Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проведено репрограммирование к плюрипотентному состоянию фибробластов пациентки с синдромом удлиненного интервала QT, имеющей мутацию T613M в гене KCNH2, посредством нуклеофекции эписомными векторами, экспрессирующими гены OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC и LIN28. Полученные в результате репрограммирования линии клеток экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния (щелочную фосфатазу, транскрипционные факторы NANOG и OCT4, поверхностные антигены SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81). Для пациент-специфичных линий клеток была также характерна транскрипция ряда генов (SOX2, KLF4, c-MYC, NODAL, EBAF, REX1, GDF3, FGF4, UTF1, GAL, GRB7, CD9, PODXL), экспрессирующихся в плюрипотентных клетках человека. Полученные клеточные линии были способны дифференцироваться в производные трех зародышевых листков. Было подтверждено наличие в пациент-специфичных линиях клеток мутации T613M в гене KCNH2. Таким образом, из фибробластов пациентки с мутацией T613M в гене KCNH2, вызывающей врожденный синдром удлиненного интервала QT 2-ого типа, были получены пациент-специфичные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Далее линии пациент-специфичных ИПСК были дифференцированы в кардиомиоциты с помощью протоколов, основанных на активации сигнального пути WNT/β-катенин (с помощью CHIR99021) и его последующем ингибировании (ингибитором WNT IWP2) (Lian et al., 2013; Burridge et al., 2014). Протоколы различались концентрацией ингибитора протеинкиназы GSK3β CHIR99021 (6 мкМ или 12 мкМ) для инициации дифференцировки ИПСК, сроком воздействия CHIR99021 на клетки (24 ч. или 48 ч.), а также используемой для дифференцировки средой. Во всех случаях происходило формирование спонтанно сокращающихся участков на 8-10 дни дифференцировки. Однако при использовании 12 мкМ CHIR99021 количество сокращающихся участков было значительно больше, чем при добавлении 6 мкМ CHIR99021. Среди дифференцированных клеток были выявлены клетки, экспрессирующие саркомерные белки кардиомиоцитов (кардиальный тропонин Т, саркомерный альфа-актинин, миозин) и транскрипционный фактор кардиомиоцитов NKX2.5. Оценка процентного содержания кардиомиоцитов при направленной дифференцировке линий ИПСК с мутацией T613M в гене KCNH2 показала, что наиболее эффективными являлись протоколы, в которых дифференцировка пациент-специфичных ИПСК запускалась добавлением 12 мкМ CHIR99021 на 48 ч. Доля кардиомиоцитов в данных протоколах составила около 50%. Следовательно, при направленной дифференцировке ИПСК с мутацией T613M в гене KCNH2 были получены клетки, обладающие способностью к спонтанным сокращениям и экспрессирующие основные маркеры кардиомиоцитов. Была проведена серия электрофизиологических исследований потенциала действия кардиомиоцитов, полученных из пациент-специфичных ИПСК с мутацией T613M в гене KCNH2, на разных стадиях их дифференцировки (на 30, 37, 42, 50, 57 и 70 дни дифференцировки), в контроле регистрировался потенциал действия кардиомиоцитов, полученных из ИПСК от индивида с нормальным QT интервалом (без мутаций). Показано, что на начальных этапах дифференцировки форма потенциала действия похожа на ту, что формируется в предсердных клетках. При сравнении кардиомиоцитов, полученных при дифференцировке нормальных ИПСК и ИПСК с мутацией, обнаружено, что во втором случае длительность потенциала действия имеет тенденцию увеличиваться со сроком дифференцировки. При этом в случае пациент-специфичных ИПСК линии if31-5 длительность потенциала действия зависима от частоты, и при низкой частоте длительность потенциала действия увеличивается. В компьютерном моделировании было показано, что травматические дефекты сердечной ткани могут играть аритмогенную роль из-за специфических граничных условий.