Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Введение. Стимулирование регенерации наиболее актуально для мозга, где существуют естественные запреты для роста нервных проводников и восстановления нервных связей. Неспособность ЦНС к достаточному восстановлению после травматического повреждения, ишемии, при нейродегенеративных и демиелинизирующих заболеваниях диктует необходимость поиска новых эффективных подходов к их лечению. Среди активно разрабатываемых в этом направлении стратегий наиболее перспективной представляется генная терапия. Она предполагает доставку в патологически измененную область нервной системы терапевтических генов, сдерживающих гибель нейронов и поддерживающих нейрорегенерацию. В настоящем исследования для стимулирования нейрорегенерации после контузионной травмы спинного мозга у крыс аденовирусные векторы, несущие терапевтические гены, были доставлены в спинной мозг непосредственно (прямая генная терапия), или на клеточных носителях — мононуклеарных клетках крови пуповины человека (клеточно-опосредованная генная терапия) — с помощью интратекальной инъекции. Материалы и методы. Для доставки терапевтических генов были наработаны опытные образцы рекомбинантных репликативно-дефектных вирусных векторов на базе аденовируса человека 5 серотипа (Ad5), кодирующих: 1) ген зелёного флюоресцирующего белка (Ad5-GFP); 2) ген ангиогенина человека (Ad5-ANG); 3) ген нейрональной молекулы адгезии (Ad5-NCAM); 4) ген сосудистого эндотелиального фактора роста (Ad5-VEGF); 5) ген глиального нейротрофического фактора (Ad5-GDNF). Полученные аденовирусные векторы были использованы для генетической модификации мононуклеарных клеток крови пуповины человека (МККП). В результате трансдукции МККП аденовирусами в различных комбинациях были созданы следующие генно-клеточные конструкции: 1) МККП+Ad5-GFP 2) МККП+ Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM 3) МККП+ Ad5-VEGF+Ad5-ANG+Ad5-NCAM Экспрессия трансгенов в генетически модифицированных МККП была подтверждена методами ПЦР и ИФА. Эффективность полученных опытных образцов генных и генно-клеточных препаратов для стимулирования нейрорегенерации оценивали на модели дозированной контузионной травмы у крыс на уровне Т8-Т9 позвонков. В течение четырех часов после нанесения травмы животным интратекально вводили: (1) 20 мкл физиологического раствора; (2) 2×107 вирусных частиц в 20 мкл физиологического раствора; (3) мононуклеарные клетки крови пуповины человека, трансдуцированных аденовирусными векторами (2 млн клеток в 20 мкл физиологического раствора). Интратекальную инъекцию препарата производили после ламинэктомия на уровне L4-L5. Животные были разделены на семь экспериментальных групп: 1. 0,9% NaCl группа — физиологический раствор (n = 4); 2. Ad-GFP группа — аденовирусы, несущие зелёный флуоресцентный белок GFP (n = 8); 3. Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM группа — аденовирусы, несущие терапевтические гены VEGF, GDNF и NCAM (n = 5); 4. Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM группа — аденовирусы, несущие VEGF, Angiogenin, NCAM (n = 4); 5. МККП+Ad-GFP группа — мононуклеарные клетки крови пуповины человека, трансдуцированные Ad-GFP (n = 6); 6. МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM группа — мононуклеарные клетки крови пуповины человека, трансдуцированные Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM (n = 6); 7. МККП+Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM группа — мононуклеарные клетки крови пуповины человека, трансдуцированные Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM (n = 7). Эффективность регенерации спинного оценивали при помощи поведенческих тестов, электрофизиологического исследования, иммунофлуоресцентного анализа трансплантированных МККП и экспрессии терапевтических генов, морфометрического метода оценки сохранности серого и белого вещества и иммунотипирования мотонейронов, астроцитов, олигодендроцитов и клеток микроглии. На 30 сутки эксперимента для гистологического исследования подопытных животных наркотизировали, транскардиально перфузировали 4% раствором параформальдегида, участок спинного мозга на 2 см выше и ниже эпицентра травмы забирали вместе с позвонками. Результаты. Терапевтическая эффективность прямой генной терапии и клеточно-опосредованной терапии при различных сочетаниях терапевтических генов установлена с помощью поведенческих тестов (ВВВ и Ротарод). На 30 сутки эксперимента положительный действие генной терапии выявлено во всех терапевтических группах: Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM, МККП+Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM, Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM, МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM, при сравнении с контролем (0,9% NaCl), p<0,05. Электрофизиологические исследования также выявили положительный эффект генной и