Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Впервые проведен полногеномный анализ экспрессии микроРНК в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК) у больных с острым инфарктом миокарда (ИМ) в сравнении с контрольной группой. Полногеномный анализ экспрессии микроРНК в МНК 5 больных ИМ, в сравнении с 5 здоровыми контролями, проведенный путем секвенирования малых РНК на секвенаторе MiSeq (Illumina) с последующим выравниванием ридов и их аннотацией на базу данных микроРНК miRBase 21 (http://www.mirbase.org/), не выявил ни одной дифференциально экспрессированной при ИМ микроРНК с уровнем значимости, оцениваемым по критерию FDR (False Discovery Rate) <0.05. Чтобы проверить, не определяется ли наблюдавшийся нами отрицательный результат неудачным выбором времени выделения образцов, мы оценили уровень экспрессии микроРНК в МНК у двух больных ИМ в динамике, через 8 часов, 1, 3 и 7 дней от начала заболевания. Различий в экспрессии микроРНК в МНК в разные сроки после ИМ не наблюдали. Проведено сравнение уровней экспрессии 84 микроРНК в МНК 3 больных ИМ и 3 контролей более чувствительным, чем полногеномное секвенирование, методом, с использованием набора miScript miRNA PCR Array MIHS-105Z (Qiagen). Уровни экспрессии микроРНК оценивали методом количественной ПЦР в реальном времени. В МНК больных ИМ по сравнению с контрольной группой выявлено 11 микроРНК с пониженной и 11 – с повышенной экспрессией, однако различия не достигали минимального уровня значимости (p<0.05). Совокупность полученных нами двумя методами данных об отсутствии изменений в экспрессии микроРНК в МНК периферической крови больных ИМ в различные сроки на протяжении недели после начала заболевания может указывать на вовлечение в активацию этих клеток других механизмов, без участия системы регуляторных малых некодирующих РНК. Для поиска дифференциально экспрессируемых микроРНК мы перешли к анализу циркулирующих микроРНК в плазме. Для тех же 3 больных ИМ и 3 индивидов контрольной группы, для которых мы сравнивали уровни экспрессии микроРНК в МНК, используя тот же набор miRNA PCR Array и ту же методологию, провели сравнение уровней экспрессии для 84 микроРНК, циркулирующих в плазме. Выявлено 28 микроРНК с пониженной и 23 – с повышенной экспрессией, однако лишь для 2 микроРНК - miR-21-5p и miR-15b-5p - различия в экспрессии были значимыми (р=0.03 и p=0.01). Экспрессия miR-21-5p в плазме больных ИМ по сравнению с контрольной группой была понижена в 3.8 раз, а экспрессия miR-15b-5p – повышена в 3.7 раз. Эти данные представляют значительный интерес, поскольку профиль циркулирующих в плазме микроРНК может напрямую отражать патологические процессы, происходящие в миокарде. Есть все основания полагать, что эти микроРНК вовлечены в регуляцию постинфарктных событий. Поиск по данным базы PubMed публикаций за период с 2005 по 2016 годы, предмет изучения которых индексировался по MeSH терминам "Cardiovascular Diseases" и "MicroRNAs"; выявил 2894 публикаций, из них 341 посвящена ИМ. Применив для анализа последних критерии обязательной оригинальности исследования, использования биологических материалов человека in vivo и адекватной статистической обработки, мы сузили поиск и выбрали 54 публикации, в которых наблюдали дифференциальную экспрессию 77 различных микроРНК в компонентах крови у больных ИМ в сравнении с контрольной группой. Из них 39 микроРНК были исследованы в 2 и более работах и входят в 26 семейств. Для 7 семейств - miR-1, miR-208, miR-499, miR-133, miR-34, miR-21 и miR-150 - дифференциальная экспрессия показана как на азиатских, так и на европейских популяциях, причем в пяти и более публикациях. Мы провели поиск in silico генов-мишеней для этих 7 семейств микроРНК и для тех 8 семейств, которые были