Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 году 24 пациентам вводились мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) после трансплантации аллогенного костного мозга (алло-ТКМ) с целью профилактики острой реакции трансплантат против хозяина (оРТПХ). Показано, что в группе больных, получавших ММСК в качестве профилактики оРТПХ, данное осложнение возникало в 2 раза реже, чем у больных, получавших только стандартную профилактику. Введение ММСК не влияет ни на частоту развития рецидива, ни на приживление трансплантата. В итоге общая выживаемость пациентов была достоверно выше в группе больных, получавших ММСК. Среди пациентов, получивших ММСК, в 11% случаев развилась оРТПХ 2-4 степени. Целью данной части работы было выявить различия между образцами ММСК, после введения которых развилась и не развилась оРТПХ. ММСК доноров с успешной и неуспешной профилактикой оРТПХ сравнили по способности ингибировать пролиферацию лимфоцитов. Различий в этой способности обнаружено не было. Относительное количество непролиферирующих лимфоцитов было в 2 раза выше, чем в контроле (лимфоциты без ММСК) в обеих группах. В группе с успешной профилактикой это увеличение составило 2,3 ±0,23, а с неуспешной 2,0±0,32 раза.Был проведен анализ относительного уровня экспрессии некоторых генов, влияющих на различные свойства ММСК (уровень дифференцированности, способность к пролиферации, иммуномодуляции) в группах успешной и неуспешной профилактики оРТПХ. Уровень экспрессии подавляющего большинства проанализированных генов не отличался в сравниваемых группах. Исключения составили гены FGFR1, ICAM1 и CFH. Суммируя полученные результаты, удалось выявить, что образцы ММСК, эффективно предотвратившие развитие оРТПХ, отличались более высокой клеточной продукцией и повышенным относительным уровнем экспрессии генов FGFR1, ICAM1 и CFH, по сравнению с образцами ММСК, оказавшимися неэффективными. Поскольку количество случаев неэффективной профилактики оРТПХ пока не велико, данные можно считать только предварительными и это направление работы будет продолжено. Отдельной частью работы было исследование возможности восстановления стромального микроокружения костного мозга при неприживлении трансплантата у больных после алло-ТКМ. У 5 больных после алло-ТКМ в течение длительного времени наблюдалась аплазия кроветворения. Считается, что не приживление трансплантата связано с иммунным отторжением перелитых клеток костного мозга. При внутривенном введении ММСК, клетки, как правило, не попадают в костный мозг. ММСК обладают не только иммуномодулирующей функцией, но и способны дифференцироваться в клетки стромального микроокружения и формировать нишу для стволовых кроветворных клеток. Внутрикостное введение ММСК позволяет ввести эти клетки непосредственно в костный мозг. Целью введения ММСК было поддержание стромального микроокружения костного мозга больных. В 4 из 5 случаев после внутрикостного введения ММСК у больных отмечалось восстановление кроветворения. У 4 больных удалось получить костный мозг через 1-6 месяцев после внутрикостного введения ММСК. Из полученного костного мозга были выделены ММСК. На 2 пассаже ММСК больных, полученных из 4-х проколов подвздошных костей (примерно в местах введения), были исследованы для определения донорских клеток. У больного 2 в небольшом проценте были обнаружены ММСК донора в 3-х образцах из 4-х. У больного 3 только в одном образце из 4-х были выявлены ММСК донора (17%). У 2-х больных через 3 и 5 месяцев после внутрикостного введения донорских ММСК в костном мозге были выявлены стромальные клетки-предшественники донора. В этой части работы получены данные о длительном существовании донорских ММСК, введенных под надкостницу, в организме человека. Введенные ММСК оказались функционально адекватными, так как были выявлены в популяции мезенхимных клеток из костного мозга больных через 3 и 5 месяцев после их введения. Таким образом, показано, что введенные в небольшом количестве ММСК остаются локализованными в месте введения и не теряют способности пролиферировать ex vivo. Фактически эти клетки пережили 3 переноса: из организма донора в культуру, затем снова в организм больного и повторно в культуру. Это означает, что эти клетки хоть и в большинстве своем не являются стволовыми, но обладают хорошей жизнеспособностью и высоким пролиферативным потенциалом, который постепенно снижался и к третьему переносу значительно