генно-клеточной терапии. Анализ вызванных моторных потенциалов в ответ на электрическую стимуляцию седалищного нерва установил, что уровень порога возникновения рефлектороного Н-ответа и его латентный период (стимуляция седалищного нерва) в группах МККП+Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM и МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM возвращаются к значениям интактных животных и отличаются от значений контрольной группы (0,9% NaCl) с уровнем значимости p<0,05. При магнитной стимуляции шейно-грудного отдела спинного мозга уровень порога возникновения моторного ответа в группах МККП+Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM и МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM возвращается к значениям интактных животных и отличается от значений контрольной группы (0,9% NaCl) с уровнем значимости p<0,05. При этом латентный период вызванных моторных потенциалов в ответ на магнитную стимуляцию во всех терапевтических группах (МККП+Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM, МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM, Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM и Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM) приближался к значениям интактных животных и отличался от контроля (0,9% NaCl) с уровнем значимости p<0,05. Таким образом, клинические и инструментальные методы исследования выявили положительное действие на восстановление двигательной функции как при прямой, так и при клеточно-опосредованной генной терапии в заявленных комбинациях. Однако следует отметить, что более эффективными являются генно-клеточные препараты при обоих сочетаниях терапевтических генов. Эффективность стимулирования нейрорегенерации на фоне прямой генной и клеточно-опосредованной генной терапии оценивали также с помощью морфометрического анализа сохранности серого и белого вещества спинного мозга и иммунофлуоресцентного исследования мотонейронов, астроцитов, олигодендроцитов и клеток микроглии. Морфометрический анализ сохранности серого вещества спинного мозга обнаружил, что объём патологических полостей был значительно меньше во всех терапевтических группах, включая группу МККП+Ad-GFP, в сравнении с контрольными группами (0,9% NaCl, Ad-GFP). Сохранность белого вещества оценивали по состоянию миелиновых оболочек в передних, боковых и задних канатиках на обеих сторонах спинного мозга. Установлено, что относительная площадь миелиновых оболочек в боковых и задних канатиках была больше в терапевтических группах, при сравнении с контрольными группами (0,9% NaCl, Ad-GFP). Положительный эффект после интратекальной инъекции аденовирусных векторов с генами в сочетаниях VEGF, GDNF, NCAM и VEGF, ANG, NCAM и нейротрансплантации генетически модифицированных МККП крысам на нейроны и глиальный компонент является неотъемлемым условием терапии после контузионной травмы спинного мозга. В настоящем исследовании с помощью иммунофлуоресцентного метода получены результаты иммуноэкспрессии белков-маркёров нервных клеток и клеток нейроглии на 30 сутки эксперимента, свидетельствующие о снижении количества реактивных астроцитов, экспрессирущих GFAP и виментин, об увеличении количества миелинобразующих клеток и их предшественников, экспрессирующих белки OSP, Olig2 и NG2, о повышении флуоресцентной плотности белка Cx47 щелевых контактов между астроцитами и олигодендритами, об уменьшении реактивного микроглиоза после прямой и клеточно-опосредованной терапии. В зоне локализации мотонейронов в вентральных рогах обнаружено снижение экспрессии белка теплого шока Hsp27 и увеличение белков синаптической пластичности/контактов (PSD95, synaptophysin) на 30 сутки после введения терапевтических конструкций. По данным критериям генно-клеточные конструкции МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM и МККП+Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM имели преимущество над прямой генной терапией в группах Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM и Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM. Роль рекомбинантных генов в нейропротекторном действие прямой генной и клеточно-опосредованной генной терапии, установленное при морфо-функциональном исследовании спинного мозга, подтверждена на уровне иммуноэкспрессии терапевтических генов в спинном мозге подопытных животных. Экспрессия гена, кодирующего зелёный флуоресцирующий белок GFP, документирована на 2, 4, 7, 14, 21 и 30 сутки после интратекальной инъекции аденовируса Ad-GFP. Экспрессия терапевтических генов VEGF, ANG, GDNF и NCAM в экспериментальных группах с прямой генной терапией изучена иммунофлуоресцентным методом с использованием специфических АТ против целевых белковых молекул на 30 сутки после интратекальной инъекции аденовирусных векторов. Иммунофлуоресцентный анализ с помощью лазерной конфокальной микроскопии подтвердил экспрессию терапевтических генов в