КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-14-10224

НазваниеФизиологические и молекулярные механизмы адаптации хвойных растений к засухе

РуководительКузнецов Владимир Васильевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2016 - 2018

КонкурсКонкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-206 - Физиология и биохимия растений

Ключевые словаСосна обыкновенная, ель европейская, адаптация, транспирация, водный статус, ФСII, химические шапероны, дегидрины, экспрессия генома, АБК, аквапорины, антиоксиданты

Код ГРНТИ34.31.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Актуальность научной проблемы данного проекта обусловлена неблагоприятными глобальными изменениями климата, которые проявляются в возрастании частоты и продолжительности засух (Мохов, 2011). На глобальном уровне засуха оказывает наибольшее негативное воздействие на стабильность и продуктивность лесных экосистем (Anderegg et al., 2013). Это воздействие проявляется в ингибировании роста сеянцев, снижении продуктивности лесных насаждений, увеличении восприимчивости древостоев к биопатогенам и насекомым-вредителям, а также в повышении уровня пожароопасности в лесах (Reichstein et al., 2013). Серьезный прогресс в изучении механизмов устойчивости растений к условиям засухи, достигнутый в последние годы, касается в основном травянистых растений, тогда как данные по воздействию водного дефицита на хвойные растения немногочисленны и фрагментарны. Это определяет высокую степень новизны решаемых в проекте задач и позволяет рассматривать выяснение физиологических и молекулярных механизмов адаптации хвойных растений к засухе в качестве актуальной фундаментальной проблемы. Исследования будут проводиться, преимущественно, в модельных экспериментах на сеянцах сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и ели европейской (Picea abies (L.) H.Karst.) на ранней стадии онтогенеза, характеризующейся наименьшей устойчивостью к неблагоприятным воздействиям (Kozlov, Zvereva, 2007). В работе будут использованы современные физиологические, биохимические, биофизические и молекулярные методы исследования. В рамках проекта серьезное внимание будет уделено способности сеянцев сосны и ели сохранять водный баланс в условиях засухи, что является ключевым условием выживания организма при водном дефиците. С этой целью будут изучены физиологические (интенсивность транспирации, оводненность тканей, RWC и клеточный осмотический потенциал) и молекулярные процессы (экспрессия генов аквапоринов и уровень кодируемых ими белков, обеспечивающих трансмембранный перенос молекул воды; экспрессия генов дегидринов, играющих важную роль в условиях острого водного дефицита). Планируется получить новые данные по формированию и функционированию у хвойных в условиях интенсивного водного дефицита двух основных клеточных стресс-протекторных систем: одна из которых обеспечивает осморегуляцию и защиту макромолекул от повреждения (осмолиты, такие как пиннит, пролин и др.), вторая регулирует окислительный статус (антиоксидантные системы). Для характеристики антиоксидантной системы будет исследована динамика активностей основных антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, аскорбатпероксидазы, глутатионредуктазы) и общая антиоксидантая активность низкомолекулярных органических соединений в корнях и хвое сеянцев, а также содержание глутатионов (восстановленной и окисленной форм) и аскорбиновой кислоты. Обе эти протекторные системы обеспечивают защиту макромолекул и мембран при стрессе, когда механизмы поддержания водного гомеостаза уже исчерпали свой потенциал. Предполагается секвенировать транскриптом сосны обыкновенной и ели европейской в условиях засухи, а также всех клеточных транскриптов микроРНК, что позволит идентифицировать тургор-регулируемые гены и потенциальные мишени обнаруженных нами микроРНК. Будут получены новые данные по функционированию фотосинтетического аппарата у сравниваемых видов хвойных в условиях интенсивного водного дефицита. В частности, будет оценен раздельный вклад устьичного и неустьичного лимитирования фотосинтеза у сеянцев сосны и ели в условиях засухи за счет совместного использования методов СО2/Н2О-газометрии и PAM-флуориметрии, что крайне важно для понимания физиологических основ повреждающего действия водного дефицита на фотосинтез. Предусмотрено изучение экспрессии генов метаболизма абсцизовой кислоты и динамики ее содержания в органах сеянцев сосны и ели при засухе, поскольку АБК является гормоном стресса и играет важнейшую роль в регуляции ответа растений на водный дефицит. Заключительным этапом данного проекта будет сравнительное изучение засухоустойчивости естественных взрослых хвойных древостоев, расположенных в различных географических регионах России. Эта часть работы будет основана на разработанных нами в модельных экспериментах физиологических критериях оценки, и позволит установить, одинаковые или различные стратегии адаптации к водному дефициту используют взрослые сосновые и еловые древостои, и изменяются ли эти стратегии на разных этапах онтогенеза. В ходе выполнения проекта, который соответствует мировому уровню, будут получены новые приоритетные экспериментальные данные, описывающие физиологические и молекулярные механизмы адаптации хвойных растений к засухе. Наряду с фундаментальным значением, новые результаты будут необходимы для разработки технологий лесовосстановления и лесоразведения хозяйственно ценными хвойными породами в условиях неблагоприятных изменений глобального климата.