выбраны для включения в исследования на этапе 2016 г. Таким образом, в поиск было включено 15 семейств микроРНК: miR-1, miR-208, miR-499, miR-133, miR-34, miR-21, miR-150, miR-143/145, miR-155, miR-15b, miR-423, miR-146a, miR-196a и miR-499а. Нас интересовали такие гены-мишени микроРНК, которые содержат полиморфные участки (SNP или инсерционно-делеционные полиморфизмы) в потенциальных сайтах взаимодействия с затравочной областью исследуемых микроРНК. Для анализа in silico была использована онлайн-база данных PolymiRTS (Polymorphism in microRNAs and their TargetSites), агрегирующая экспериментальные данные и различные биоинформатические программы для предсказания взаимодействий мРНК-микроРНК. Всего было найдено 2818 генов-мишеней для 15 семейств микроРНК. Из них мы отобрали такие гены-мишени, регуляция которых осуществляется более чем одной из исследуемых микроРНК; этому критерию соответствовало 315 транскриптов. В их числе 65 генов-мишеней содержат в 3`UTR области полиморфные варианты с частотой минорного аллеля (MAF) у европейцев не менее 5%. Детальный анализ функций выбранных генов-мишеней микроРНК и поиск литературы, свидетельствующей о вовлечении продуктов этих генов в развитие ИМ, ИБС, атеросклероза или же заболеваний, считающихся факторами риска ИМ, позволил вычленить 20 генов-мишеней микроРНК, представляющих особый интерес для дальнейшего исследования в рамках нашего проекта. Это: - гены, продукты которых являются важными регуляторами состояния сосудов, в т.ч. входят в ренин-ангиотензин-альдостероновую систему (AGTR1, BDKRB2), и регулируют агрегацию тромбоцитов (PAFAH1B1); - гены, имеющие отношение к регуляции активности макрофагов (STIM2, ABCG1, SLC23A2), к регуляции развития субпопуляций Т-клеток (IKZF2), а также к сигнальным путям трансформирующего фактора роста, фактора некроза опухолей и интерферонов I типа (ACVR2B, TNFAIP8L1, TNFSF4, IRF4); - гены, продукты которых участвуют в регуляции обмена липидов и углеводов (LPP, MARCH1, PYGB); - гены TMEM43 и SLC6A2, для которых показана ассоциация уровня их экспрессии с развитием нарушений сердечного ритма, и ген TLCD2, варианты которого ассоциированы с развитием гипертрофии миокарда; - гены, продукты которых вовлечены в функционирование и организацию гладкомышечных клеток (MPRIP и RCBTB1) и ген GOPC, продукт которого принимает участие в метаболизме кардиоспецифичного адренорецептора. Эти гены представляют особый интерес, т.к. их полиморфные участки находятся в сайтах связывания с miR-21, miR-15b и miR-196a2 – теми микроРНК, роль которых в развитии ИМ была выявлена на этапе 2016 г. Для тех 39 микроРНК, дифференциальную экспрессию которых в компонентах крови наблюдали у больных ИМ в сравнении с контрольной группой в 2 и более публикациях, с помощью поиска по данным базы dbSNP NCBI обнаружили 214 SNP, MAF которых находится в диапазоне от 0.05 до 0.5. Среди всех публикаций о таких SNP всего 25 были посвящены анализу ассоциации вариантов генов микроРНК с риском ИБС или ИМ, в которых упоминались эти SNP. Ассоциация ИБС с вариантами генов микроРНК была показана лишь для 4 SNP, из них для двух: rs11614913 (MIR196А2) и rs3746444 (MIR499А) она была реплицирована в нескольких исследованиях. Кроме этих микроРНК, в ассоциативное исследование для русских были включены также rs6505162 (MIR423) и rs2910164 (MIR146А), для которых более чем в 2 публикациях была показана ассоциация с заболеваниями воспалительной природы. Исследование проведено методом «случай-контроль» для 325 больных ИМ (группа ИМ1) и 185 индивидов без ССЗ в анамнезе. Для всех четырех микроРНК наблюдается высокая частота «минорного» аллеля, от 0.20 до 0.46. Только для гена MIR196A2 (rs11614913) показана ассоциация развития ИМ с носительством аллеля С (p=0.023, OШ=1.74, 