клетках спинного мозга ростральнее эпицентра травмы. Для идентификации VEGF, GDNF, ANG и NCAM в генетически модифицированных МККП было проведено двойное иммунофлуоресцентное окрашивание поперечных срезов спинного мозга крыс с помощью АТ в комбинациях: (1) против ядерного АГ человека (HuAN) и (2) против одного из терапевтических генов VEGF, GDNF, ANG или NCAM. Через 30 суток после нейротрансплантации в спинном мозге крыс группы МККП+Ad-VEGF+Ad-ANG+Ad-NCAM были обнаружены HuAN -позитивные клетки, экспрессирующие VEGF, ANG и NCAM, а в группе МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM были выявлены МККП, экспрессирующие VEGF, GDNF и NCAM. Таким образом, через 30 суток после нейротрансплантации МККП, не только сохраняют жизнеспособность, но и активно синтезируют терапевтические молекулы. Дополнительная трансдукция МККП аденовирусом, экспрессирующим NCAM, повышает выживаемость МККП после трансплантации и эффективность их адресной миграции в серое вещество мозга. Заключение. Положительный терапевтический эффект установлен, как при прямой генной терапии, так и клеточно-опосредованной генной терапии. Однако генетически модифицированные МККП показали более значимые результаты по восстановлению двигательных функций и стимулированию регенерации спинного мозга. Кроме того, учитывая условия безопасности трансплантации МККП человека с аденовирусными векторами по сравнению с прямой генной терапией для доклинических и клинических исследований, более перспективным представляется препарат генетически модифицированных МККП, сверх-экспрессирующих терапевтические гены. Таким образом, в ходе выполнения проекта нами установлена наиболее эффективная генно-клеточная конструкция для стимулирования нейрорегенерации — МККП+Ad-VEGF+Ad-GDNF+Ad-NCAM, а заявленный конечный результат получен.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Введение Для восстановления двигательных функций у пациентов после повреждения спинного мозга активно применяются технологии электрической эпидуральной стимуляции (Harkema и др., 2011; Angelus и др., 2014; Grahn и др., 2017). Так, у человека с полной травмой спинного мозга эпидуральная стимуляция способствует восстановлению независимого стояния и непроизвольную шагоподобную активность (Grahn и др., 2017). В основу этих разработок заложены экспериментальные исследования, в которых установлено, что стимуляция поясничных сегментов может вызывать ходьбу у крыс и кошек с полной травмой спинного мозга (Lavrov и др., 2006, 2008, 2015; Courtine и др., 2009). Тот факт, что стимуляция способна активировать функционально неактивные тракты спинного мозга ниже места полного перерыва спинного мозга, обуславливает целесообразность разработки новых терапевтических протоколов, направленных на восстановление утраченных связей. Ранее нами был установлен положительный терапевтический эффект клеточно-опосредованной генной терапии на морфо-функциональное восстановление спинного мозга после контузионной травмы у крысы. Интратекальная трансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины, сверхэкспрессирующих ген нейрональной молекулы адгезии (NCAM1), ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165) и ген глиального нейротрофического фактора (GDNF), ускоряла восстановление локомоторной функции, сдерживала вторичную дегенерацию нервной ткани, стимулировала нейрорегенерацию. Представляется очевидным, что сочетанное воздействие электростимуляции и генной терапии может быть более эффективным при травме спинного мозга. В настоящем исследовании нами впервые изучено действие эпидуральной стимуляции на посттравматическую регенерацию спинного мозга крысы в сочетании с клеточно-опосредованной генной терапией. Материалы и методы Получение генно-клеточного препарата Для клеточно-опосредованной генной терапии были наработаны рекомбинантные репликативно-дефектные вирусные векторы на базе аденовируса человека 5 серотипа (Ad5), кодирующих: (1) ген нейрональной молекулы адгезии (Ad5-NCAM); (2) ген сосудистого эндотелиального фактора роста (Ad5-VEGF); (3) ген глиального нейротрофического фактора (Ad5-GDNF). Далее полученные аденовирусные векторы были использованы для генетической модификации мононуклеарных клеток крови пуповины человека (МККП). В результате одновременной трансдукции тремя аденовирусами, несущими терапевтические гены (Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM), были получены МККП, сверхэкспрессерирующие ген нейрональной молекулы адгезии (NCAM1), ген сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165) и ген глиального нейротрофического фактора (GDNF). Экспрессия трансгенов в генетически модифицированных МККП была подтверждена методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Операции на животных Содержание, уход за животными и все экспериментиальные процедуры отвечали международным биоэтическим нормам согласно Хельсинской Декларации 1975 г. