КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-14-10364

НазваниеФлуоресцентные метки для сверхразрешающей микроскопии

РуководительМишин Александр Сергеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2016 - 2018

КонкурсКонкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-205 - Клеточная биология, цитология, гистология

Ключевые словаФлуоресцентные белки; мечение белков; флуоресцентная микроскопия сверх-высокого разрешения; детекция флуоресценции одиночных молекул; фотоконверсия; фотостабильность; флуорогенные красители;

Код ГРНТИ34.17.09


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Развитие методов сверх-разрешающей флуоресцентной микроскопии можно по праву считать главным технологическим прорывом последних лет в данной области. Эта технология, отмеченная в 2014 году Нобелевской премией по химии, позволяет преодолеть диффракционный барьер пространственного разрешения световой микроскопии и достичь нанометрового разрешения при наблюдении флуоресцентных сигналов. Применение методов микроскопии сверхвысокого разрешения для исследования живых систем предъявляет повышенные требования к системам флуоресцентного мечения. На сегодняшний день ни одна из традиционных систем не обеспечивает необходимого уровня фотостабильности, плотности мечения целевых структур, предсказуемого фотофизического поведения для проведения продолжительных экспериментов с высоким временным и пространственным разрешением, в щадящих условиях облучения на живых клетках. В данном проекте будут применены новые подходы, позволяющие повысить плотность мечения (использование низкоаффинных транизентно взаимодействующих меток, обратимо взаимодействующих пар флуороген-белок), снизить дозу облучения образца (создание быстропереключающихся фотоконвертируемых флуоресцентных белков), снизить неконтроллируемое мигание флуорофора (супрессия окислительной фотоконверсии). Ожидается, что в результате выполнения проекта будет создан ряд новых флуоресцентных меток, адаптированных для микроскопии сверх-высокого разрешения, что позволит проводить наблюдения за динамикой ультраструктурной организации живых клеток.

Ожидаемые результаты
Будут созданы новые генетически кодируемые метки, оптимизированные для флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. В результате будет улучшена применимость сверхразрешающей микроскопии к исследованию процессов в живых клетках, в том числе, снижено негативное влияние избыточного облучения на образец, повышена плотность мечения, улучшен контроль над фотофизическим поведением флуоресцентных меток.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Получены генно-инженерных конструкции, кодирующих белки слияния целевых белков - элементов цитоскелета - с бактериальными coiled-coil спиралями и флуоресцентные белки с парными спиралями. На модели клеточных культур млекопитающих определена работоспособность гетеродимерных пар спиралей, оценена скорость обмена транзиентной метки. Эффективность мечения с использованием отобранных спиралей можно считать сопоставимой с флуоресцентными белками. В экспериментах in vitro и в клетках E. coli измерена контрастность и устойчивость фотоконверсии трех обратимо фотоактивируемых белков на основе FusionRed с заменами по ключевым аминокислотным положениям 69, 148, 179. Показано, что два отобранных флуоресцентных белка обладают контрастом и устойчивостью фотоконверсии, сопоставимыми с лучшими обратимо фотоактивируемыми красными белками. Отобраны пары флуороген-белок, пригодные для флуоресцентного мечения целевых клеточных структур в живых клетках. Получены генно-инженерные конструкции, кодирующие мутантные варианты липокалина. Показана улучшенная, по сравнению с флуоресцентными белками, фотостабильность системы мечения флуороген-белок. Получены генно-инженерных конструкции, содержащие мутанты фотоактивируемого белка PA-GFP с улучшенной фотостабильностью для экспрессии в цитоплазме и в составе белков слияния с интегрином. С их помощью, на модели клеточной культуры проведено сравнение фотостабильности фотоконвертированной формы этих белков, фотонного бюджета.

 

Публикации

1. Гурская Н.Г., Перфилов М.М., Клементьева Н.В., Мишин А.C., Лукьянов К.А. Флуоресцентное мечение белков в живых клетках, опосредованное гетеродимеризацией искусственных альфа-спиралей Научные труды V Съезда Тезисы доклада физиологов СНГ, V Съезда биохимиков России, Конференции ADFLIM. - ACTA NATURAE; под ред. А. И. Григорьева, Ю.В.Наточина, Р.И. Сепиашвили, А.Г.Габибова, В.Т. Иванова, А.П.Савицкого, СПЕЦВЫПУСК том 1, c.231 (год публикации - 2016).