95%ДИ: 1.04-2.90). Проведено сравнение частот аллелей и генотипов эпсилон-полиморфизма гена АPOЕ (rs7412, rs429358), полиморфных участков −786T>C гена eNOS (rs2070744), 495T>G гена LPL (rs320) и 677C>T гена MTHFR (rs1801133) в той же выборке, что и при анализе полиморфизмов микроРНК. Показана ассоциация развития ИМ с носительством генотипа ε3/ε3 гена АPOЕ (p=0.048, OШ=1.52, 95%ДИ: 1.02-2.25) и генотипа 495*G/G гена LPL (p=0.036, OШ=1.97, 95%ДИ: 0.97-3.97), а также с частотой и носительством аллеля −786*С гена eNOS (p=0.0075, OШ=1.41, 95%ДИ: 1.07-1.84 и p=0.004, OШ=1.67, 95%ДИ: 1.16-2.41, соответственно). Значимых различий для SNP 677C>T гена MTHFR у больных ИМ и здоровых индивидов не обнаружено. При расширении группы больных ИМ до 405 чел. и контрольной группы до 207 чел. все наблюдаемые ассоциации сохранились, уровни значимости повысились в 1.5 – 2 раза, а значения ДИ для полиморфизма LPL*495T>G гена перестали пересекать 1. Гены АPOЕ и LPL кодируют ключевые ферменты метаболизма липидов, аполипопротеин Е и липопротеинлипазу, а ген eNOS принадлежит к системе продукции оксида азота и кодирует эндотелиальную синтазу NO (eNOS). Роль белковых продуктов этих генов в атерогенезе и патогенезе ИБС и ИМ достоверно известна. Эти гены описаны как потенциальные мишени для ряда микроРНК у человека. Дополнительно к объявленным ранее задачам нами проведена оценка индивидуального генетического риска ИМ с использованием метода логистической регрессии для построения предиктивных моделей. Композитная модель включала в качестве отдельных предикторов, кроме носительства вариантов генов АPOЕ *ε3/ε3, LPL*G/G, eNOS*С и MIR196A2*С, выявленных в работе по проекту, еще и аллели полиморфных участков трех генов: TGFB1rs1982073*T/Т), CRPrs1130864*T/T и FGBrs1800788*T и биаллельное сочетание IFNGrs2430561*A + PTGS1rs3842787*T, ассоциация которых с ИМ была описана нами ранее для тех же групп сравнения (Barsova R.M. et al, PLoS ONE, 2015). Качество модели оценивали в ROC-анализе по площади под кривой (AUC). Композитная модель, включающая в качестве отдельных предикторов ИМ носительство вариантов генов АPOЕ, LPL, eNOS и MIR196A2, характеризуется величиной AUC = 0.60 и обладает безусловным преимуществом перед отдельными генетическими маркерами. При пошаговом включении этих факторов риска как дополнительных предикторов в модель, полученную ранее (Barsova R.M. et al, PLoS ONE, 2015), мы получили обобщенную композитную генетическую модель, которая обладает большей прогностической эффективностью (AUC=0.694), чем модели, полученные в проекте (AUC = 0.60) и в упомянутой работе (AUC = 0.66). Для более эффективного определения кардиоваскулярного риска и индивидуального выбора профилактической стратегии мы создали комплексную модель оценки индивидуального риска ИМ, которая учитывает не только влияние факторов генетической предрасположенности, но и таких важных классических факторов риска ИМ как возраст и курение. При добавлении к полученному композитному генетическому маркеру показателей возраста и курения как предикторов ИМ прогностическая эффективность модели существенно увеличилась (AUC = 0.844). Отдельное исследование полученных моделей in silico показало, что найденные генетические факторы риска поодиночке оказывают влияние на риск возникновения ИМ, сопоставимое по силе с влиянием курения, а при сочетанном носительстве нескольких генетических вариантов риск возникновения ИМ оказывается больше, чем у курящих не-носителей генетических факторов риска. Сделан вывод о значимом взаимодействии между одним из генетических факторов риска (FGB rs1800788*T) и возрастом, вследствие чего носительство этого генетического варианта по-разному влияет на возникновение ИМ в разном возрасте. Проведен сбор доступной информации о неблагоприятных постинфарктных сердечно-сосудистых событиях, произошедших за время наблюдения (в среднем 8 лет) у больных ИМ группы 1. Всего была собрана информация о 132 пациентах, из них у 76 (57.5%) больных наблюдались конечные точки. От одних и тех же пациентов параллельно собрано по 201 образцу плазмы и крови и выделена новая коллекция ДНК (группа ИМ2).

