КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-15-00118

НазваниеРазработка лабораторных методов оценки иммуногенности генно-инженерных биологических лекарственных препаратов

РуководительТотолян Арег Артемович, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Санкт-Петербург

Годы выполнения при поддержке РНФ 2016 - 2018 

КонкурсКонкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11)

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словаБиотехнологии, клиническая-лабораторная диагностика, разработка новых лекарственных средств, биологические лекарственные препараты, иммуногенность лекарственных препаратов, связывающие антитела, нейтрализующие антитела, терапевтическая эффективность

Код ГРНТИ76.00.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Генно-инженерные биологические лекарственные препараты используются во многих областях медицины, прежде всего для лечения хронических заболеваний. Во многих случаях, терапия биопрепаратами является единственной альтернативой симптоматическому лечению пациентов, предотвращения их ранней инвалидизации и смертности. Повсеместное использование генно-инженерных биологических препаратов позволяет проводить патогенетическую терапию многих заболеваний, кроме того их разнообразие и эффективность приближает эру персонализированной медицины. Ограничением широкого использования биологической терапии является не только ее высокая стоимость, но и проблема уникальных иммунных ответов человеческого организма на введение сложных биологических субстанций. Даже при полном соответствии аминокислотной последовательности особенности пост-трансляционной модификации белка, вещества примеси, в том числе остатки экспрессионных линий и штаммов-продуцентов могут быть причиной развития иммунных ответов. Другой причинной иммуногенности препаратов являются вещества стабилизаторы, особенности хранения, пути введения и состояние организма пациента. Результатом иммуногенности может быть развитие анафилактических реакций, изменение фармакокинетических и фармакодинамических характеристик препарата, снижение эффективности терапии, появление антител к собственным молекулам организма с развитием тяжелых аутоиммунных осложнений. Проявлением иммуногенности является индукция связывающих антител и нейтрализующих антител. Нейтрализующие антитела ингибируют эффекты биологического препарата и приводят к подавлению терапевтического эффекта. Хотя связывающие антител не оказывают прямого воздействия на механизмы терапевтического эффекта они могут оказывать влияние на фармакокинетику и приводить к развитию анафилактических реакций. Исследования для оценки иммуногенности биотехнологических препаратов и их биоаналогов рекомендуются рядом международными организациями, в том числе FDA и EMEA. В клинической практике выявление имунногенности позволяет своевременно установить причину снижения терапевтической эффективности биопрепаратов, оптимизировать назначение дорогостоящих биопрепаратов и индивидуализировать терапию. В настоящее время нами разработан ряд лабораторных методов для определения связывающих антител и нейтрализующих антител к генно-инженерным биологическим препаратам. Для лабораторного определения связывающих антител используется оригинальный иммунохимический тест, для детекции нейтрализующих антител используется оценка биологического ответа на биопрепарат-чувствительной клеточной линии, в том числе репортер-трансфецированной клетках HL-116. Нами получены пилотные данные по частоте связывающих и нейтрализующих антител к терапевтическим препаратам интерферона-бета и глатирамер-ацетата при рассеянном склерозе, разработан метод определения связывающих антител к генно-инженерному эритропоэтину. В ходе ожидаемых 3-х лет исследования в рамках проекта проекта планируется провести стандартизацию методов, и валидировать платформу тестов для лабораторной детекции связывающихся и нейтрализующих антител к генно-инженерным биологическим препаратам. Планируется получить данные о риске индукции связывающих и нейтрализующих антител у пациентов с рассеянным склерозом, принимающих разные формулировки интерферона-бета. Планируется разработать, валидировать и стандартизировать методы детекции нейтрализующих антител к препаратам эритропоэтина; исследовать распространенность нейтрализующих антител к эритропоэтину и их влияние на биологическую и терапевтическую активность препарата. Планируется разработать методы и исследовать антитела к препаратам моноклональных антител против фактора некроза опухолей альфа (ФНОа). Изучить их распространенность и их влияние на клинический эффект препарата в разных группах пациентов. Результатом проекта будут новые валидированные методы лабораторного определения нейтрализующих антител к ряду генно-инженерных биологических препаратов, будет получена информация о распространенности феномена иммуногенности оригинальных биотерапевтических препаратов и их биоаналогов в том числе выпускаемых на территории Российской Федерации.