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В отчетном году, в дополнение к имеющимся двум, были получены две линии человеческих ИПСК и из клеток каждой проведена дифференцировка в кардиомиоциты. Таким образом, в нашем распоряжении в настоящее время есть две линии клеток от здоровых доноров и две линии, имеющие мутации T613M в гене KCNH2, вызывающие синдром удлиненного интервала QT второго типа. Из фибробластов здорового донора с использованием нуклеофекции эписомными векторами, экспрессирующими гены OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC и LIN28, были получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК). Успешность репрограммирования фибробластов к плюрипотентному состоянию была подтверждена экспрессией в полученных линиях основных маркеров плюрипотентного состояния (щелочной фосфатазы, транскрипционных факторов NANOG и OCT4 и поверхностных антигенов SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81), а также способностью полученных линий дифференцироваться в производные трех зародышевых листков. Одна из линий ИПСК здорового донора, m34Sk3, а также линия ИПСК if31-8, ранее полученная от пациента с мутацией T613M в гене KCNH2, вызывающей синдром удлиненного интервала QT, были дифференцированы в кардиомиоциты, используя протокол, заключающийся в активации сигнального пути WNT/β-катенин (с помощью CHIR99021) и его последующем ингибировании (ингибитором WNT IWP2) (Burridge et al., 2014). На 8-9-ой дни дифференцировки наблюдалось формирование спонтанно сокращающихся участков для обеих линий ИПСК. Однако у линии m34Sk3 этот эффект достигался путем добавления 8 мкМ CHIR99021, в то время как для линии if31-8 необходимая концентрация CHIR99021 была 6 мкМ. Эффективность направленной дифференцировки составила 47% для линии m34Sk3 и 33,1% для линии if31-8. В дифференцированных клетках была выявлена экспрессия саркомерных белков кардиомиоцитов (кардиального тропонина Т, саркомерного альфа-актинина, тяжелой цепи β-миозина). Таким образом, были подобраны условия направленной дифференцировки в кардиомиоциты линий ИПСК m34Sk3 и if31-8. Все четыре линии с помощью пэтч-клампа были охарактеризованы электрофизиологически на разных стадиях дифференцировки. Подробно исследованы этапы становления и развития потенциала действия (ПД) кардиомиоцитов начиная с 10-го по 50-й день после начала дифференцировки в кардиомиоциты линий от здорового индивида (ISMA6L) и линий с мутацией, приводящей к синдрому LQT 2-ого типа (if 31-5 и if 31-13). Проведено электрофизиологическое исследование линии, не несущей мутаций LQTS при действии блокатора тока IKr, Е-4031. В результате исследования удалось уточнить этапы развития потенциалов действия и возникновения ионных токов на разных днях дифференцировки кардиомиоцитов. А именно, начало формирования потенциала действия приходится на 12-й-15-й день с начала дифференцировки здоровых пациент-специфичных линий и линий с мутацией, приводящей к синдрому LQT 2-ого типа. Далее ко дню 28-му заканчивается формирование полноценного потенциала действия и устанавливаются постоянные длительности потенциала действия (400 мс для кардиомиоцитов, полученных от здоровой линии и 600 мс для кардиомиоцитов, полученных от линии с мутацией). Относительно потенциалзависимых ионных токов было выяснено, что они начинают нормально функционировать в кардиомиоцитах уже на 12-й-15-й день от начала дифференцировки как при дифференцировки здоровых линий, так и линий с мутацией. Калиевые токи задержанного выпрямления нормально функционируют, детектируются и получается их разделить в кардиомиоцитах, полученных из здоровых линий без мутаций, а в кардиомиоцитах, полученных от линии с мутацией отсутствует быстрая компонента калиевого тока задержанного выпрямления, что и приводит к удлиненной длительности потенциала действия. С помощью компьютерного моделирования удалось установить биофизические механизмы повышенной аритмогенности при дефектах быстрой компоненты калиевого тока задержанного выпрямления (hERG каналы, IKr). С использованием детальных математических моделей Korhonen, ‎Ten Tusscher, и Алиева-Панфилова было показано, что при различных