2. Клементьева Н.В., Божанова Н.Г., Загайнова Е.В., Лукьянов К.А., Мишин А.С. Флуорофоры для локализационной микроскопии одиночных молекул Биоорганическая химия, - (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В условиях локализационной флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения проведена оценка эффективности мечения кавеолина с использованием бактериальных coiled-coil спиралей и фотоактивируемого флуоресцентного белка с парной спиралью. За счет транзиентного характера взаимодействия спиралей происходит постоянный обмен флуоресцентой метки на целевом белке с внутриклеточным пулом. В результате достигается высокая плотность мечения целевой структуры, достаточная для реконструкции изображений сверхвысокого разрешения. Разработанные обратимо фотоактивируемые красные флуоресцентные белки на основе FusionRed показали эффективное переключение между темновым и флуоресцентным состояниями в условиях конфокальной и широкопольной флуоресцентной микроскопии. Также обнаружено, что у некоторых широко используемых красных флуоресцентных белков, включая FusionRed и TagRFP наблюдается обратимая фотоконверсия в нефлуоресцентное состояние. При этом возврат во флуоресцентное состояние происходит спонтанно, и при интенсивностях облучения в десятки ватт на квадратный сантиметр можно поддерживать стабильные флуктуации сигнала. Такие флуктуации оказалось возможным использовать для реконструкции изображений со сверхвысоким разрешением при съемке живых клеток в щадящих условиях облучения. http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/cc/c6cc09200d Разработана двухкомпонентная система мечения белков с использованием пар флуороген-белок. При этом генетически кодируемая метка на основе бактериального белка липокалина обратимо связывает низкомолекулярный флуороген, легко проникающий в живую клетку. Постоянный обмен флуорогена позволяет контролировать плотность мечения целевых структур в условиях локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения путем изменения концентрации флуорогена. Также, за счет обмена улучшается фотостабильность в широкопольной флуоресцентной микроскопии, локализационной сверхразрешающей микроскопии, а также STED-микроскопии http://www.ibch.ru/press/news/science/2143 http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/sc/c7sc01628j#!divAbstract Выбраны модельные целевые белки и созданы генно-инженерные конструкции с ними для тестирования разрабатываемых фотоактивируемых флуоресцентных белков, оптимизированных для количественных приложений локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения, в том числе для отслеживанием перемещения одиночных молекул (sptPALM).

 

Публикации

1. - Ученые заставили белки светиться дольше Открытая наука, 11 августа 2017 (год публикации - ).

2. Божанова Н.Г., Баранов М.C., Клементьева Н.В., Саркисян К.C., Гавриков А.С., Ямпольский И.В., Загайнова Е.В., Лукьянов С.А., Лукьянов К.А., Мишин А.C. Protein labeling for live cell fluorescence microscopy with a highly photostable renewable signal Chemical Science, Том: 8 Выпуск: 10 Стр.: 7138-7142 (год публикации - 2017).

3. Гавриков А.С., Ершова М.Н., Лукьянов К.А., Мишин А.С. Switchable acceptors of resonance energy transfer based on lipocalin Blc and synthetic chromophores Тезисы постерных докладов 2-я Школа ADFLIM, с.3 (год публикации - 2017).

4. Клементьева Н.В.,Павликов А.И., Моисеев А.А., Божанова Н.Г., Мишина Н.М., Лукьянов С.А., Загайнова Е.В., Лукьянов К.А., Мишин А.С. Intrinsic blinking of red fluorescent proteins for super-resolution microscopy Chemical Communications, Том: 53 Выпуск: 5 Стр.: 949-951 (год публикации - 2017).