Ожидаемые результаты
Учитывая отсутствие стандартизированных методов детекции антител к терапевтическим белкам целью нашего проекта является разработка диагностических тест- систем для детекции связывающих и нейтрализующих антител к терапевтическим белкам, а именно цитокинам (терапевтическим препаратам интерферона бета), факторам роста (терапевтическим препаратам эритропоэтина) и моноклональным антителам (ингибиторы ФНОа). В ходе его выполнения будет решено 7 задач соответствующих пунктам плана работ над проектом. За время выполнения проекта основные результаты работы будут достигнуты в следующей последовательности: 1. Разработка и валидация метода детекции связывающих антител к биологическим лекарственным препаратам (выполнение в течении 2016 года); 2. Оценка клинической распространенности и роли САТ в снижении терапевтической эффективности БЛП (выполнение в течении 2016 года); 3. Создание и стандартизация биологических методов оценки НАТ с помощью биопрепарат-чувствительных клеточных линий (выполнение в течении 2016 года); 4. Исследование влияние НАТ на активность оригинальных и генерических БЛП с целью предсказания клинической эффективности лекарственных средств (выполнение в течении 2017 года). 5. Разработка методов измерения концентарций биологических лекарственных перепаратов для оценки их биологических эффектов на примере терапевтических моноклональных антител. (выполнение в течении 2017 года); 6. Создание, валидация и стандартизация платформы детекции антител (выполнение в течении 2018 года); 7. Исследование распространенности феномена иммуногенности биологических лекарственных препаратов и определение возможных методов ее предотвращения (выполнение в течении 2018 года). Уровень полученных данных будет сопоставлен с опубликованным данными зарубежных исследований по оценке иммуногенности биологических препаратов. Перспективы развития научного приоритета является создание референтного центра и производства тест систем для выявления антител к биологическим препаратам, по аналогии с существующими за рубежом специализированными организациями. Результаты исследования будут изложены в виде цикла статей в высокорейтинговых отечественных и зарубежных журналах по рассматриваемому вопросу, основные выводы будут представлены на отечественных и зарубежных конференциях. Выполнение задач проекта, позволит создать валидированную и стандартизированную платформу диагностики антител к генно-модифицированным биологическим препаратам. Хотя предлагаемый проект затрагивает лишь несколько групп биологических перпаратов, включая препараты интерферонов, эритропоэтина, и терапевтических антител к ФНОа, методическая платформа могут быть использованы для детекции антител к другим, в том числе перспективным, биотехнологическим молекулам. Основными области применения результатов проекта мы предполагаем следующие: 1. Доклинические и клинические исследования новых генно-инженерных биологических лекарственных средств; 2. Терапевтический контроль создания биоаналоговых препаратов для обеспечения импортозамещения в области производства генно-инженерных лекарств 3. Выявление нежелательных реакций в ходе применении биологических препаратов и постмаркетинговый контроль и сравнение оригинальных и воспроизведенных биологических препаратов; 4. Дать рекомендации по организации мониторинга иммунологической причины терапевтической неэффективности ряда биопрепаратов; 5. Предоставить информацию по сравнению генно-инженерных биологических препаратов, использующихся в рутинной клинической практике; 6. Разработка тест-систем для определения связывающих и нейтрализующих антител к биопрепаратам для использования в клинической практике; 7. Результаты исследования позволят снизить нецелевые затраты на государственные программы по обеспечению пациентов дорогостоящими лекарственными средствами;