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом КГМУ (протокол №5 от 27.05.2014). Хирургические процедуры на экспериментальных животных были разделены на три этапа: (1) Имплантация электродов для эпидуральной электрической стимуляции спинного мозга. Этот этап включал установку головного имплантата и имплантацию электродов. Стимулирующие электроды подшивали к твердой мозговой оболочке синтетическим шовным материалом на уровне С5 и L2 позвонков. Электроды соединяли с головным 12-канальным имплантом, через который можно было подключать электрофизиологическое оборудование для эпидуральной электростимуляции спинного мозга. (2) Контузионную травму спинного мозга на уровне Т8–Т9 позвонков вызывали при помощи импактора (металлический цилиндр со штативом, с вертикально падающим внутри цилиндра металлическим стержнем диаметром 2 мм и весом 10 г). (3) Ксенотрансплантация генетически модифицированных МККП. Через четыре часа после нанесения травмы животным интратекально вводили: 20 мкл физиологического раствора (контрольная группа, n=5); или 2×106 генетически модифицированных МККП (МККП+ Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM) в 20 мкл раствора (подопытная группа, n=5). Интратекальную инъекцию препарата производили после ламинэктомия на уровне L4–L5. (4) Эпидуральная стимуляция. На данном этапе исследования для стимулирования нейрорегенерации и восстановления двигательных функций у экспериментальных животных был применен протокол электростимуляции однонаправленным током с частотой 40 Hz, интенсивностью 1,3–2 V и длительностью импульса 0,2.мс помощью электростимулятора Digitimer DS5 (Digitimer Ltd., UK). Параметры стимуляции задавались с помощью программного обеспечения LabChart (AD Instruments Inc., USA). Эпидуральную электростимуляции продолжительностью 60 мин проводили утром и вечером по 30 мин одновременно выше места травмы на уровне С5 для стимулирования нейрорегенерации и ниже травмы — на уровне L2 для активации генераторов шагания. Процедуру проводили в течение трех недель через день, начиная с 3-х суток после нанесения контузионной травмы спинного мозга. Во время электростимуляции тело подопытных животных было зафиксировано с помощью бандажной повязки под углом 45° относительно ленты тредмила так, чтобы задние лапы опирались на ленту тредмила, а передние конечности не касались ленты. Критерием проводимой электростимуляции являлось возникновение шагательных движений задних конечностей у крысы, находящейся на движущейся ленте тредмила. Эффективность клеточно-опосредованной генной терапии в сочетании с электростимуляцией на регенерацию спинного мозга оценивали на 30 сутки после контузионной травмы спинного мозга при помощи: (1) поведенческих тестов («ВВВ», «Ротарод» и «Тредмил»); (2) электрофизиологического исследования икроножной мышцы (игольчатая миография в ответ на электрическую стимуляцию седалищного нерва); (3) иммунофлуоресцентного анализа молекулярных и клеточных изменений в спинном мозге экспериментальных животных; (4) морфометрического метода оценки сохранности вещества спинного мозга (анализ состояния миелиновых нервных волокон); (5) мультиплексного профилирования цитокинов в образцах крови экспериментальных животных. Результаты Терапевтическая эффективность эпидуральной электростимуляции у животных контрольной (электростимуляция) и подопытной (электростимуляция в сочетании с клеточно-опосредованной генной терапией) групп установлена с помощью поведенческих тестов («ВВВ», «Ротарод» и «Тредмил») и электрофизиологического метода исследования с учетом данных предыдущего исследования. На 30 сутки исследования на фоне эпидуральной стимуляции анализ объема движений в голеностопном и тазобедреннном суставах (тест «Тредмил») не выявил значимых различий у животных экспериментальных групп и интактных животных. Однако в коленном суставе объем движений у животных контрольной группы (электростимуляция) был ниже, чем у интактных (здоровых), а у животных подопытной группы МККП+Ad5-VEGF+Ad5-GDNF+Ad5-NCAM в сочетании с электростимуляцией не отличался от интактных. Важно отметить, что при сравнении результатов с данными предыдущего исследования, восстановление объема движений в коленном суставе у животных после электростимуляции на фоне клеточно-опосредованной терапии был более выраженным. При этом в тестах с пассивной (тест «ВВВ») и вызванной (тест «Ротарод») локомоторной активностью различия между контрольной и подопытной группами не выявлены. Анализ данных моторного (М) и рефлекторного (Н) ответов икроножной мышцы на электрическую стимуляцию седалищного нерва достоверных различий между экспериментальными (контрольная и подопытная) и интактной группой животных не выявил. Таким образом клинические и инструментальные методы исследования свидетельствуют о восстановлении двигательной функции у экспериментальных животных. При этом, эпидуральная стимуляция