Ожидаемые результаты
Проект посвящен изучению физиологических и молекулярных механизмов адаптации хвойных к засухе. Эта тема продиктована глобальными изменениями климата, которые сопровождаются частыми и продолжительными засухами, оказывающими наибольшее негативное воздействие на стабильность и продуктивность лесных экосистем (Anderegg et al., 2013). Для снижения экономического, экологического и социального ущерба от аридизации климата, крайне актуально исследовать механизмы засухоустойчивости хвойных, знания о которых носят весьма ограниченный и фрагментарный характер (Waines, Endaie, 2007; McDowell et al., 2008; Gevin, 2010; Brunner et al., 2015). В рамках данного проекта предполагается получить новые приоритетные данные о стратегии и механизмах адаптации сосны обыкновенной и ели европейской к водному дефициту, реализуемых на клеточном и организменном уровнях. 1. В строго контролируемых условиях будут оценены уровни засухоустойчивости сеянцев двух различных по требовательности к влаге видов хвойных: сосны обыкновенной и ели европейской. Для этого будут исследованы следующие критерии: выживаемость при водном дефиците разной интенсивности и продолжительности, а также способность поддерживать интегральные физиологические процессы (рост, водный баланс, фотосинтез, окислительный статус и другие) в условиях стресса. 2. Будут получены новые данные о способности исследуемых растений поддерживать водный гомеостаз при засухе. С этой целью будут исследованы физиологические процессы (интенсивность транспирации, оводненность тканей, RWC и осмотический потенциал содержимого клеток) и молекулярные события, играющие важную роль при водном дефиците (экспрессия генов аквапоринов и уровень кодируемых ими белков, обеспечивающих трансмембранный перенос молекул воды; экспрессия генов дегидринов, играющих важную роль в условиях жесткого водного дефицита). На этом основании будут сделан вывод о том, какой из двух сравниваемых видов эффективнее сохраняет водный статус при стрессе, т.е. более эффективно использует стратегию «ухода» от действующего фактора. 3. Впервые будут детально исследованы формирование и функционирование у хвойных в условиях интенсивного водного дефицита двух важных клеточных стресс-защитных систем. Одна из них обеспечивает осморегуляцию и защиту макромолекул от повреждения (осмолиты, такие например, как пинит, мио-инозит и пролин), вторая регулирует окислительный статус клетки (антиоксидантная система). Для этого планируется изучение аккумуляции осмолитов и функционирования антиоксидантной системы, включающей анализ динамики активностей основных антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы, аскорбатпероксидазы, глутатионредуктазы) и характеристику низкомолекулярных антиоксидантов (суммарная антиоксидантная активность, содержание глутатиона (восстановленной и окисленной форм) и аскорбиновой кислоты и пр.). Методами флуоресцентной микроскопии будут впервые охарактеризованы особенности развития окислительного стресса в тканях корня исследуемых видов растений при водном дефиците. 4. Предполагается получить принципиально новые данные по функционированию фотосинтетического аппарата у сравниваемых видов хвойных в условиях интенсивного водного дефицита. В частности, будет исследован раздельный вклад устьичного и неустьичного лимитирования фотосинтеза у сеянцев сосны и ели в условиях засухи за счет совместного использования методов СО2/Н2О-газометрии и PAM-флуориметрии для характеристики функционирования фотосистемы II в условиях стресса. Это крайне важно для понимания физиологических основ повреждающего действия засухи на фотосинтез. 5. Будут получены важные данные по анализу изменений транскриптомов хвойных сравниваемых видов в ответ на засуху. В ходе сравнительного анализа транскриптомов сеянцев сосны и ели будут выявлены кластеры генов, экспрессия которых регулируется водным дефицитом, что имеет ключевое значение для понимания молекулярных механизмов засухоустойчивости сеянцев сосны и ели. Будет проведено сравнительное секвенирование микроРНКнома для установления спектра стресс-регулируемых микроРНК и идентификации их мишеней. 6. Будет изучена динамика содержания абсцизовой кислоты и профили содержания транскриптов генов ее метаболизма в органах исследуемых видов для характеристики стресс-регулирующего ответа хвойных древесных растений на водный дефицит. Эти данные представляют несомненный научный интерес, поскольку АБК может выступать в качестве стрессорного гормона, регулирующего ответ древесных растений на засуху. Авторским коллективом успешно выполнены предварительные исследования по функционированию защитных систем хвойных растений при различных видах стресса (см. пп. 4.8. Формы 4), что позволяет претендовать на лидерство в изучении механизмов адаптации хвойных растений к засухе. В результате выполнения проекта будет получена принципиально новая приоритетная информация о физиологических и молекулярных механизмах адаптации растений сосны и ели к водному дефициту, представляющая не только фундаментальный интерес, но и имеющая важное практическое значение. Оценка адаптационного потенциала сосны и ели на ранних этапах онтогенеза может лечь в основу прогнозирования продуктивности хвойных лесов в условиях неблагоприятных климатических изменений. Данные, полученные при реализации проекта, могут быть использованы в разработке технологий лесовосстановления, лесовозобновления и плантационного лесоводства для создания устойчивых лесных древостоев. Результаты, полученные при выполнении