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Генно-инженерные биологические препараты (ГИБП) представляют собой белки, получаемые с помощью технологии рекомбинантной ДНК. В отличие от низкомолекулярных лекарственных препаратов, ГИБП обладают иммуногенностью, которая проявляется как в отношении молекул биопрепарата, так и против родственных белков организма. Следствием высокой иммуногенности ГИБП является появление антител, способных изменять фармакологические свойства препаратов и снижать клинический эффект от проводимой терапии. Разработка лабораторных тестовых систем детекции антител к ГИБП и внедрение их в рутинную практику поможет оптимизировать курс дорогостоящих препаратов, индивидуализировать терапию и избежать развития нежелательных последствий снижение клинического эффекта от терапии. Антитела, синтезирующиеся против ГИБП, условно разделяют на связывающие (САТ) и нейтрализующие (НАТ) Для определения концентрации САТ к препаратам интерферона-бета (ИНФ-бета), применяющихся для лечения рассеянного склероза (РС) и эритропоэтина (ЭПО), применяющегося для лечения анемии, была разработана методика, основанная на принципе дот-блоттинга.Для создания систем определения антител к ЭПО и ИНФ-бета препараты инкубировались на нитроцеллюлозной подкладке и блокировались специальным буфером. После этого сыворотка пациентов инкубировалась с мембраной, содержащей ЭПО или ИНФ-бета, и окрашивалась с использованием цветной реакции, что позволяло определить концентрацию связавшихся с ГИБП антител. Окрашивание мембран измерялось в условных единицах оптической плотности (ОП). Для расчета точной концентрации антител был построен график кривой разведения чистого иммуноглобулина G (IgG). Была проведена стандартизация и валидация разработанного метода. Минимальная детектируемая концентрация иммуноглобулина метода дот-блоттинга, которая была определена с помощью кривой разведения чистого IgG с шагом х2, составила 12,9 мкг/мл. Линейность метода определения САТ к ЭПО составила R² = 0,95 в широком диапазоне разведений. Серийные измерения концентрации САТ к ИНФ-бета в контрольном образце обеспечивали линейность R² = 0,98 в широком диапазоне разведений.Для оценки лабораторной прецизионности тестовой системы были рассчитаны внутрипостановочная воспроизводимость и межпостановочная воспроизводимость. При оценке внутрипостановочнойвоспроизводимости, коэффициент вариации (CV%) концентрации САТ к ЭПО в положительном образце составил 2%, в отрицательном образце– 3%. Так, CV% САТ к ИНФ-бета в положительном образце составил 3%, в отрицательном образце– 4%. При оценке межпостановочнойвоспроизводимости CV% концентраций САТ к ЭПО в положительном образцесоставил 5%, в отрицательном образце– 6%. В то же время CV%концентрации САТ к ИНФ-бета в положительном образце составил 7%, в отрицательном образце– 5%.. Порог нормы концентрации САТ к ЭПО составил 20,27 мкг/мл (95 CI% ±0,43), САТ к ИНФ-бета составил 16,08 ОП (95 CI% ±0,43) при разведении сывороток 1:100. Для подтверждения специфичности САТ к препарату ИНФ-бета была проведена реакция нейтрализации. С увеличением концентрации растворенного препарата оптическая плотность хромогенной реакции падала, что указывало на эффективное подавление связывания САТ. Помимо этого нами была валидирована и стандартизирована методология определения нейтрализующих антител (НАТ) к препаратам ИНФ-бета. Для этого была использована клеточная линия фибросаркомы человека HT-1080 (ATCC) клон HL-116, несущий стабильный трансген люциферазы, экспрессия которого контролируется регуляторной областью генов интерферонового ответа. Определение концентрации НАТ к ИНФ-бета проводилось путем инкубации разведений сыворотки крови больных РРРС, получавших терапию ИНФ-бета, с ИНФ-бета-1а (Авонекс) в концентрации 10 ЛЕ/мл. Смесь сыворотки и интерферона инкубировалась с клеточной культурой в течении 5 часов, после чего добавлялся субстрат люциферазы, клетки лизировались и проводилось измерение люминесцентного сигнала. В случае наличия НАТ они нейтрализовали активный терапевтический интерферон, что приводило к подавлению экспрессии репортерного гена люциферазы.