спинного мозга в выбранном нами режиме оказывает положительное влияние на нейрорегенерацию после контузионной травмы спинного мозга. Важно отметить, что более эффективное восстановление локомоторной функции коленного сустава выявлено у животных подопытной группы (электростимуляция в сочетании с клеточно-опосредованной генной терапией). На основании иммунофлуоресцентного исследования спинного мозга контрольных (электростимуляция) и подопытных (электростимуляция в сочетании с клеточно-опосредованной генной терапией) животных можно сделать заключение, что электростимуляция оказывает нейропротекторное действие на нейроны спинного мозга. При этом интратекальная трансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины, одновременно сверхэкспрессирующих VEGF, GDNF и NCAM, усиливает нейропротекторное действие электростимуляции. Есть основания полагать, что клеточно-опосредованная генная терапия усиливает экспрессию синаптических белков (PSD95 и Synaptophysin), поддерживает миелинизацию (увеличение количества Olig2+-олигодендроцитов) и сдерживает астроглиоз (снижение количества астроцитов (GFAP+-клеток) и клеток микроглии (Iba1+-клеток)). Морфометрический анализ сохранности серого и белого вещества спинного мозга в эпицентре травмы различий у животных с эпидуральной электростимуляцией и животных сочетанной терапией (электростимуляция на фоне клеточно-опосредованной генной терапии) не выявил. Однако, при сравнении с данными предыдущего исследования, очевидно, что эпидуральная электростимуляция оказывает выраженный эффект на сохранность и регенерацию миелиновых волокон. Мультиплексный анализ цитокинов, хемокинов и факторов роста в образцах крови экспериментальных животных через 30 суток после контузионной травмы не выявил значимых различий в экспериментальных группах животных. Заключение В настоящем исследовании на крысах после контузионной травмы спинного мозга в одном протоколе электростимуляции, совмещалось два воздействия на спинной мозг: (1) имитация аутогенных возбуждений нейронов в эпицентре контузионной травмы и (2) возбуждение локальных нервных сетей, генерирующих локомоторную активность задних конечностях. Для повышения эффективности электростимуляции подопытные крысы одновременно получали клеточно-опосредованную генную терапию. Через четыре часа после нанесения травмы животным интратекально вводили 2×106 генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, трансдуцированных аденовирусными векторами, несущие гены NCAM1, VEGF165 и GDNF. С помощью поведенческих тестов, электрофизиологических методов исследования, иммунофлуоресцентного окрашивания и морфометрического анализа установлено синергичное действие эпидуральной стимуляции и клеточно-опосредованной генной терапии на регенерацию спинного мозга после контузионной травмы у крысы. Таким образом, заявленный конечный результат получен.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения работ по проекту в 2016 и 2017 гг нами были получены результаты, свидетельствующие о терапевтической эффективности эпидуральной электрической стимуляции в сочетании с клеточно-опосредованной генной терапии при контузионной травме спинного мозга у крысы. На третьем этапе исследования в 2018 г., согласно общему плану проекта, протокол клеточно-опосредованная генной терапии в сочетании с электростимуляцией при травме спинного мозга, разработанный в моделях на крысах, был оптимизирован для лечения мини-свиней с дозированной контузионной травмой спинного мозга. Для достижения поставленной цели были решены следующие конкретные задачи исследования. 1. Разработать методику эпидуральной электрической стимуляции спинного мозга, сочетающей два воздействия на спинной мозг: (1) выше места травмы на уровне С5 для стимулирования нейрорегенерации в эпицентре повреждения и (2) ниже травмы — на уровне L2 для возбуждения локальных нервных сетей, генерирующих локомоторную активность задних конечностей. Подготовка мини-свиней к эпидуральной стимуляции спинного мозга после контузионной травмы последовательно включала выполнение следующих манипуляций: (1) Имплантация стимулирующих и референсных электродов. Оперативное вмешательство включает: (а) премедикацию и введение животного в глубокий ингаляционный наркоз, (б) установку внешнего импланта, обеспечивающего связь стимулирующих и референсных электродов с оборудованием, на спине животного; (в) подшивание стимулирующего электрода к твердой мозговой оболочке на уровне С5 позвонка; (г) формирование подкожного туннеля и подшивание стимулирующего электрода к твердой мозговой оболочке на уровне L2 позвонка; (д) имплантация референсного проводов для стимулирующих электродов; (е) надлежащий послеоперационный уход. Через две недели после имплантации электродов у подопытных животных при условии, что они находились вне шоковой фазы и вне острого периода посттравматических осложнений, тестировали