проекта, будут опубликованы не менее чем в 8 научных статьях журналов, индексируемых в базах данных Web of Science или Scopus. Полученные результаты будут доложены на российских и международных конференциях, а так же будут включены в лекции для студентов университетов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. В результате проведения большой серии экспериментов было установлено, что водная культура, по сравнению с агроперлитной культурой, является наиболее предпочтительной для выращивания сеянцев сосны обыкновенной и ели европейской и моделирования условий засухи. Нами подобраны условия выращивания сеянцев, при которых срок получения биологического материала для проведения экспериментов оказывается вдвое короче, чем при использовании агроперлитной культуры. Несмотря на трудоемкость постановки экспериментов, высокую стоимость ПЭГ6000, необходимого для моделирования водного дефицита (ВД), именно водная культура обеспечивает получение выровненного экспериментального материала в сравнительно короткие сроки (через 7-8 недель) и позволяет изучать функционирование неповрежденной корневой системы сеянцев, что принципиально важно для исследования адаптации растений к засухе. Во всех экспериментах имитировали развитие прогрессирующей почвенной засухи, для чего ПЭГ6000 равными долями вносили в среду в течение 5 суток до достижения определенного уровня водного потенциала среды с последующим поддержанием ВД на стабильном уровне. 2. Впервые получены обстоятельные данные о развитии сеянцев сосны и ели в условиях ВД, индуцированного ПЭГ6000 в водной культуре. Подробно изучены особенности водного баланса и характер изменения ростовых процессов у растений. Показано, что по ряду физиологических параметров сосна более устойчива к водному дефициту, по сравнению с елью. Обнаружено, что прирост массы сеянцев сосны останавливался на первые сутки эксперимента при -1,5 МПа, и на 7-е сутки – при -1,0 МПа. До этого момента у сеянцев регистрировалось увеличение числа хвоинок, свидетельствующее об активности апикальной меристемы побега. В отличие от сосны, рост всех органов сеянцев ели был заторможен уже на 1-е сутки эксперимента (-1,0 МПа). Важной отличительной чертой сеянцев сосны, произраставших при экстремально низких значениях водного потенциала (-1,0 и -1,5 МПа), оказалось многократное повышение содержания АФК в корневой системе, в то время как у сеянцев ели данного эффекта не наблюдалось. При значениях водного потенциала питательного раствора -0,49 МПа у сеянцев ели наблюдалось ингибирование апикальных меристем (остановка роста главного корня и образования хвоинок). В отличие от ели, у сосны в этих условиях продолжалось увеличение числа хвоинок и рост боковых корней и главного корня в длину. 3. Обнаружены видовые различия водного потенциала хвои сеянцев сосны и ели контрольной группы. Впервые установлено, что водный потенциал хвои ели был в 1,4 раза ниже, чем у сосны, что позволяло сохранять водопоглотительную способность клеток корня при умеренном ВД. Выявлено значимое снижение водного потенциала хвои обоих видов растений с падением осмотического потенциала питательного раствора. В опытных вариантах (-0,15 и -0,49 МПа) значения водного потенциала хвои ели были ниже, чем хвои сосны. Временной динамики водного потенциала хвои обоих видов не отмечено. У сеянцев сосны и ели питательный раствор с расчетным осмотическим давлением -1,5 МПа вызывал снижение расчетного гидростатического потенциала на 6-е сутки эксперимента, что свидетельствовало о падении тургора клеток и процессе увядания хвои. 4. У контрольных сеянцев сосны не обнаруживалось достоверных различий в CO2/H2O-газообмене хвои. Повышение осмотического давления питательного раствора сопровождалось снижением фотосинтетического СО2-газообмена хвои по сравнению с контролем, хотя дыхательный СО2-газообмен хвои опытных растений в темноте не изменялся. Заметное снижение транспирации на свету у сеянцев сосны отмечали лишь при -1,0 и -1,5 МПа. В этих условиях также было характерно снижение водного потенциала на поверхности клеток мезофилла в подустьичной полости хвои, следствием чего явилось усиление способности поглощать воду клетками корня и транспортировать ее в хвою, а также сокращение потери воды за счет ингибирования транспирации при ВД. У сеянцев ели снижение фотосинтетического СО2-газообмена было более выраженным, чем у сосны. Высокая чувствительность процесса фиксации углерода к водному дефициту подтверждалась более сильным ингибированием роста сеянцев ели в сравнении с сосной. Особенностью газообмена на свету хвои сеянцев ели были также околонулевые значения транспирации, что свидетельствовало о резком ингибировании транспирации в условиях ВД. Значимых изменений в содержании пигментов между опытными вариантами хвои сосны и ели не обнаруживалось (до 10-х суток эксперимента). На 10-е сутки опыта у сосны, в отличие от ели, отмечались визуально различимые признаки хлороза хвои (-0,15 и -0,49 МПа), которые усиливались к 15-м и 21-м суткам. У сосны достоверное снижение максимального квантового выхода фотосинтеза фотосистемы II (Fv/Fm), связанного с увеличением нефотохимического тушения флуоресценции, отмечали только в варианте опыта -1,5 МПа. Полученные данные свидетельствуют о наличии у сосны дополнительно к устьичной регуляции, также неустьичных фотохимических реакций, приводящих к снижению фиксации углерода. Хвоя опытных вариантов (-0,15 и -0,49 МПа) сеянцев ели не отличалась по показателям максимального квантового выхода фотосинтеза ФСII (Fv/Fm) от контроля. Фотосистемы II контрольных растений сосны и ели заметно различались по уровню нефотохимического тушения. Фотосистема II ели отличалась высоким и стабильным показателем NPQ на протяжении всего опыта. Впервые продемонстрировано, что при низких значениях водного потенциала питательного раствора (≤ -1,03 МПа) устьица являются не единственной причиной снижения СО2/Н2О-газообмена хвои сеянцев сосны. Другим фактором уменьшения фотосинтеза в варианте опыта -1,5 МПа было ингибирование электрон-транспортной цепи хлоропласта в результате снижения максимального квантового выхода флуоресценции хлорофилла. Фотосинтез в хвое сеянцев ели, наоборот, почти полностью зависел от устьичной компоненты лимитирования. 