При оценке внутрипостановочной воспроизводимости, коэффициент вариации концентрации НАТ к ИНФ-бета в положительном образце составил 2%, в отрицательном образце на НАТ к ИНФ-бета – 3%. При оценке межпостановочной воспроизводимости коэффициент вариации концентраций НАТ к ИНФ-бета в положительном образце составил 4%, в отрицательном образце на НАТ к ИНФ-бета – 7%. При исследовании линейности теста определения НАТ к ИНФ-бета коэффициент R2 3 серий по 8 разведений одного образца составил 0,99. Кроме этого установлено отсутствие интерференции между ревматоидным фактором (вне зависимости от его концентрации), антителами к двуспиральной ДНК, гладким мышцам, антинуклеарным фактором и результатами выявления НАТ в исследуемых образцах. При валидации границ нормы, ни у одного из 20 обследуемого донора крови концентрация НАТ не превышала установленного порога нормы. Нами было проведено исследование частоты формирования САТ и НАТ к препаратам ИНФ-бета различных производителей у пациентов с РРРС с помощью разработанных методик, а также с помощью коммерческого ИФА набора. Для этого нами были отобраны сыворотки 33 больных РРРС, получавших терапию препаратами ИНФ-бета-1а различных производителей более 1 года (Группа №1), сыворотки 40 доноров крови, не получавших препараты ИНФ-бета и не имевших аутоиммунных заболеваний (Группа №2), и 15 пациентов с диагнозом РРРС, не получавших препараты ИНФ-бета (Группа №3). В группе № 2 и в группе № 3 титры НАТ к ИНФ-бета, а также концентрации САТ, измеренные двумя лабораторными методами не достигли положительных значений у всех пациентов. В группе № 1 по данным теста дот-блоттинга у 19 пациентов (57,6%) были выявлены положительные титры САТ к ИНФ-бета, в то время как по данным ИФА у 20 пациентов (60,7%) титр САТ соответствовал критериям позитивности. Был выявлен высокий уровень корреляции результатов тестов дот-блоттинга и ИФА (r=0,9159, p<0,0001). При исследовании НАТ к ИНФ-бета в группе № 1 с помощью скрининг-теста положительными оказались 11 из 33 образцов (33,3%). У 7 было выявлено клинически-значимое повышение титра НАТ (>20ЛЕ/мл). Была обнаружена корреляция между титром НАТ и концентрацией САТ, измеренных методом дот-блоттинга (r=0,7909, p=0,0055) и ИФА (r=0,6636, p=0,0306). Все пациенты с титром НАТ, превышающим 20 ЛЕ/мл, были положительны в отношении САТ, измеренных методами ИФА и дот-блоттингом.Важным результатом проведенного исследования было доказательство возможности использования САТ в качестве маркера наличия клинически значимых титров НАТ к препаратам ИНФ-бета. Для оценки частоты формирования связывающих антител к препаратам ЭПО, а также оценки клинической значимости данных антител, было отобрано 37 пациентов, получающих различные типы препаратов ЭПО, а также собраны клинические данные о них. Кроме этого было обследовано 35 доноров крови, не получавших препараты ЭПО и не имеющих аутоиммунных заболеваний (контрольная группа). Все пациенты были разделены на две группы: с нормальным ответом (НОТ) и сниженным ответом (СОТ). В контрольной группы САТ к ЭПО обнаружены не были. Из 37 пациентов у 20 (54,05%) концентрация САТ к ЭПО, измеренная дот-блоттингом, была выше нормы. Была обнаружена обратная корреляция между концентрацией антител к препаратам ЭПО и средним уровнем гемоглобина за 12 месяцев и средним уровнем эритроцитов за 12 месяцев (r=-0,368 , p=0,025и r=-0,336, p=0,042 соответственно). У пациентов группы СОТ концентрация антител к ЭПО была достоверно выше в сравнении с группой НОТ (p=0.0019). Данные, полученные нами, могут указывать на влияние САТ к ЭПО на терапевтическую активность стимулирующих гемопоэз препаратов. Таким образом, все заявленные задачи были выполнены в полном объеме.