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В плазме периферической крови больных инфарктом миокарда (ИМ) и здоровых индивидов определены уровни экспрессии микроРНК miR-21-5p, miR-15b-5p, miR-155, miR-423, miR-26a, miR-133 и miR-1, в соответствии с заявкой на 2017 г. Дополнительно оценивали уровни экспрессии miR-126-3p, miR-146b-5p, miR-186-5p, miR-196a-5p, miR-208a и miR-223-3p; эти микроРНК были выбраны на основании данных литературы, свидетельствующих об их участии в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Репрезентативная группа включала 15 мужчин с острым ИМ и 15 согласованных по возрасту мужчин без ССЗ и других тяжелых сопутствующих заболеваний в анамнезе (контрольная группа), все этнические русские. В случае miR-21-5p и miR-15b-5p, для которых данные о дифференциальной экспрессии были получены на этапе 2016 г. при первичном скрининге в плазме крови 3 больных ИМ и 3 индивидов контрольной группы (все мужчины) с помощью miScript miRNA PCR Array MIHS-105Z, это исследование было валидационным. Методом количественной ПЦР в реальном времени показано, что экспрессия miR-21-5p и miR-15b в плазме крови больных ИМ не позднее чем через 12 часов от начала заболевания была значимо снижена по сравнению с индивидами из контрольной группы: в 3.1 раза для miR-21-5p (р = 0.0014) и в 4.8 раза для miR-15b (p = 0.0021). Таким образом, на репрезентативной выборке данные о пониженной экспрессии miR-21-5p в плазме крови больных ИМ были валидированы. Наблюдаемая на расширенной выборке пониженная экспрессия miR-15b у больных ИМ не совпала с результатами первичного скрининга на ограниченной выборке. Выявлено еще 5 дифференциально экспрессирующихся микроРНК: у больных ИМ экспрессия miR-1 была повышена в 6.0 раз (p=0.02), а экспрессия miR-126-3p, miR-146b-5p, miR-155 и miR-186-5p - понижена по сравнению с индивидами контрольной группы в диапазоне от 2.0 до 4.0 раз (р=0.0003-0.043). Полученные данные могут отражать патологические процессы, происходящие в миокарде, и указывают на вовлеченность этих микроРНК в развитие и регуляцию ранних постинфарктных состояний. В совокупности изменение профиля экспрессии указанных циркулирующих микроРНК может быть биомаркером ранних постинфарктных событий (по крайней мере, у мужчин). Получены новые данные об ассоциации вариантов генов микроРНК MIR196A2 rs11614913 и MIR155HG rs2829801 с развитием ИМ. Для валидации результатов, полученных в 2016 г., сформирована новая независимая выборка больных ИМ и здоровых контролей (валидационная группа ИМ2), включающая 203 пациента с ИМ и 280 индивидов без ССЗ в анамнезе, все этнические русские. На выборке ИМ2 наблюдали, что частота генотипа С/С rs11614913 значимо выше у больных ИМ, чем в контрольной группе (pf = 0.036, OШ = 1.43). Таким образом, аллель С rs11614913 гена MIR196A2 является аллелем риска как в исходной выборке ИМ1, так и в валидационной выборке ИМ2. На двух выборках, ИМ1 и ИМ2, проведен анализ ассоциации развития ИМ с SNP rs2829801 в гене MIR155HG (MIR155 host gene), кодирующем miR-155. На выборке ИМ2 показано, что частота носительства аллеля G MIR155HG rs2829801 значимо выше (pf = 0.028, OШ = 2.12) в группе больных ИМ, чем в контрольной группе. Однако в группе ИМ1 этот результат не был воспроизведен. Проведена валидация полученных в 2016 г. данных об ассоциации с ИМ вариантов генов АPOЕ, eNOS и LPL, кодирующих белки, которые участвуют