5. В условиях водного дефицита у обоих видов растений (за исключением варианта -0,15 МПа у ели) отмечалось значительное снижение содержания калия в корнях сеянцев, коррелирующее с величиной осмотического давления питательного раствора. В корнях сосны падение содержания калия (-0,15 и -0,49 МПа) стабилизировалось на уровне в два раза ниже контрольного лишь к 7-м суткам эксперимента. В корнях сеянцев ели содержание калия при -0,49 МПа стабилизировалось на 16% ниже контрольного, тогда как при -0,15 МПа содержание ионов калия соответствовало контролю. Отсюда следует, что хотя общее содержание ионов калия в тканях корня сосны и ели было значительно (400-600мкмоль/г сухой массы), изменение содержания этого элемента не являлось существенным для поддержания водного баланса в условиях ВД. При летальных значениях осмотического потенциала раствора (-1,03 и -1,52 МПа) содержание калия в корнях сеянцев уже с первых суток опыта снижалось в 2,5-3,0 раза, что свидетельствует о нарушении избирательной проницаемости мембран и выходе калия из клеток. Динамика содержания кальция в корневой системе сеянцев сосны и ели при водном дефиците значительно различалась. В корнях сосны в условиях умеренного (-0,15 МПа) и сильного (-0,49 МПа) ВД содержание кальция не отличалось от контрольного. Напротив, в корнях сеянцев ели содержание кальция возрастало на 30-40% при умеренном стрессе и в 2 раза – при сильном. Схожим образом изменялось содержание в корнях магния. По всей видимости, при ВД кальций и магний играли значительную роль в поддержании водного баланса клеток корней ели, но не сосны. При значениях осмотического потенциала питательного раствора менее -1,0 МПа наблюдалось многократное (в 5 и более раз) повышение содержания ионов кальция в клетках корня сосны и ели в начальный период воздействия; нами высказано предположение, что резкое повышение содержания кальция в клетках корня может служить надежным индикатором их гибели. 6. Впервые обстоятельно изучена динамика жизнеспособности клеток корня сеянцев сосны и ели в условиях ВД различной интенсивности. Показано, что даже умеренное (-0,15 МПа) понижение водного потенциала питательного раствора приводит к двукратному снижению жизнеспособности клеток корня обоих видов к первым суткам эксперимента. При указанной интенсивности стресса сеянцы сосны, в отличие от ели, полностью восстанавливали жизнеспособность клеток корня к окончанию эксперимента, что свидетельствует о различном адаптационном потенциале сравниваемых видов в условиях умеренного (-0,15 МПа) водного дефицита и о высокой регенерационной способности коревой системы сосны. При понижении водного потенциала питательного раствора (до -0,49 МПа и менее) у обоих видов растений наблюдалось 3-5-кратное падение уровня флуоресцентного сигнала FDA, не связанное с увеличением ВД. Отсюда следует, что оценка жизнеспособности клеток с помощью флуоресцентного красителя FDA может считаться надежным индикатором, как при умеренном (-0,15 МПа), так и при сильном (-0,49 МПа) стрессорном воздействиях. В клетках корня сеянцев сосны резкое возрастание флуоресцентного сигнала красителя H2DCFDA, свидетельствующее о развитии окислительного стресса, отмечалось с первых суток и до конца эксперимента только при критических значениях ВД (-1,0 и -1,5 МПа). У сеянцев ели, напротив, значимых изменений в уровнях АФК в клетках корня не отмечалось на протяжении всего эксперимента ни в одном из опытных вариантов. Это свидетельствует о том, что в клетках корня сосны окислительный стресс может быть важным повреждающим фактором только при летальной засухе, в то время как в клетках корня ели, окислительный стресс не индуцируется в условиях ВД.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
1. Впервые для хвойных растений была обстоятельно изучена динамика содержания стресс-индуцируемого гормона растений – абсцизовой кислоты (АБК) и основных продуктов ее метаболизма в условиях различной интенсивности водного стресса в корнях и хвое растений сосны и ели. Показано, что общее содержание АБК преобладало над содержанием продуктов ее метаболизма в корнях и хвое обоих видов. Установлено, что в хвое обоих видов растений изменения содержания АБК и основных продуктов ее метаболизма были более выраженными, чем в корнях. При этом наиболее значительные изменения в метаболизме АБК отмечались в корневой системе сосны в начальных точках эксперимента. 2. Установлено, что водный дефицит вызывает сильное дозозависимое повреждение мембран клеток корня сосны и ели. С учетом полученных в прошлом году результатов о сильном снижении физиологической активности клеток корня и значительных изменениях в их ионном обмене можно утверждать, что водный стресс оказывает сильное и комплексное негативное воздействие на корневую систему обоих видов хвойных. Существенная стимуляция водным дефицитом рост корневых волосков ели свидетельствует о том, что увеличение водопоглощающей поверхности корня является важным механизмом адаптации сеянцев к умеренному водному дефициту. 