граничных условиях, варьировавшихся от условий отсутствия тока через границу (граничные условия фон-Неймана) до полностью проницаемой границы неоднородности (граничные условия Дирихле) наблюдается различная вероятность отрыва распространяющейся волны от препятствия с образованием волны реентри. Наблюдается максимум вероятности образования реентри при частичной проницаемости границы, соответствующей физиологической границе возбудимой/невозбудимой ткани. Показано, что наличие однородной анизотропии в среде на результат не влияет, приводя к линейному перемасштабированию, в соответствии с направлением анизотропии. Замена модели Korhonen на модель вентрикулярной человеческой сердечной ткани не приводила к существенной корректировке результата. Однако, модель ‎Ten Tusscher и Алиева-Панфилова позволяла варьировать проводимость проводимости быстрого входящего калиевого тока Ikr, вводя в модель значения, соответствующие ионным токам, измеряемым при синдроме LQT второго типа. В этом случае, вероятность образования реентри на препятствии возрастала на 40-70 %, в зависимости от частоты распространяющихся волн. Полученные данные позволили нам предложить экспериментальную модель теста на аритмогенность.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. В ходе выполнения проекта была создана тканево-инженерная модель, позволяющая исследовать образование реентри в человеческой сердечной ткани при синдроме LQT. Эта модель представляет собой слой кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК и самоорганизующихся в подобие сердечной ткани (сердечный синцитий) с рядом стандартных параметров. Проверена гипотеза о решающей роли неоднородностей особого типа, взаимодействующих с распространяющейся волной возбуждения, для возникновения реентри в сердечной ткани. В наших исследованиях было обнаружено, что наиболее вероятным механизмом возникновения реентри в сердечной ткани является взаимодействие распространяющихся волн возбуждения с неоднородностью, при превышении критической частоты следования волн. Было известно, что резкое увеличение частоты сокращений сердца, физиологическое или при внешней стимуляции миокарда, может приводить к эпизодам тахиаритмии, нередко переходящим в фибрилляцию. Высказывались гипотезы, что образование реентри в такой системе может происходить из-за неоднородностей рефрактерности сердечной ткани (КринскийVI, Biofizika1968, Jalife, Circulation Res 2013) или из-за стимуляции в так называемое "уязвимое окно" (Starmer CF, Biophys J 1993). Моделирование процесса смены ритма на слоях культивированных кардиомиоцитах показало несостоятельность гипотезы "уязвимого окна", т.к. без внешней стимуляции этого эффекта достичь не удается. Была подтверждена роль неоднородностей в образовании реентри и переходе к хаотическому режиму распространения возбуждения. Таким образом, для сравнительного анализа аритмогенного действия различных препаратов, также, как и сравнения вероятности образования реентри в слоях здоровых клеток и сердечных клеток с каналопатией, было предложено использовать взаимодействие волн вознуждения со стандартизированной неоднородностью. 2. Была детально исследована зависимость активности калиевых каналов от стадии дифференцировки, а именно, изучался быстрый калиевый ток задержанного выпрямления IKr hERrG-каналов на разных стадиях развития ИПСК от здоровой линииISMA6L. Установлено, что формирование ионного тока IKr 8-й, 12-й и 15-й день от начала дифференцировки не имеет видимых подтверждений. Только начиная с 18-го дня от начала дифференцировки мы отмечаем начало формированиеIKr, который начинает заметно возрастать после этого дня и к 29-му дню отначала дифференцировки Ikr уже имеет сформированный вид хвостового тока. Стоит отметить, что формирование медленного калиевого тока задержанного выпрямления IKs уже на 15-й день является нормальным для данного ионного тока с амплитудой выше 200 пА. Вследствие этого можно сделать выводы, что в созревании кардиомиоцитов в