в развитии атеросклероза или связанных с ним заболеваний и являются мишенями для кандидатных микроРНК. На расширенной группе ИМ1 (405 больных ИМ и 198 индивидов без ССЗ в анамнезе) выявлена ассоциация с ИМ генотипа ε3/ε3 гена АPOЕ (rs7412, rs429358), аллеля С гена eNOS (rs2070744) и генотипа G/G гена LPL (rs320). Наблюдается хорошее сооответствие полученных результатов в группе ИМ1 и в валидационной группе ИМ2. Для расширенной группы ИМ1 проведен также анализ ассоциации с развитием ИМ SNP ряда других белок-кодирующих генов, служащих мишенями для дифференциально экспрессирующихся микроРНК. Это гены PCSK (rs562556), MTHFR (rs1801133), IL10 (rs1800896), CTLA4 (rs231775), AGTR1 (rs5186), PDE4D (rs152312), TNF (rs1800629), LTA (rs909253), IL6 (rs1800795), PLAT (rs2020918), IFNG (rs2430561) и локус 9p21.3 (rs1333049). Значимые ассоциации были обнаружены только для rs562556 гена PCSK9 и rs5186 гена AGTR1. Факторами риска развития ИМ является носительство генотипа PCSK9*A/A и аллеля С гена AGTR1. Проведен мультилокусный анализ ассоциаций с помощью ПО APSampler, использующего динамический метод Монте-Карло. Обнаружены ассоциированные с риском ИМ сочетания, характеризовавшиеся бОльшим уровнем значимости по сравнению с компонентами этих сочетаний. В состав сочетаний входили не только варианты генов APOE, LPL, eNOS и PCSK9, для которых были выявлены значимые ассоциации с ИМ поодиночке, но также аллели/генотипы полиморфных участков гена MTHFR и области 9p21. С целью установить, является ли наблюдаемый в составе сочетаний кумулятивный эффект аллелей разных генов аддитивным или эпистатическим, проведен разработанный нами ранее анализ трехфакторных взаимодействий. Значения фактора синергии (SF) с 95% ДИ и величины р в точном трехфакторном тесте оказались незначимыми. Таким образом, не было выявлено значимых эпистатических взаимодействий между компонентами всех найденных сочетаний. Для оценки прогностической значимости обнаруженных генетических факторов риска с помощью метода логистической регрессии рассчитана вероятность возникновения ИМ для каждого индивида в зависимости от носительства вариантов генов PCSK9, APOE, LPL и eNOS. Вклад совместного носительства аллелей/генотипов риска этих генов оценивали с помощью ROC-анализа. Рассматриваемые генетические факторы поодиночке являются плохими классификаторами риска возникновения ИМ, однако при совместном учете данных о носительстве их аллелей/генотипов достигается удовлетворительная прогностическая эффективность (AUC = 0.604). Эти данные были использованы для улучшения полученной нами ранее композитной генетической модели риска ИМ, включающей в качестве предикторов варианты генов TGFB1, FGB и CRP, а также эпистатическое сочетание IFNG с PTGS [Barsova R. et al., 2015]. Это позволило значимо (p = 0.014) повысить прогностическую эффективность модели от AUC 0.641 для модели без новых маркеров до AUC 0.676 для обобщенной композитной модели. Проведено сравнение генетической архитектуры первого ИМ, перенесенного пациентами из группы ИМ1 в разном возрасте. Исследовали ассоциацию аллелей и генотипов SNP, локализованных в 20 генах-кандидатах (или рядом с ними) из числа включенных в исследование белок-кодирующих генов (кроме генов PCSK9 и AGTR1), с развитием первого ИМ у пациентов из группы ИМ1, перенесших его в возрасте до 60 лет (подгруппа «раннего ИМ», 230 пациентов) и в возрасте 60 и более лет (подгруппа «позднего ИМ», 174 пациента). При сравнении пациентов из подгруппы «раннего ИМ» со 193 индивидами контрольной группы наблюдали значимые позитивные ассоциации с развитием ИМ носительства аллелей/генотипов SNP FGB rs1800788, TGFB1 rs1982073, ENOS rs2070744 и CRP rs1130864. Для пациентов из подгруппы «позднего ИМ» в сравнении с 93 здоровыми индивидами