уменьшился. Небольшая пропорция донорских клеток среди ММСК может быть связана с одной стороны с тем, что место забора костного мозга не совпало с местом введения ММСК, или с тем, что ММСК были введены в небольшом количестве. Образцы, в которых наблюдался даже очень невысокий процент донорских клеток, обладали более высоким пролиферативным потенциалом, чем ММСК только реципиента. Эти данные указывают на то, что стромальные клетки больных находились в угнетенном состоянии, с чем и может быть связана несостоятельность трансплантата. Донорские ММСК не обеспечили восстановления донорского кроветворения, однако, во всех трех случаях с введением ММСК совпало восстановление собственного кроветворения реципиента после длительной аплазии. Отсутствие донорского кроветворения может быть связано с недостаточным количеством введенных после ММСК клеток донора или гибелью ранее введенных стволовых клеток крови. Только больному 4 после введения ММСК внутрикостно удалось выполнить трансплантацию гемопоэтических клеток от того же донора в стандартном количестве (более 2х106/кг CD34+ клеток). У этого больного восстановилось в течение 2-х недель донорское кроветворение. Полученные данные указывают на то, что в случае несостоятельности трансплантата необходимо попытаться после любого кондиционирования ввести внутрикостно как можно большое количество ММСК в максимально возможное количество мест. Таким образом, во-первых, впервые показано длительное существование ММСК донора в организме человека. Во-вторых, выявлены большие потенции ММСК, не являющихся стволовыми клетками, к повторным переносам. В рамках поиска способов повышения иммуномодулирующих свойств ММСК проводится исследование возможности использования различных цитокинов, включая интерферон гамма (ИФН). Обработка ММСК ИФН приводит к снижению клеточной продукции. ММСК культивировали в присутствии 500 ед/мл ИФН в течение 2-х пассажей. При этом достоверно снижается клеточная продукция в культурах, обработанных ИФН (р<0,01). При культивировании ММСК с 500 ед/мл ИФН в течение 4-х часов с последующей сменой среды не происходит угнетения клеточной продукции ММСК. Такое непродолжительное время обработки ММСК ИФН позволяет избежать дополнительных усилий по наращиванию большого количества ММСК. При культивировании ММСК с ИФН (500 ед/мл) в течение 4-х часов с последующей сменой среды уровень экспрессии IDO1 повышался в 360 раз. Уровень экспрессии этого гена после добавления ИФН сильно варьирует от 0,5 до 149656, медиана 8478 относительных единиц, что говорит о том, что активация ММСК не является стабильным ответом на этот цитокин, и ММСК имеют индивидуальные различия в чувствительности к ИФН. При снижении концентрации ИФН в среде культивирования до 200 ед/мл уровень экспрессии IDO1 не так сильно повышался (в 260 раз), однако, индивидуальные различия сохранялись (от 0,2 до 99807, медиана 5955). Такой высокий уровень экспрессии этого гена сохранялся еще в течение 1-2 суток после обработки ИФН в обеих концентрациях. Одновременно под действием ИФН изменялся, но не так выражено, как IDO1 относительный уровень экспрессии других генов, участвующих в иммуномодуляции. Достоверно и дозозависимо повышался уровень экспрессии IL6 и CSF1 в 2,4-2,5 и 5,5-7 раз соответственно (р<0,05). В дальнейшем уровень экспрессии этих генов остается повышенным по отношению к ММСК, не обработанным ИФН, но различия перестают быть достоверными. Уровень экспрессии HLA антигенов повышается после обработки ММСК ИФН в течении 4-х часов. Через 2 часа после удаления ИФН из среды культивирования экспрессия HLA-DR практически не изменяется при дозе ИФН 200 ед/мл и повышается незначительно при дозе 500 ед/мл и только через сутки повышается в 5 и 10 раз соответственно. Учитывая значительное увеличение экспрессии IDO1 уже через 2 часа после удаления ИФН из среды культивирования, обработанные ИФН ММСК желательно использовать сразу после активирования. ММСК при дифференцировке частично теряют свою иммунопривилегированность и начинают экспрессировать молекулы HLA. После обработки ММСК ИФН на их поверхности также повышается уровень экспрессии CD90. Известно, что ММСК слабее экспрессируют CD90, чем дифференцированные клетки. Совокупность полученных данных говорит об активации ММСК ИФН. Очевидно, что для активации достаточно 4-х часов, можно использовать не 500 ед/мл, а 200 ед/мл ИФН. Такая непродолжительная инкубация ММСК с ИФН не изменяет их