3. В условиях водного дефицита в надземной части сеянцев сосны значительно усиливались симптомы окислительного стресса, выражавшиеся в накоплении продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Для сеянцев ели был характерен высокий конститутивный уровень продуктов ПОЛ, который значительно не изменялся в условиях водного стресса. При этом преобладающую роль в составе продуктов ПОЛ у обоих видов играл 4-гидроксиноненаль. 4. Не было обнаружено значительной перестройки функционирования антиоксидантной системы растений сосны и ели в условиях водного дефицита. По всей вероятности, хотя водный дефицит и приводит к нарушению окислительно-восстановительного баланса в сеянцах сосны и ели, однако окислительный стресс не является основным повреждающим фактором водного дефицита в данных условиях. Вероятной причиной этого является существенное торможение ростовых и физиологических процессов в сеянцах и высокая стабильность работы фотосинтетического аппарата в условиях водного дефицита. 5. Было обнаружено, что пул сахаров и сахароспиртов в условиях водного дефицита значительно возрастал в хвое и снижался в корнях сосны, что может указывать на перераспределение ассимилятов по растению при водном дефиците. Для растений ели эти изменения не были характерны. Основными сахарами в обоих видах были сахароза, глюкоза и фруктоза, а также сахароспирт 5-О-метил-миоинозит. При этом предварительный анализ вклада пула сахаров и сахароспиртов в создание осмотического давления клеточного сока показал, что эти соединения в целом обусловливают лишь около 10% осмотического давления в соответствующих органах. Однако, учитывая малый вклад (порядка 5-10%) цитоплазмы в общий объем протопласта, данные соединения могут играть значительную роль в формировании осмотического потенциала цитоплазмы клеток. 6. Установлено, что на транскрипционном уровне ответ на засуху был значительно более выражен в корнях сеянцев сосны и ели, нежели в хвое. Наиболее заметны в обоих видах были изменения в экспрессии генов метаболизма углеводов и фенольных соединений. В корнях ели резко активировалась экспрессия генов ответа на биотический стресс, что может быть отражением частичной универсальности защитных механизмов в растениях в отношении действия стрессовых факторов различной природы. Для сосны было характерно усиление экспрессии генов, вовлеченных в транспорт металлов, что может быть результатом снижения интенсивности поглощения растением питательных элементов ввиду снижения транспирационного тока и общей интенсивности транспортных процессов при водном стрессе. Четкой реакции генов биосинтеза АБК и АБК-зависимого сигналинга на десятые сутки эксперимента обнаружено не было, хотя водный стресс оказывал значительное влияние на гены метаболизма и сигналинга других гормонов. Происходила значительная перестройка состояния и функционирования клеточных сигнальных систем в обоих видах. 7. Были подобраны праймеры для генов ферментов синтеза АБК, аквапоринов и дегидринов для сосны и ели с целью изучения их экспрессии методом ПЦР в реальном времени. Все праймеры проверены на соответствие генам интереса и специфичность путем секвенирования продуктов ПЦР. 8. С использованием методов лесной таксации отобраны и подготовлены для полевых работ участки с контрастными условиями гидрологического режима с преобладанием сосны или ели. На данных участках с модельных деревьев сосны и ели отобраны керны древесины, по которым выполнен дендрохронологический анализ влияния природно-климатических условий на рост растений. 9. Установлено, что механизмы, связанные с изменением симпластного объема клеток хвои, играют значительную роль в поддержании высокой устойчивости ростовых процессов сеянцев сосны к водному дефициту. Наблюдавшиеся явления согласуются с обнаруженным усилением экспрессии целого ряда генов, вовлеченных в ремодуляцию клеточной стенки в сосне в условиях водного стресса. Для ели данные изменения были не характерны, в связи с чем ее рост был очень чувствителен к падению оводненности тканей. 10. Обнаружено, что при нормальном водоснабжении у сеянцев обоих видов наблюдалось сильное акцепторное лимитирование в фотосистеме I. Водный дефицит вызывал значительные изменения характера световых реакций в обоих исследованных видах, однако в результате интенсивность транспорта электронов практически не испытывала влияния водного дефицита. Интенсивность циклического транспорта электронов в фотосистеме I обоих видов была очень низка. Полученные данные свидетельствуют о том, что интенсивность фотосинтеза обоих видов как в контрольных условиях, так и при водном дефиците может в значительной степени лимитироваться интенсивностью газообмена, а не активностью световых реакций. 11. Были опубликованы две статьи, и поданы две рукописи статей, принятых в печать, к моменту подачи отчета. В статьи вошли экспериментальные данные, полученные в 2016-2017 гг., а также разработанные в процессе реализации проекта методологические подходы, необходимые для выполнения плана работ по проекту. Был разработан метод количественного определения водного потенциала апопласта клеток мезофилла в подустьичной полости листа (Воронин и др. 2017) и адаптирован метод определения уровня физиологической активности клеток корней методом флуоресцентной микроскопии (Zlobin et al., 2017).