в возрасте 60 и более лет наблюдали единственную значимую ассоциацию с генотипом TGFB1 rs1982073*T/T; по уровню значимости она практически не отличается от величин для этого генотипа в подгруппе «раннего ИМ». Анализ показывает, что наблюдаемые различия едва ли можно объяснить размерами выборки. Таким образом, среди изучаемых полиморфизмов только TGFB1*T/T является генетическим фактором риска ИМ независимо от возраста, в котором произошел первый ИМ. Результаты указывают на значительно больший вклад генетического компонента в развитие ИМ, если он происходит в более раннем возрасте. Исходя из предположения, что некоторые гены, участвующие в формировании предрасположенности к ИМ, могут влиять также на дальнейшие постинфарктные события, мы исследовали ассоциацию вариантов выбранных кандидатных генов с развитием тяжелых повторных кардиальных событий, опираясь на результаты проведенного долгосрочного наблюдения (от 7 до 10 лет) после первого ИМ. 133 неродственных пациента, у которых первый ИМ произошел в возрасте 53.7±9.3 лет, были включены в 2013 г. в ретроспективное исследование. Композитной конечной точкой считали время смерти от кардиальных причин или время повторного нефатального ИМ. Согласно кривым Каплана-Мейера, с неблагоприятным прогнозом повторных событий в рецессивной модели связано носительство генотипов 9p21.3 rs1333049*G/G, 9p21.3 rs10757278*A/A и MTHFR rs1801133*Т/Т. По данным регрессионного анализа Кокса, значения отношения рисков (hazard ratio, HR) для носителей этих неблагоприятных генотипов равны 3.14 [1.63-6.04] (р = 0.0006), 2.48 [1.28–4.79] (р = 0.006) и 2.76 [1.20 – 6.33], р = 0.02, соответственно. Мультилокусный анализ позволил идентифицировать аллельные сочетания, некоторые компоненты которых, а именно, варианты генов CRP и ENOS, не были ассоциированы с риском тяжелых повторных кардиальных событий поодиночке. Чтобы оценить возможность применения наблюдаемых ассоциаций в прогностических целях, мы построили композитную модель расчета индивидуального генетического риска развития повторных тяжелых кардиальных событий после первого ИМ. Так как rs10757278 находится в локусе 9p21.3 в сильном неравновесном сцеплении с rs1333049, эти два SNP не могут быть независимыми маркерами неблагоприятных кардиальных событий; rs1333049 был выбран как SNP, объясняющий наибольшую долю дисперсии. В результате в композитную модель в качестве предикторов, имеющих значительное влияние (pw<0.05) на вероятность возникновения тяжелых постинфарктных событий, были включены 9p21.3 rs1333049*G/G и MTHFR*T/T. Проведенный ROC-анализ показал, что кривая для композитной модели характеризуется AUC = 0.65. При пороговом уровне вероятности 0.16 специфичность и чувствительность композитной модели составляют 0.80 и 0.50, соответственно. Проведено сопоставление результатов, полученных при анализе экспрессии микроРНК и полиморфизма генов, кодирующих микроРНК и их мишени, с точки зрения их совместного влияния на развитие ИМ.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Для выявления циркулирующих микроРНК, ассоциированных с инфарктом миокарда (ИМ), проведено полное профилирование микроРНК в плазме крови 6 больных ИМ в сравнении со 6 здоровыми индивидами контрольной группы без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе (все мужчины) путем секвенирования пула малых РНК на платформе MiSeq (Illumina). Через 24-30 часов после начала заболевания выявлено 20 микроРНК, уровень которых отличался более чем в два раза между сравниваемыми группами (p < 0.05): уровни miR-199a5p, miR-374a*, miR-375, miR-598 и miR-1271 были значительно снижены, тогда как miR-18a*, miR-106b, miR-128, miR-136*, miR-181d, miR-193b*, miR-194, miR-203, miR204, miR-208b, miR-499-5p, miR-542-5p, miR-1255b, miR-1285, miR-1299 