функциональность электростимулирующей системы (состояние электродов и их связь с подключенным к импланту оборудованием) и проведение возбуждения через эпицентр травмы. Анализ игольчатой миографии камбаловидной мышцы при стимуляции шейного отдела спинного мозга животных через две недели после имплантации электродов обнаружил вызванный ответ, представленный следующими компонентами: 1) ранний — обусловленный возбуждением низкопороговых мотонейронов двигательного центра камбаловидной мышцы, 2) средний — отражающий активацию высокопороговых двигательных единиц и 3) поздний — являющийся результатом рекрутирования интернейронной сети, вовлеченной в локомоторную активность задних конечностей. (2) Контузионная травма спинного мозга. Нейротравму моделировали через 3 недели после установки электродов. Доступ к спинному мозгу получали в ходе последовательных манипуляций: 1) продольного разреза кожи и подкожно-жировой клетчатки по задней срединной линии над остистыми отростками Тh7–Тh12 грудных позвонков; 2) препарирование скелетных мышц от остистых отростков и дужек позвонков; 3) рассечение межостистых и надостистых связок на уровне Тh8–Тh9 позвонков; 4) скусывание остистых отростков Тh8 и Тh9 позвонков; 5) открытый участок спинного мозга для нанесения травмы создавали путём удаления дужек (ламинэктомия) Тh8–Тh9 позвонков. Металлический цилиндр импактора фиксировали на расстоянии 1 мм от открытой поверхности спинного мозга. Для нанесения однократного удара металлическим стержнем по спинному мозгу животное было зафиксировано в оптимальной позе с вытянутым прямым позвоночником. Контузионную травму вызывали с помощью груза массой 50 гр, падающего с высоты 50 см. (3) Эпидуральная стимуляция. Через две и четыре недели после спинальной травмы, в ответ на стимуляцию шейного отдела спинного мозга анализ электромиографии выявил изменения показателей раннего, среднего и позднего компонента, характеризующиеся деформацией и снижением амплитуды вызванного потенциала. Таким образом, регистрация мышечных потенциалов камбаловидной мышцы через 2 и 4 недели после повреждения спинного мозга свидетельствует о сохранности функциональности электростимулирующей системы и возможности проведения возбуждения через эпицентр травмы. В ходе эксперимента в интервале между второй и четвертой неделями после моделирования контузионной травмы у мини-свиней были разработаны оптимальные параметры и режим эпидуральной стимуляции подопытных животных. В настоящем исследовании был использован режим стимуляции однонаправленным током с частотой 25-35 Hz, силой тока 7-25 mA и длительностью импульса 0,2 мс с помощью электростимулятора Digitimer DS7А (Digitimer Ltd., UK). Параметры электростимуляци задавались с помощью программного обеспечения LabChart (ADInstruments Inc., USA). Эпидуральную стимуляцию проводили через день по 30 мин в утреннее и вечернее время, так, что между процедурами временной перерыв составлял 7-8 часов. Утренний сеанс включал стимуляцию выше травмы на уровне С5 позвонка, при этом силу тока подбирается индивидуально к каждому подопытному животному, которая составляла 7-15 mA. Вечерний сеанс был направлен на возбуждение генераторов шагания ниже травмы на уровне L2. Сила тока в этом случае составляла 13-25 mA. Данный вид стимуляции совмещали с тренировкой животного на беговой дорожке. Для того, чтобы животное оставалось в пределах беговой дорожки и нагрузка на задние конечности составляла от 5% до 20% от ее собственного веса мини-свинью фиксировали с помощью бандажной повязки на туловище. При успешном проведении электростимуляции ниже уровня травмы у животных возникали шагательные движения, которые согласовывали со скоростью движения ленты беговой дорожки (0,3-0,4 м/c). Таким образом, на данном этапе исследования нами был разработан рабочий протокол эпидуральной стимуляции у мини-свиней с контузионной травмой спинного мозга для последующей комбинированной электро- и генной терапии. 2. Установить терапевтическую эффективность клеточно-опосредованной генной терапии мини-свиней с контузионной травмой спинного мозга. Генетически модифицированные мононуклеарные клетки крови пуповины (МККП) получали путем трансдукции лейкоцитов аденовирусными векторами, несущими гены сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165), глиального нейротрофического фактора (GDNF) и нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) согласно протоколу разработанному нами ранее. Подопытным животным после нанесения нейротравмы интратекально вводили 0,9% раствор NaCl или генетически модифицированные МККП, сверхэкспрессирующие терапевтические гены (VEGF, GDNF, NCAM) на уровне L4-L5 позвонков под анестезией кетамином (5 мг/кг) и диазепамом (0,5 мг/кг). Животные контрольной группы получали интратекальную инъекцию 200 мкл 0,9% раствора NaCl, экспериментальной группы — 2×106 МККП в 200 мкл 0,9% раствора NaCl. Соматосенсорные