пролиферативный потенциал и молекулы HLA не успевают начать экспрессироваться на поверхности клеток. Ко-культивирование ММСК с лимфоцитами также повышает уровень экспрессии HLA-DR на ММСК. При ко-культивировании ММСК с активированными лимфоцитами уровень экспрессии HLA-DR на ММСК повышается существенно больше, чем при культивировании с не активированными лимфоцитами или после обработки ИФН. Ко-культивирование ММСК-ИФН с лимфоцитами приводит к тому, что уровень экспрессии HLA-DR постепенно повышается. При этом оказывается, что через 4 суток ко-культивирования ММСК-ИФН с лимфоцитами уровень экспрессии HLA-DR достоверно выше, чем на ММСК-ИФН без лимфоцитов. Разницы в экспрессии HLA-DR между собственными и аллогенными лимфоцитами обнаружено не было, т.е. активация ММСК лимфоцитами в любом случае приводит к повышению уровня экспрессии HLA-DR. Эти данные впервые демонстрируют изменения в ММСК при культивировании с лимфоцитами. Вероятнее всего в организме происходит тоже самое, и ММСК теряют свою иммунопривилегированность. Результаты работы выявляют предпочтительность использования ММСК от собственного донора костного мозга или аутологичных, если речь идет не о трансплантации гемопоэтических клеток, для клеточной терапии.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) обладают уникальными свойствами: их можно получить в больших количествах в культуре, они способны дифференцироваться в костном, хрящевом и жировом направлениях при ретрансплантации в организм и обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами, которые проявляются при их активации. В работе изучали возможность активации ММСК in vitro с помощью различных цитокинов с целью повысить их иммуномодулирующие свойства, с наименьшими изменениями в их жизнеспособности и параметрах роста. Было показано, что при инкубации ММСК с интерфероном гамма (ИФН) в дозе 500 ед/мл в течение 4 часов суммарная клеточная продукция не изменяется, а иммуномодулирующие факторы усиливаются. Подобраны дозы для интерлейкина 1 бета (ИЛ1), TNF-a, TGF-b, ИЛ17. Показано, что обработка ММСК ИФН и TGF-b достоверно снижает их суммарную клеточную продукцию. ММСК считались иммунопривелигированными, так как на них в условиях стандартного культивирования слабо экспрессированы HLA-ABC и не экспрессированы HLA-DR – антигены гистосовместимости. Показано, что после воздействия ИФН на ММСК повышался уровень экспрессии HLA-ABC и появлялась экспрессия HLA-DR. При обработке ММСК ИЛ1, ИФН и TNF-a значительно увеличивалась экспрессия молекулы адгезии ICAM-1 (CD54), что свидетельствует о повышении их адгезивной способности. Это очень важный результат, так как ММСК способны к иммуномодуляции, как за счет выделяемых ими растворимых факторов, так и за счет прямого межклеточного взаимодействия. Предварительная обработка ММСК этими цитокинами повышает их способность к взаимодействию с другими клетками, в частности с лимфоцитами. При обработке ММСК ИФН достоверно повышался относительный уровень экспрессии (ОУЭ) Il-6, CFH, IDO1, PTGES и CSF1. ОУЭ Il-6 также повышался при обработке ММСК ИЛ1, ИЛ17, TGF-b и TNF-a. Полученные результаты демонстрируют различное влияние цитокинов на основные характеристики ММСК. ММСК используют в лечебных целях. В организме после их внутривенного введения эти клетки взаимодействуют с лимфоцитами в различных тканях и периферической крови. В работе изучали изменения характеристик ММСК при взаимодействии с лимфоцитами in vitro в динамике. Изучение параметров роста ММСК в присутствии лимфоцитов продемонстрировало достоверное увеличение пропорции мертвых клеток. Известно, что в организме реципиентов донорские ММСК определяются не более чем в течение 2-х недель после внутривенного введения. Полученные в работе данные могут отчасти объяснить эти наблюдения. Было показано, что ко-культивирование ММСК с активированными (ФГА-) лимфоцитами приводило к увеличению экспрессии HLA-ABC уже через сутки в 2 раза. Экспрессия HLA-ABC на γ-ММСК (обработанные ИФН) увеличивалась по сравнению с контрольной только к 4 суткам в 2 раза. Через 4 суток ко-культивирования с ФГА-лимфоцитами экспресссия HLA-ABC была в 1,3 раза меньше на ИЛ-ММСК (обработанные ИЛ1), чем на γ-ММСК. Экспрессия HLA-DR на 1 сутки культивирования отсутствовала на ММСК и ИЛ-ММСК. Обработка ИФН приводила к увеличению экспрессии HLA-DR на поверхности ММСК уже через сутки культивирования и увеличивалась в 10 раз к 4 суткам. Взаимодействие с