 

Публикации

1. Воронин П.Ю., Рахманкулова З.Ф., Тарнопольская Е.Е., Кузнецов Вл.В. Закрывание устьиц хвои сосны в условиях водного дефицита определяется снижением водного потенциала апопласта мезофилла подустьичной полости Russian Journal of Plant Physiology, - (год публикации - 2018).

2. Воронин П.Ю., Рахманкулова З.Ф., Шуйская Е.В., Маевская С.Н., Николаева М.К., Максимов А.П., Максимов Т.Х., Мясоедов Н.А., Балнокин Ю.В., Рымарь В.П., Валдайских В.В., Кузнецов Вл.В. New method for quantitative determination of water potential of mesophyll cells’ apoplast in substomatal cavity of the leaf Russian Journal of Plant Physiology, V. 64, № 3, P. 452–456 (год публикации - 2017).

3. Злобин И.Е., Карташов А.В., Шпаковский Г.В. Different roles of glutathione in copper and zinc chelation in Brassica napus roots Plant Physiology and Biochemistry, V. 118, P. 333-341 (год публикации - 2017).

4. Иванов Ю.В., Злобин И.Е., Карташов А.В., Пашковский П.П., Кузнецов Вл.В. Scale of Physiological Processes Sensitivity to PEG-Induced Water Stress in Scots Pine Seedlings Russian Journal of Plant Physiology, - (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Методами ПЦР в реальном времени проанализирована экспрессия генов, кодирующих ферменты всех этапов биосинтеза АБК. Для генов β-каротингидроксилаз в корнях и хвое обоих видов растений отмечалось усиление экспрессии на 1-е сутки эксперимента с последующим снижением к 10-м суткам. Экспрессия генов зеаксантинэпоксидаз в корнях ели проявляла выраженную тенденцию к снижению экспрессии. Экспрессия генов 9-цис-эпоксикаротиноиддиоксигеназ значительно активировалась в корнях и хвое сосны на 10-е сутки эксперимента, а в хвое ели наблюдалась активация экспрессии уже на 1-е сутки. Экспрессия генов короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктаз SDR1 в условиях водного стресса выраженно снижалась в корнях обоих видов растений. В хвое, напротив, наблюдались разнонаправленные изменения уровней экспрессии, как в контрольных условиях, так и при водном дефиците. Экспрессия гена АБК-альдегидоксидаз резко повышалась в условиях длительного воздействия сильного (-0,5 МПа) водного дефицита в корнях ели. Общим для обоих видов растений было значительное повышение уровня экспрессии генов β-гликозидаз к 10-м суткам эксперимента. При этом временные паттерны изменения экспрессии генов биосинтеза АБК не коррелировали с соответствующими изменениями ее содержания, которое повышалось в корневой системе и в хвое обоих видов уже на 1-е сутки эксперимента. Значительный рост экспрессии генов β-гликозидаз также не сопровождался соответствующим понижением содержания гликозильного эфира АБК. На этом основании можно предположить, что уровень транскриптов генов ферментов биосинтеза АБК у сеянцев сосны и ели не лимитирует ее биосинтез при водном дефиците. 2. Водный дефицит стимулировал экспрессию генов плазмалеммных аквапоринов в хвое обоих видов растений; при этом активированные последовательности генов различались у сосны (P1112) и ели (P2122). Напротив, в корнях растений обнаружено значительное снижение уровней транскриптов генов плазмалеммных аквапоринов. В корнях и хвое сосны, в отличие от ели, наблюдалось увеличение экспрессии генов тонопластных аквапоринов T14 и T21. Вероятно, усиление экспрессии генов тонопластных аквапоринов у сосны является механизмом поддержания водного баланса цитоплазмы и сохранения водного гомеостаза между основными клеточными компартментами, в противоположность ели, у которой дегидратация клеток при водном дефиците менее выражена. 3. В условиях водного дефицита в корнях и хвое сосны наблюдалось многократное увеличение экспрессии генов дегидринов группы К2. Рост уровня транскриптов генов дегидринов групп ESK2 и AESK в органах сосны был менее выраженным. В корнях и хвое ели в ответ на водный дефицит наблюдалось резко выраженное возрастание уровня транскриптов гена Dhn6, в то время как остальные гены дегидринов не обнаруживали подобной реакции. Примечательно, что гены Dhn6 в ели и K2 в сосне обладают схожей доменной структурой (т.е. содержат исключительно К-домены). Вероятно, повышение устойчивости клеток к дегидратации осуществляется, в первую очередь, наиболее простыми по структуре дегидринами. Наблюдаемое нами увеличение уровней транскриптов генов дегидринов различных групп в органах сосны согласуется с более выраженным снижением в них содержания воды в условиях водного дефицита, в сравнении с сеянцами ели. 4. Методом Вестерн-блот анализа в контрольных условиях в хвое сеянцев сосны обнаружено не менее 4, а в корне не менее 5 индивидуальных белков дегидринов, в хвое ели – не менее 4, а в корне – не менее 3 индивидуальных белков. Установлено, что действие водного дефицита (-0,15 МПа, -0,5 МПа, -1,0 МПа) оказывает негативное влияние на состояние тотального белка в корнях обоих видов растений, вероятно усиливая протеолиз. При действии водного дефицита в хвое сосны и ели обнаружено значительное повышение содержания дегидринов без изменений спектра детектируемых белков. В корнях растений обоих видов действие водного стресса приводило к значительному повышению относительного содержания дегидринов малой молекулярной массы. Не обнаружено значимой связи между интенсивностью водного дефицита и содержанием в хвое обоих видов растений белков аквапоринов плазмалеммы (PIP 2:1; 2:2; 2:3 и 2:7). Напротив, их содержание в корнях значительно изменялось. В корнях сосны уже на первые сутки эксперимента обнаружено сильное снижение содержания аквапоринов при всех вариантах воздействия ПЭГ. В корнях ели к первым суткам опыта наблюдалось сильное увеличение содержания PIP 2:1; 2:2; 2:3 при воздействии -0,15 МПа и -1,0 МПа. Однако на 10-е и 17-е сутки эксперимента, указанные белки в корнях не обнаруживались ни у ели, ни у сосны. Полученные данные по содержанию аквапоринов плазмалеммы в корнях растений обоих видов в целом согласуются с наблюдавшимся снижением уровня транскриптов этих белков. 