значительно повышены у больных с ИМ по сравнению со здоровыми контролями. Среди них только miR-208b и miR-375 прошли поправку на множественные сравнения (padj = 0.00076 и 0.00076, соответственно). На репрезентативной независимой выборке 10 больных ИМ и 10 здоровых контролей методом количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) подтверждено повышение уровня miR-208b (FC = 5.3, p = 0.028) и понижение уровня miR-375 (FC = -2.1, p = 0.0039) в плазме больных ИМ. ROC-анализ показал сопоставимую прогностическую эффективность miR208b и miR-375, (АUC=0.80 и AUC=0.87, соответственно). Изменения в уровне циркулирующей miR-375 у больных ИМ выявлены нами впервые, тогда как для miR-208b они уже были описаны ранее. Предложен метод предсказания функциональной роли микроРНК на основании топологических характеристик сети взаимодействий ее генов-мишеней; он позволил выявить гены PIK3CA и TP53 как ключевые элементы сети, на которую направлены регуляторные эффекты miR-375 при ИМ. Таким образом, miR-375 и miR-208b в плазме крови служат надежными диагностическими и/или прогностическими биомаркерами ИМ, что в дальнейшем может помочь создать новые способы диагностики ИМ и контроля постинфарктного состояния пациентов. Данные, полученные в ходе выполнения этой части работы, послужили темой публикации в СМИ: https://indicator.ru/news/2018/09/10/infarkt-miokarda-regulyatornaya-molekula/?utm_source=indivk&utm_medium=social С помощью количественного анализа высокого разрешения с использованием биологических микроматриц (GeneChip™ Human Transcriptome Array 2.0) определяли профили экспрессии различных транскриптов, включая малые некодирующие РНК, в мононуклеарных клетках крови у больных ИМ и индивидов контрольной группы (по 6 мужчин в каждой группе; больные, как и при анализе циркулирующих микроРНК, через 24-30 часов после начала заболевания). Выявлено 138 генов, значимо различающихся по уровню экспрессии у больных ИМ и здоровых не менее чем в 1.5 раза; из них экспрессия 68 генов при ИМ повышена, а 70 – понижена. Однако только 2 дифференциально экспрессирующихся гена, причем разнонаправленно, KLRB1 и ADAP2, выдержали поправку на множественные сравнения (padj = 0.045 и 0.049, соответственно). Ген KLRB1 кодирует один из ингибиторных рецепторов натуральных киллеров, а ADAP2 - активирующий белок для ГТФазы ARF6, который вовлечен в фосфадитилинозитол-опосредованный сигналинг. Среди генов с повышенной при ИМ экспрессией, присутствуют два гена микроРНК, MIR223 и MIR21, и относительно небольшое число генов-мишеней этих микроРНК, однако уровни последних меняются при ИМ разнонаправлено. Биоинформатический анализ с использованием баз данных Gene Ontology (GO) и KEGG показал, что у больных ИМ набор генов с пониженной экспрессией перепредставлен генами сигнальных путей активации натуральных киллеров, а также процессинга и презентации антигенов, а генов с повышенной экспрессией - генами, регулирующими эндоцитоз и экзоцитоз, а также генами лизосомального аппарата. В совокупности приведенные данные свидетельствуют о вовлечении мононуклеарных клеток крови в патогенез ИМ, хотя четких регуляторных эффектов микроРНК в этих клетках нам выявить не удалось. При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфного участка rs4636297 гена MIR126 у 372 больных ИМ и 173 здоровых индивидов (исходная выборка ИМ1) показано, что частота носительства аллеля G выше у больных ИМ в сравнении с контрольной группой (р = 0.0088, ОШ = 1.90, 95% ДИ: 1.15-3.13). Эти результаты не были воспроизведены на валидационной выборке ИМ2 (203 больных ИМ и 278 здоровых индивидов), однако при объединении двух выборок мы наблюдали возрастание значимости ассоциации носительства аллеля G с развитием ИМ. Мы интерпретируем полученные