неактивированными лимфоцитами приводило к незначительному изменению экспрессии HLA-DR на ММСК и на ИЛ-ММСК. Через сутки ко-культивирования экспрессия HLA-DR на ИЛ-ММСК была ниже в 7 раз, чем на γ-ММСК. Культивирование с ФГА-лимфоцитами значительно увеличивало экспрессию HLA-DR во всех группах ММСК к четвёртым суткам (в 10-50 раз). Вероятнее всего, после введения в организм ММСК или ММСК-γ и их встречи с лимфоцитами они не будут отличаться по экспрессии HLA-DR. То есть активирование ММСК ИФН не будет существенно влиять на иммунный ответ in vivo. Таким образом, показано, что при взаимодействии с лимфоцитами на ММСК экспрессируются молекулы главного комплекса гистосовместимости и эти клетки становятся иммуногенными. Эти наблюдения имеют принципиальное значение для выбора источника ММСК для клеточной терапии. Предпочтительно использовать аутологичные ММСК. При ко-культивировании с лимфоцитами на ММСК увеличивается экспрессия ICAM-1 (CD54), взаимодействие с активированными лимфоцитами значительно увеличивает эффект, тогда как обработка ММСК цитокинами не оказывает существенного влияния. После попадания ММСК в организм может изменяться их дифференцировочный потенциал. Экспрессия одного из основных маркеров ММСК, антигена CD90, присутствующего на всех клетках популяции, снижалась при взаимодействии ММСК с лимфоцитами, что указывает на возможное стимулирование дифференцировки ММСК. Анализ экспрессии генов, участвующих в дифференцировке, продемонстрировал увеличение уровня экспрессии гена SPP1 в 2 раза в ММСК- γ. Взаимодействие ММСК с лимфоцитами и активация их ИФН по-разному влияет на различные направления дифференцировки. К главным молекулам иммуномодулирующего действия ММСК относятся IDO1, PTGES, CFH и CSF1, также показано участие различных хемокинов и цитокинов. Взаимодействие с лимфоцитами и обработка ММСК ИФН значимо повышают экспрессию IDO1. Это происходит за счет того, что при ко-культивировании с ММСК лимфоциты начинают высоко экспрессировать ИФН. По мере культивирования уровень экспрессии IDO1 снижался во всех вариантах экспериментов. Однако если воздействие было достаточно сильным (ИФН + лимфоциты или активированные ФГА-лимфоциты), то и на 4-ые сутки уровень экспрессии IDO1 оставался очень высоким, в 450-2000 раз выше, чем в контрольных ММСК. Таким образом, в случае клеточной терапии наиболее эффективно вводить активированные ИФН ММСК в первые сутки после праймирования. И обработка ИФН, и ко-культивирование с лимфоцитами приводили к увеличению ОУЭ CFH в 2 – 2,5 а с ФГА-лимфоцитами в 3-4 раза; ОУЭ PTGES в 2 раза, а с ФГА- лимфоцитами в 3,7 раза;ОУЭ IL6 в 20 раз, а с ФГА-лимфоцитами в 25 раз; ОУЭ CSF1 в 4 раза, с ФГА-лимфоцитами в 10 раза. Полученные данные четко определяют существенные изменения в ММСК при взаимодействии с лимфоцитами и после обработки ИФН. При ко-культивировании лимфоцитов с ММСК и происходит взаимовлияние этих клеток друг на друга. Изменяются не только основные свойства ММСК и γММСК, но и субпопуляции лимфоцитов. Показано, что ММСК оказывают большое влияние на лимфоциты при их взаимодействии. Важно, что все изменения не зависят от праймирования ММСК ИФН и принадлежности лимфоцитов. ММСК в организме регулируют как кроветворные клетки-предшественницы так и клетки, участвующие в иммунном ответе. Полученные в работе данные об активации экспрессии HLA-DR на поверхности ММСК при взаимодействии с лимфоцитами имеют принципиальное значение для выбора источника ММСК для клеточной терапии. Очевидно, что со временем иммуномодулирующая активность ММСК падает. Необходимо учитывать время взаимодействия ММСК с лимфоцитами. В случаях, если достаточно 1-2 суток можно использовать аллогенные ММСК, если желателен более длительный эффект необходимо использовать аутологичные ММСК.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