5. В условиях водного дефицита в корнях и хвое сеянцев сосны наблюдалось снижение экспрессии микроРНК семейств miR159 и miR395. Мишенью miR159с является ген белковой фосфатазы PFA-DSP1, а мишенью miR159c является фактор транскрипции MYB33. В соответствии с изменениями уровней экспрессии соответствующих микроРНК, уровень транскриптов генов PFA-DSP1 и MYB33 возрастал. В органах сеянцев сосны наблюдалось четырехкратное повышение экспрессии miR397, регулирующей экспрессию генов лакказ. В соответствии с этим, уровень транскриптов гена Laccase 5 в условиях водного стресса снижался в корнях сосны более чем на 50%, а в хвое – более чем в 2,5 раза. При водном стрессе снижалась экспрессия микроРНК pab-miR319f и pab-miR950e. miR319f регулирует ген дикарбоксилатового транспортера (оксалоацетат/малат и оксоглутарат/малат), однако значимого увеличения транскрипции гена Dicarboxylate transporter 1 не было обнаружено. Мишенью miR950e являются гены иммунного ответа TIR, однако соответствующее повышение экспрессии генов-мишеней наблюдалось только в корнях ели. При водном дефиците в хвое сосны и ели увеличивалась экспрессия микроРНК miR398b, в число мишеней которой входит одна из изоформ Cu/Zn-супероксиддисмутазы, однако снижения уровня транскриптов гена CSD1 не происходило. Помимо консервативных микроРНК, были проанализированы две видоспецифичные микроРНК: pab-miR11499a и pab-miR11500. Уровень экспрессии miR11499a увеличивался в хвое обоих видов. Основной мишенью pab-miR11499a является ген фермента GolS1 (Galactinol synthase 1), вовлеченного в синтез олигосахаридов семейства раффинозы, однако экспрессия гена GolS1 в хвое сеянцев при водном дефиците увеличивалась. В условиях водного дефицита в корнях и хвое сеянцев обоих видов заметно увеличивалась экспрессия микроРНК pab-miR11500. Мишенью данной микроРНК является ген GASA6 (Gibberellin-regulated family protein), транскрипция которого заметно снижалась при стрессе. Вероятно, что микроРНК pab-miR11500 выступает в качестве антагониста действия гиббереллинов на экспрессию генов данного семейства. Важным результатом работы является выявление новых микроРНК без соотнесения с базами данных, на основании критериев структуры и свойств микроРНК. У ели было выделено 32 микроРНК с прекурсорами, из которых 22 отсутствуют в базе публикации Xia et al. (2015). У сосны был выполнен поиск новых микроРНК с использованием собранных транскриптомов сосны в качестве референсных. Было обнаружено 340 микроРНК, из них 308 не были описаны ранее. Таким образом, в ходе выполнения проекта обнаружен целый класс новых видоспецифических miR-генов, биологическую значимость которых только предстоит изучить. 6. Дендрохронологический анализ кернов древесины сосны и ели позволил выявить климатические факторы, оказывающие существенное влияние на величину радиальных приростов растений. У сосны стимулирование прироста наблюдалось на фоне более низких температур января и более высоких температур декабря предыдущего года и большего количества осадков апреля предыдущего сезона. У ели стимулирование прироста наблюдалось на фоне более высоких температур декабря предыдущего года, января и февраля текущего года и большего количества осадков апреля предыдущего сезона. Синхронная реакция изменчивости радиального прироста сосны и ели зависит от температуры декабря предыдущего года, причём, стимуляция наблюдается на фоне более тёплого месяца - разница температур декабря в годы ингибирования и стимулирования прироста составляет около 4°С. Мы обнаружили, что снижение оводненности тканей сеянцев (в т.ч. хвои) является наилучшим индикатором водного дефицита. Максимальное снижение содержания воды в хвое происходило при воздействии ПЭГ, моделирующем наиболее жесткие условия водного дефицита. В условиях перлитной культуры при значительном снижении нормы полива, был достигнут водный дефицит лишь умеренной интенсивности. В 2018 г. в естественных условиях произрастания сосны и ели (Брянская область) самым засушливым месяцем вегетационного периода оказался август, когда выпало лишь 16% среднемесячной нормы осадков, что привело к снижению содержания воды в почве (на глубине до 70 см) на 35,8%. Вследствие этого содержание воды в хвое сосны снизилось (в абсолютных величинах) на 3,9%, а у ели сохранилось на прежнем уровне. Изменения в содержании воды сопровождаются повышением осмотического давления клеточного экссудата. При воздействии ПЭГ оно достигало 57,4% у сосны и 39,9% у ели; в перлите: 21,9% – у сосны и лишь 4,4% (p>0.05) – у ели. В природных условиях снижение содержания воды в почве привело к увеличению осмотического давления клеточного экссудата только в хвое сосны – 19,0%, у ели это увеличение (3,8%) оказалось статистически недостоверным. Сравнительный анализ воздействия водного дефицита на растения сосны и ели в лабораторных (модельных) и естественных условиях произрастания свидетельствует о более выраженной дегидратации сосны обыкновенной в условиях водного дефицита, по сравнению с елью европейской. В целом характер и направление физиологических реакций у сеянцев сосны и ели в лабораторных условиях соответствуют таковым у взрослых растений в природных условиях произрастания.