электрофизиологическом смысле самым поздним оказывается ток IKr. 3. Проверена эффективность экспериментального теста на аритмогенность, включающего дифференцированную из ИПСК сердечную ткань и стандартную неоднородность. В подавляющем большинстве современных экспериментальных моделей, позволяющих изучать и анализировать случаи возникновения реентри на ткани из желудочковых кардиомиоцитов, разрывы волн могут возникать на случайных неоднородностях, хаотически расположенных по всему образцу. Это усложняет интерпретацию данных о случаях нарушения проведения в образце, необходимую для четкого определения механизма разрыва волн в случае с удлиненным QT интервалом. Для решения этой проблемы, экспериментальная тканево-инженерная модель была дополнена стандартной неоднородностью, представляющей собой острый разрез на ткани со стандартной толщиной порядка 30 мкм. Важная роль стандартной неоднородности заключается в том, что именно в ее окрестности фиксировались и учитывались случаи возникновения реентри как у здоровой ткани, так и у ткани с индуцированным LQT2. Это позволило обобщать результаты экспериментов посредством вероятностной меры аритмогенности. 4. Эффективность теста проверена как для сердечной ткани, содержащей наследуемые мутации, приводящие к синдрому LQT, так и для ряда фармпрепаратов(E-4031, лидокаин, эритромицин), в качестве побочного действия вызывающих синдром LQT. Была изучена роль эритромицина в формировании ре-ентри в монослое человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК линии m34Sk3 здорового донора и в монослое крысиных кардиомиоцитов. В качестве тестируемого вещества использовали эритромицин, макролидный антибиотик, который пролонгирует интервал QT и потенциально индуцирует TdP.Скорость проводимости и максимальная усваиваемая частота (максимальная частота стимуляции, при которой каждый стимул сопровождался ответом) оценивали с использованием метода оптического картирования при концентрациях эритромицина 15, 30 и 45 μМ. Определена аритмогенность эритромицина на стандартной неоднородности — на линейном препятствии, расположенном перпендикулярно направлению распространения волны возбуждения. Экспериментально продемонстрирован механизм образования волн ре-ентри и вероятность их появления в зависимости от частоты стимуляции и концентрации эритромицина. Предложенный метод был подтвержден (валидирован) при помощи двух модельных систем: монослоя человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК линии m34Sk3 здорового донора и монослоя неонатальных крысиных кардиомиоцитов. Поскольку значение максимальной усваиваемой частоты соотносится с общей длительностью потенциала действия и периода рефрактерности, уменьшение этого параметра указывает на пролонгацию суммы вышеуказанных характеристик и косвенно подтверждает действие эритромицина на ток IKr. Калиевый ток IKr присутствует в клетках человека, но отсутствует в клетках крыс. Терапевтическая эффективная концентрация эртромицина составляет около 30 μМ, а полученный в данном исследовании кардиотоксический эффект (уменьшение максимальной усваиваемой частоты) наблюдался при воздействии эритромицина в концентрациях 15–45 μМ. В экспериментах со стандартной неоднородностью в монослое человеческих кардиомиоцитов, полученных из ИПСК линии m34Sk3 здорового донора, образование ре-ентри на конце препятствия наблюдалось при воздействии 15 и 30 μМ эритромицина при частотах стимуляции свыше 1,67 Гц, и отсутствовало при 45 μМ во всем диапазоне частот (1–3,33Гц). Эти данные свидетельствуют о наличии «окна» концентраций, при котором лекарственное средство приводит к образованию ре-ентри, и в котором эритромицин следует вводить с особой осторожностью. Например, терапевтическая эффективная концентрация эритромицина (30 μМ) может быть опасна. Таким образом, небольшие дозы препарата с конечной концентрацией, не превышающей 15 μМ, вероятно, целесообразны для лечения пациентов с повышенной частотой сердечных сокращений (т.е. выше 100 ударов в минуту).