При изучении изменений в субпопуляциях лимфоцитов при со-культивировании с мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (МСК) были выявлены 2 различающиеся группы МСК. На лимфоцитах при со-культивировании с МСК одной группы (А) увеличивалась экспрессия HLA-DR, тогда как на лимфоцитах со-культивированных с МСК другой группы (В) экспрессия не отличалась от таковой на лимфоцитах культивированных без присутствия МСК. Оказалось, что и на самих МСК при взаимодействии с лимфоцитами начинают экспрессироваться молекулы HLA-DR, причем не на всех образцах, а только на тех, которые индуцировали повышенную экспрессию на лимфоцитах. Это происходило не зависимо от того использовали аллогенные лимфоциты или аутологичные для со-культивирования с МСК. В МСК группы А достоверно увеличивается относительный уровень экспрессии IDO1 по сравнению с группой В. Выявленные индивидуальные различия в МСК могут объяснить почему не все образцы МСК оказываются эффективными для лечения аутоиммунных заболеваний, острой реакции трансплантат против хозяина и других. https://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2Fs10517-018-4218-3.pdf Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК) участвуют в формировании ниш для стволовых кроветворных клеток и являются элементами, поддерживающими кроветворение. МСК донора могут служить источником восстановления ниш для кроветворных клеток у больных с несостоятельностью трансплантата (НТ) после трансплантации аллогенных стволовых кроветворных клеток (алло-ТГСК). Так как при внутривенном введении МСК только в очень небольшом количестве попадают в костный мозг (КМ), в работе МСК имплантировали в губчатую ткань задних верхних остей подвздошных костей. В ФГБУ МНИЦ гематологии МЗ России для каждого больного индивидуально наращиваются МСК от собственного донора КМ, которые хранятся в замороженном виде. Наблюдались 7 больных с НТ после алло-ТГСК. Во всех случаях была предпринята попытка повторной алло-ТГСК с одновременным введением МСК от донора КМ в ткань губчатой кости. У больных через 1, 2, 4,5 и 9 месяцев после внутрикостного введения донорских МСК были выполнены пункции КМ. Из КМ культивировали МСК. На 1-3-м пассажах в МСК больных определяли химеризм с помощью метода STR-PCR. У 5 из 7 больных отмечалось восстановление донорского кроветворения, и среди МСК были выявлены клетки донора (9.4±3,3%). Показано, что имплантированные МСК остаются локализованными в месте введения и не теряют способность к размножению. Можно предположить, что МСК участвовали в восстановлении ниш для гемопоэтических клеток донора или оказали иммуномодулирующее действие предотвратившее повторное отторжение трансплантата. Возможно внутрикостная имплантация МСК может способствовать успеху второй трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. https://www.hindawi.com/journals/sci/2018/6495018/ Было выполнено исследование субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных, которым проводили и не проводили профилактику острой РТПХ с помощью мультипотентных мезенхимных клеток после трансплантации аллогенного костного мозга. Проанализированы данные по 28 пациентам, 13 из которых получали стандартную профилактику РТПХ, а 15 дополнительно с целью профилактики РТПХ вводили МСК донора гемопоэтических клеток. Методом проточной цитофлуорометрии изучены лимфоциты периферической крови в день восстановления числа лейкоцитов до 1*109/л (день введения МСК), через 3 дня и через 30 дней. В день 0 до введения МСК достоверных различий между группами выявлено не было. Через 3 суток после введения МСК в периферической крови пациентов достоверно увеличилось в 3 раза количество CD4+TM (p=0,029), в 8 раз CD8+ТЕ (р=0,05), в 4 раза CD4+PD-1+ (р=0,019) лимфоцитов по сравнению с контрольной группой. Через 30 суток после введения МСК достоверно увеличились субпопуляции CD4+CM в 2,3 (p=0,007); CD4+TM в 2,8 (p=0,05); CD4+TE в 3,5 (p=0,01); CD8+ТЕ в 2,7 (р=0,03); CD4+CD25+ в 2,8 (p=0,02) и T reg в 2,3 (p=0,007) раза по сравнению с контрольной группой. Остальные субпопуляции лимфоцитов достоверно не различались между группами ни через 3 ни через 30 дней после введения МСК. Значительное увеличение количества клеток центральной памяти и эффекторных клеток памяти, а также CD4+CD25+ в периферической крови больных после введения МСК при отсутствии изменений в количестве наивных Т клеток указывает на активирование клеток, участвующих в адаптивном иммунном ответе. Увеличение субпопуляции T reg в организме, а не в системе in vitro подтверждает возможность МСК модулировать развитие острой реакции трансплантат против хозяина. Было показано, что у больных, у которых не развилась оРТПХ было в 3 раза (не достоверно Р=0,1) увеличено количество T reg клеток в периферической крови по сравнению с теми, у которых не развилась РТПХ. https://learningcenter.ehaweb.org/eha/2018/stockholm/215856/yulia.davydova.the.study.of.lymphocytes.subpopulations.in.peripheral.blood.of.html?f=listing%3D4%2Abrowseby%3D8%2Asortby%3D2%2Amedia%3D2%2Aspeaker%3D619428