 

Публикации

1. - Молодые сосны гибнут в засуху из-за голодающих корней АНО Редакция журнала «Наука и жизнь», - (год публикации - ).

2. - Определена причина гибели сосен во время засухи Индикатор. Интернет-издание, - (год публикации - ).

3. - Российские ученые: во время засухи хвойные растения умирают не из-за обезвоживания АО «Газета.Ру», - (год публикации - ).

4. - Российские ученые выяснили, как выбросы цементного завода влияют на почву и растения Индикатор. Интернет-издание, - (год публикации - ).

5. - Цементный завод доставляет неприятности сосновому лесу АНО Редакция журнала «Наука и жизнь», - (год публикации - ).

6. - Российские биологи выяснили, как крупнейший в Европе цементный завод влияет на почву и растительность Сетевое издание "Вести.Ру", - (год публикации - ).

7. - Экологи выяснили, как выбросы цементного завода влияют на леса и почву МИА «Россия сегодня», - (год публикации - ).

8. Злобин И.Е., Иванов Ю.В., Карташов А.В., Кузнецов В.В. Impact of drought stress induced by polyethylene glycol on growth, water relations and cell viability of Norway spruce seedlings Environmental Science and Pollution Research, Volume 25, Issue 9, Pages 8951-8962 (год публикации - 2018).

9. Злобин И.Е., Иванов Ю.В., Карташов А.В., Сарвин Б.А.,Ставрианиди А.Н., Креславский В.Д., Кузнецов В.В. Impact of weak water deficit on growth, photosynthetic primary processes and storage processes in pine and spruce seedlings Photosynthesis Research, - (год публикации - 2019).

10. Иванов Ю.В., Злобин И.Е., Карташов А.В., Савочкин Ю.В., Кузнецов В.В. Effect of prolonged water deficiency of various intensities on growth, water homeostasis and physiological activity of pine seedlings Russian Journal of Plant Physiology, - (год публикации - 2019).

11. Иванов Ю.В., Карташов А.В., Злобин И.Е., Сарвин Б., Ставрианиди А.Н., Кузнецов В.В. Water deficit-dependent changes in non-structural carbohydrate profiles, growth and mortality of pine and spruce seedlings in hydroculture Environmental and Experimental Botany, Volume 157, Pages 151-160 (год публикации - 2019).

12. Иванов Ю.В., Карташов А.В., Иванова А.И., Иванов В.П., Марченко С.И., Нартов Д.И, Кузнецов В.В. Long-term impact of cement plant emissions on the elemental composition of both soils and pine stands and on the formation of Scots pine seeds Environmental Pollution, Volume 243, Part B, Pages 1383-1393 (год публикации - 2018).

13. Кузнецов В.В., Злобин И.Е., Карташов А.В., Сарвин Б.А., Ставрианиди А.Н., Пашковский П.П., Иванов Ю.В. Физиологические механизмы адаптации хвойных к засухе Механизмы устойчивости растений и микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды: Сборник материалов Годичного собрания Общества физиологов растений России, Всероссийской научной конференции с международным и участием и школы молодых ученых, Иркутск: Изд-во Института географии им. В.Б. Сочавы СО РАН, 2018. – В 2-х частях. Часть I. – С. 17-20. (год публикации - 2018).

14. Пашковский П., Карташов А., Злобин И., Иванов Ю., Кузнецов В. Physiological mechanisms of adaptation of conifer seedlings to water deficiency of different intensities Abstract book for the plant biology Europe conference in Copenhagen, Abstract book for the plant biology Europe conference in Copenhagen, p. 285. (год публикации - 2018).