вызванные потенциалы (ССВП) у животных из контрольной и опытной группы на 3-й и 5-й неделе после инфузии генетически модифицированных МККП, или физиологического раствора, характеризовались уменьшенными ответами на стимуляцию срединного нерва и полным их отсутствием на стимуляцию икроножного нерва. У животного через 7 недель после трансплантации МККП были обнаружены положительные клинические и нейрофизиологические сдвиги. При стимуляции икроножного нерва у животного из терапевтической группы выявлен четко определяемый ответ N1 (2,25 ± 0,02 мкВ). При этом, восстановление локомоторной функции по шкале PTIBS соответствовало данным электрофизиологического исследования. Функциональное восстановление через семь недель после трансплантации МККП также коррелировало с восстановлением болевой чувствительности. Морфометрический анализ сохранности нервной ткани, каудальнее от эпицентра травмы, выявил, что в сером веществе у мини-свиньи после введения генетически модифицированных МККП патологические полости были меньшего объема (41.49%), в сравнении с животным из контрольной группы (71.38%±2.34%). В боковом канатике белого вещества у мини-свиньи с генной терапией количество миелиновых волокон было выше, при сравнении с контролем (1119.50± 4.32 против 767.33±2.80). Анализ иммуноэкспрессии белка теплового шока Hsp27 в трех областях серого вещества (VH — передний рог, DREZ — зона входа заднего корешка, CC — центральный канал) выявил, что уровень Hsp27 была выше у мини-свиней с МККП-терапией. Разница в иммуноэкспрессии Hsp27 в зонах белого вещества (VF — передний канатик и CST — кортикоспинальный тракт) между опытным и контрольным животным была незначительна. Иммуноэкспрессия белка теплового шока Hsp70 была выше у мини-свиней с МККП-терапией в DREZ, в VF и особенно в CST зонах. При этом, экспрессия Hsp70 в VF и CST у экспериментального животного была выше, чем у контрольной мини-свиньи в 2 и 3 раза, соответственно. В настоящем исследовании установлено, что одним из механизмов положительного действия МККП-опосредованной доставка в спинной мозг генов VEGF, GDNF и NCAM является усиление экспрессии Hsp27 в сером веществе и Hsp70 в белом веществе спинного мозга после контузионной травмы. Таким образом, на данном этапе исследования нами был разработан рабочий протокол клеточно-опосредованной генной терапии мини-свиней с контузионной травмой спинного мозга и определены методы исследования терапевтической эффективности генетически модифицированных МККП. 3. Разработать протокол и оценить терапевтическую эффективность клеточно-опосредованной генной терапии в сочетании с эпидуральной электростимуляцией при травме спинного мозга у мини-свиней. На заключительном этапе исследования, разработанные нами протоколы эпидуральной стимуляции и клеточно-опосредованной генной терапии с помощью генетически модифицированных МККП, были оптимизированы для комбинированной терапии мини-свиней с дозированной контузионной травмой спинного мозга. Ход работ по имплантации эпидуральных электродов для электрической стимуляции спинного мозга, моделированию контузионной травмы спинного мозга и интратекальной инфузии генетически модифицированных МККП выполнен согласно протоколам, разработанных на предыдущих этапах исследования. Генетически модифицированные МККП получали путем трансдукции лейкоцитарной фракции крови пуповины человека одновременно тремя аденовирусными векторами (Ad5), несущими гены сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF165), глиального нейротрофического фактора (GDNF) и нейрональной молекулы клеточной адгезии (NCAM1) в равном соотношении каждого вектора Ad5-VEGF (1/3), Ad5-GDNF (1/3), Ad5-NCAM (1/3) за сутки до трансплантации. Через три недели после имплантации электродов у животных моделировали контузионную травму спинного мозга. В течение 4 часов после операции животным контрольной группы (n=2) интратекально вводили 200 мкл 0,9% раствора NaCl, а животным опытной группы (n=2) — 2×106 генетически модифицированных МККП в 200 мкл 0,9% раствора NaCl. Эпидуральную электростимуляцию у животных опытной группы начинали через две недели после моделирования нейротравмы. Процедуру проводили в течение шести недель через сутки. Согласно разработанному протоколу животные получали эпидуральную стимуляцию в течение 30 мин в утреннее время и в течение 30 мин в вечернее время, так, что между процедурами у подопытных животных был перерыв продолжительностью 7-8 часов. В утренний сеанс проводили стимуляцию выше травмы на уровне С5 позвонка, при этом силу тока подбирали индивидуально к каждому подопытному животному, которая составила 7-15 mA. Вечерний сеанс был направлен на возбуждение генераторов шагания ниже травмы на уровне L2. Сила тока в этом случае составила 13-25 mA. Данный вид стимуляции совмещали с тренировкой животного на беговой дорожке. Для того, чтобы животное оставалось в пределах беговой дорожки и