надо еще хорошо поработать