5. Лукьянов К.А., Перфилов М.М., Божанова Н.Г., Гурская Н.Г., Мишин А.С. Визуализация белков в живой клетке с помощью обратимого связывания флуоресцентной метки Acta Naturae, Спецвыпуск, с.5 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведена оценка эффективности мечения ряда модельных белков с использованием бактериальных coiled-coil спиралей и флуоресцентного белка (или фотоактивируемого флуоресцентного белка) с парной спиралью. Методами анализа восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и в экспериментах по локализационной флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, что наилучшими свойствами для практического использования обладают пары спиралей, содеражащие по три гептадных повтора. Разработанные в рамках проекта обратимо фотоактивируемые красные флуоресцентные белки на основе FusionRed (rsFusionRed1, rsFusionRed2, rsFusionRed3) применены для сверхразрешающей RESOLFT-микроскопии белков цитоскелета в живых клетках. Установлено, что белки rsFusionRed2 и rsFusionRed3 обеспечивают наибольшую скорость съемки RESOLFT-изображений среди всех опубликованных красных обратимо фотопереключаемых флуоресцентных белков. Также, на примере разработанных белков, впервые показана возможность использования комбинации лазеров с низкой фототоксичностью (510 нм и 590 нм) для сверхразрешающей RESOLFT-микроскопии. https://www.nature.com/articles/s41592-018-0052-9 В рамках разрабатываемой двухкомпонентной системы мечения белков с использованием пар флуороген-белок обнаружена новая комбинация свободно проникающего через клеточную мембрану флуорогена и мутанта липокалина. Новая пара флуороген-белок обладает флуоресценцией в красной области и сравнимой со спектрально близкими флуоресцентными белками яркостью. Показано применение новой системы мечения для традиционных вариантов флуоресцентной микроскопии а также для локализационной флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. https://www.mdpi.com/1422-0067/19/12/3778 В условиях локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения проведены эксперименты по трекинку одиночных молекул белков с примембранной локализацией, меченных с использованием разработанных в данном проекте мутантных вариантов фотоактивируемого белка PA-GFP. Определен вариант PA-GFP, обеспечивающий наибольшую длину непрерывных траекторий перемещения меченной белковой молекулы в условиях sptPALM.

 

Публикации

1. - Ученые создали белки, свойства которых можно изменять светом Газета.Ру, 13.09.2018 (год публикации - ).

2. - Ученые создали белки, свойства которых можно изменять светом Сетевое издание Indicator (Индикатор), 13.09.2018 (год публикации - ).

3. - Scientists created proteins controlled by light EurekAlert!, 28.09.2018 (год публикации - ).

4. - Оранжевый и зеленый свет поможет управлять свойствами белков Полит.ру, 14.09.2018 (год публикации - ).

5. - Scientists created proteins controlled by light Phys.org, 01.10.2018 (год публикации - ).

6. - The Proteins Controlled By Light Technology Networks, 01.10.2018 (год публикации - ).

7. Божанова Н.Г., Баранов М.С.,Балеева Н.С., Гавриков А.С., Мишин А.С. Red-Shifted Aminated Derivatives of GFP Chromophore for Live-Cell Protein Labeling with Lipocalins International Journal of Molecular Sciences, Volume 19, Number 7, Article number 3778 (год публикации - 2018).

8. Клементьева Н.В., Лукьянов К.А., Загайнова Е.В., Мишин А.С. Live-cell super-resolution microscopy with blue fluorescent protein TagBFP Journal of Bioenergetics and Biomembranes, - (год публикации - 2018).

9. Лукьянов К.А., Перфилов М.М., Гурская Н.Г., Мамонтова А.В., Богданов А.М., Мишин А.С. Probes for high-photostability super-resolution fluorescence microscopy of live cells Journal of Bioenergetics and Biomembranes, - (год публикации - 2018).

10. Мишин А.С., Лукьянов К.А. Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения живых клеток Успехи биологической химии, - (год публикации - 2019).

11. Мишин А.С., Перфилов М.М, Гавриков А.С., Мамонтова А.В., Богданов А.М., Лукьянов К.А. Live-cell nanoscopy enabled with transient labeling and the control of fluorophore blinking EPJ Web of Conferences, Volume 190, 03008 (год публикации - 2018).

12. Пеначиетти Ф., Серебровская Е.О., Фаро А.Р., Шемякина И.И., Божанова Н.Г., Котлобай А.А., Гурская Н.Г., Боден А., Дрейер Д., Чудаков Д.М., Лукьянов К.А., Верхуша В.В., Мишин А.С., Теста И. Fast reversibly photoswitching red fluorescent proteins for live-cell RESOLFT nanoscopy Nature Methods, Volume 15 Issue 8 Pages 601-604 (год публикации - 2018).