нагрузка на задние конечности составляла от 5% до 20% от ее собственного веса мини-свинью фиксировали с помощью бандажной повязки на туловище. При успешном проведении электростимуляции ниже уровня травмы у животных возникали шагательные движения, которые согласовывали со скоростью движения ленты беговой дорожки 0,3-0,4 м/c. Терапевтическую эффективность клеточно-опосредованной генной терапии в сочетании с эпидуральной стимуляцией у мини-свиней с контузионной травмой спинного мозга оценивали с помощью поведенческих тестов (PTIBS и кинематика суставов на беговой дорожке), электромиографии скелетной мышцы задних конечностей при стимуляции седалищного нерва и гистологических методов исследования (морфометрический анализ сохранности серого и белого вещества и иммунофлуоресцентное исследование молекулярных и клеточных изменений при ремоделировании спинного мозга после нейротравмы). Анализ кинематики суставов экспериментальных животных не обнаружил различий в опытной и контрольной группах. Однако, во время эпидуральной стимуляции поясничного отдела объем движения в голеностопном суставе животных из терапевтической группы приближался к значению интактных животных, что свидетельствовало о целесообразности стимулиролвания генераторов шагания для функциональной реабилитации животных. При ходьбе передняя большеберцовая мышца (m. tibialis anterior) обеспечивает сгибание голеностопного сустава. Через 60 дней после нейротравмы масса m. tibialis anterior у животных из терапевтической группы был больше, чем у контрольных животных. Анализ теста PTIBS позволил установить положительный эффект комбинированной терапии на восстановление локомоторной функции. У животных опытной группы через 6 недель после контузионной травмы появились признаки улучшения двигательной активности, которые через 8 недель достигли 2-х баллов по 10-бальной шкале. Электрофизиологическое исследование камбаловидной мышцы показало, что в контрольной группе животных моторный М-ответ имел несколько фаз, а рефлекторный Н-ответ отсутствовал. В терапевтической группе стимуляция седалищного нерва приводила к возникновению в камбаловидной мышце М-ответа стандартной формы. При этом, у этих животных также регистрировался рефлекторный Н-ответ, отражающий реакцию мотонейронов спинального двигательного центра на раздражение афферентов. Таким образом, регистрируемые электромиографические показатели свидетельствуют о том, что генно-клеточная терапия в сочетании с эпидуральной стимуляцией, активирует нейрореабилитационные процессы у мини-свиней после спинальной травмы. Морфометрический анализ сохранности серого и белого вещества спинного мозга ниже эпицентра травмы не обнаружил значимых различий у мини-свиней из терапевтической и контрольной групп. С помощью иммунофлуоресцентного метода исследования положительные молекулярные и клеточные сдвиги при ремоделировании спинного мозга были обнаружены у животных на фоне комбинированной терапии. Через 60 суток после моделирования нейротравмы иммуноэкспрессия Hps27 в спинном мозге была выше у животных из терапевтической группы, а количество Caspase3-позитивных клеток было больше у контрольных мини-свиней. Кроме того, у животных из терапевтической группы был обнаружен более высокий уровень иммуноэкспрессии синаптических белков (PSD95 и Synaptophysin), что свидетельствует о благоприятном влиянии комбинированной терапии на функциональное восстановление нейронов спинного мозга. Количественный анализ Olig2-позитивных клеток (олигодендроциты), GFAP-позитивных клеток (астроциты) и Iba1-позитивных клеток (микроглия) обнаружил уменьшение признаков астроглиоза и большей сохранности олигодендроглиальных клеток в спинном мозге на фоне комбинированной терапии. Заключение В настоящем исследовании на мини-свиньях через 2 недели после контузионной травмы спинного мозга в одном протоколе электростимуляции, совмещалось два воздействия на спинной мозг: (1) выше места травмы на уровне С5 для стимулирования нейрорегенерации в эпицентре повреждения и (2) ниже травмы — на уровне L2 для возбуждения локальных нервных сетей, генераторов шагания. Для повышения эффективности морфо-функционального восстановления спинного мозга через четыре часа после моделирования нейротравмы животным интратекально вводили 2×106 генетически модифицированных мононуклеарных клеток крови пуповины человека, сверхэкспрессирующих терапевтические молекулы-стимуляторы нейрорегенерации — сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), глиальный нейротрофический фактор (GDNF) и нейрональную молекулу клеточной адгезии (NCAM). С помощью поведенческих тестов, электрофизиологических и гистологических методов исследования установлено положительное действие эпидуральной стимуляции в сочетании с клеточно-опосредованной генной терапией на нейрореабилитацию мини-свиней после контузионной травмы. Таким образом, заявленный конечный результат получен.