данные как свидетельство в пользу ассоциации полиморфного варианта rs4636297 гена MIR126 с ИМ. Для исследования функциональной роли rs11614913 в гене MIR196A2, ассоциация которого была показана и валидирована ранее в ходе выполнения проекта, мы провели анализ структуры области сети ген-генных взаимодействий, содержащей непосредственные мишени miR-196a2, согласно экспериментально валидированным данным базы miRTarBase. Регулируемая miR-196a2 область сети состоит из четырех кластеров; при этом большинство генов-мишеней, ассоциированных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, компактно сконцентрировано в одном кластере. Он обогащен генами следующих сигнальных путей: TGFbeta, MHC класса I, активации и агрегации тромбоцитов, контроля клеточного цикла. Каждый из перечисленных путей имеет по крайней мере один ген − узел высокой центральности. Проведен анализ ассоциации полиморфных участков известных генов-мишеней микроРНК с риском ИМ: rs518394 и rs564398 в области 9p21.3 (гены ANRIL, CDKN2B-AS1), rs3025039 в гене VEGFA и rs5186 в гене AGTR1. В исследование были включены также rs1042522 в гене TP53 и rs644362 в гене PIK3CA, поскольку эти гены были выявлены нами как ключевые элементы сети межгенных взаимодействий, на которую направлены регуляторные эффекты miR-375 при ИМ (см. выше). Во всех случаях наблюдали значимую ассоциацию SNP c ИМ. Для генов VEGFA, TP53 и AGTR1 ассоциацию с ИМ наблюдали в двух выборках, для полиморфных участков в области 9p21.3 и для гена PIK3CA –в одной выборке и при объединении выборок, причем уровень значимости возрастал по сравнению с отдельными выборками. Обращает на себя внимание высокая результативность выявления ассоциации с ИМ при выборе генов-кандидатов, основанном на их роли как мишеней для микроРНК. В кластере генов в области 9р21.3 закодирована длинная некодирующая РНК ANRIL (Antisense Noncoding RNA in the INK4 Locus), которая может служить «губкой», связывая микроРНК и тем самым инактивируя их. На предыдущих этапах мы исследовали ассоциацию с ИМ двух других полиморфных участков этой области, rs10757278 и rs1333049, и, в отличие от данных этого года об ассоциации с ИМ rs518394 и rs564398, получили негативные результаты. Мы провели анализ характера неравновесия по сцеплению (LD) этих четырех SNP. Выявлены два гаплотипических блока, каждый из которых характеризуется сильным сцеплением: первый – из SNP rs518394 и rs564398 и второй – из rs10757278 и rs1333049. Эти результаты хорошо объясняют наблюдаемые нами попарные различия в ассоциации описанных SNP с ИМ. Выбранные для ассоциативного анализа по результатам, полученным в отчетном году, гены TP53 и PIK3CA являются прямыми мишенями для miR-375. TP53 кодирует транскрипционный фактор р53, который активируется в ответ на различные стрессовые воздействия, тем самым вызывая остановку клеточного цикла, апоптоз, старение, восстановление ДНК или изменения в метаболизме. Было показано участие p53 в ряде сердечно-сосудистых и метаболических нарушений. Ген PIK3CA кодирует каталитическую субъединицу фосфоинозид-3-киназы, которая играет важную роль в активации сигнальных каскадов, участвующих в клеточном росте, выживаемости и пролиферации. Проведен мультилокусный анализ, направленный на поиск ассоциированных с ИМ сочетаний, включающих варианты всех исследованных генов микроРНК (MIR126, MIR146A, MIR155HG, MIR196A2, MIR423A MIR499A) и их генов-мишеней (14 SNPs). Не обнаружили значимо ассоциированных с ИМ сочетаний, в состав которых входили бы варианты других генов микроРНК, кроме MIR126, MIR155HG и MIR196A2, для которых мы наблюдали ассоциацию с ИМ поодиночке. Эти результаты принципиально отличаются от тех, которые мы ранее получали при мультилокусном анализе применительно к белок-кодирующим генам.