 

Публикации

1. Назаров В.Д., Лапин С.В., Мазинг А.В., Евдошенко Е.П., Тотолян А.А. Проблема иммуногенности генно-инженерных лекарственных препаратов интерферона бета Биохимия (Москва), Volume 81, Issue 11, Pages 1396-1400 (год публикации - 2016).

2. Назаров В.Д., Лапин С.В., Суркова Е.А., Макшаков Г.С., Мазинг А.В., Евдошенко Е.П. Методы определения связывающих и нейтрализующих антител к препаратам интерферона-бета Клиническая лабораторная диагностика, Т.61, №10, С.710-714. (год публикации - 2016).

3. Первакова М.Ю., Эмануэль В.Л., Титова О.Н., Лапин С.В., Мазуров В.И., Беляева И.Б., Чудинов А.Л., Блинова Т.В., Суркова Е.А. The Diagnostic Value of Alpha-1-Antitrypsin Phenotype in Patients with Granulomatosis with Polyangiitis InternationalJournalofRheumatology, Volume 2016, Article ID 7831410, 5 pages (год публикации - 2016).

4. Самойлович М.П., Грязева И.В., Мазинг А.В., Лапин С.В., Климович В.Б. Иммунометрический метод определения концентраций свободных легких цепей иммуноглобулинов человека Медицинская иммунология, Т.18, № 4, C. 385-394 (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Биологические лекарственные средства (БЛС) представляют собой фармакологическую субстанцию, которая синтезируется с помощью генно-инженерных технологий или выделяется из биологических источников. Одним из главных достижений современной фармакологии было создание в 1977 году гибридомной технологии для синтеза моноклональных антител (МКА). Так, МКА представляют собой нативную или измененную молекулу иммуноглобулина, которая способна высокоспецифично связываться с целевым антигеном. Данное взаимодействие приводит к ингибированию функциональной активности связанной молекулы или ускорению ее клиренса. Кроме этого, при нахождении таргетной молекулы на поверхности клетки ее связывание с МКА приводит к активации ряда цитотоксических механизмов. Данный вид БЛС называют антагонистическими. Как и любая другая форма БЛС, МКА способны вызывать нежелательный иммунный ответ направленный против собственных структурных элементов, либо против других белков организма пациента. Данный феномен называется иммуногенностью и чаще всего проявляется синтезом антител к БЛС. В зависимости от времени появления, типа паратопа и детектирующей тест-системы все антитела делят на две группы: связывающиеся антитела (САТ) и нейтрализующие антитела (НАТ). Антитела могут изменять скорости клиренса и снижать активность химерных и гуманизированных моноклонольных иммуноглобулинов, блокирующих действие фактора некроза опухоли альфа (анти-ФНОа) и рецептор IL-6 (анти-IL-6R). В ходе выполнения проекта была стандартизирована и валидирована платформа детекции нейтрализующих антител к инфликсимабу, адалимумабу и тоцилизумабу, в основе которой лежит репортерная биопрепарат-чувствительная генно-модифицированная клеточная линия HEK-293 (HEK-Blue™ IL-6 и HEK-Blue™ TNF-a). Кроме этого, был создан протокол культивирования, а также протокол валидации с уточнением целевых аналитических и клинико-диагностических параметров. При оценке внутрилабораторной прецизионности тест показал высокую внутрилабораторную воспроизводимость, при анализе в одной лаборатории одной и той же пробы с полным повторением процедуры приготовления. Коэффициент вариации CV% ни в одной серии измерений не превысил критического для иммунометрических тестов порога в 15%. Наблюдалась высокая зависимость между концентрацией НАТ к анти-ФНОа и к анти-IL-6R и уровнем поглощения сигнала. Коэффициент R2 5 серий по 10 разведений одного образца составляет 0,99. У доноров и пациентов с антителами к ТПО, дсДНК и гладкой мускулатуре сыворотки не увеличивали активность цитокинов с 10 ЛЕ/мл до 100 МЕ/мл (отрицательны на НАТ). В положительных образцах был рассчитан титр НАТ к анти-ФНОа и анти-IL-6R, который составил 1:556 и 1:632 соответственно. В соответствие с полученными данными нормой считался титр НАТ менее 10 МЕ/мл. При титре НАТ более 10 МЕ/мл подтверждалось наличие нейтрализующей активности сыворотки. С увеличением концентрации растворенного препарата люминесценция падала, что указывало на эффективное подавление связывания НАТ и ,следовательно, на специфическое связывание НАТ. Распространённость НАТ к МКА в последней точке забора крови составила в группе 1 - 53.2%, в группе 2 - 4%, в группе 3 - 42,8%, в группе 4 – 50%. . Была отмечена прямая зависимость между временем терапии моноклональными антителами и увеличением титра НАТ. Нами было показано, что ускоренно увеличение концентрации НАТ к анти-ФНО-альфа препаратам зависит от уровня воспалительной активности, уровня DAS28 при начале терапии. В группах пациентов 1-4 была проведено исследование влияния НАТ на клинические показатели и ответ на проводимую терапию. В группе 1 была обнаружена прямая корреляция уровня DAS28 в последней точке с титром НАТ (r=0.3267, p=0.045) и обратная корреляция с изменением DAS28 с течением терапии (r=0.2451, p=0,034). Отсутствие корреляции концентрации САТ к инфликисмабу с клиническими показателями возможно объясняется наличием в структуре белка ксеногенных эпитопов, к которым синтезируется неблокирующие антител. В группе 2 количество положительных на САТ и НАТ пациентов не дало возможности провести развернутый статистический анализ. В группе 3 была также обнаружена корреляция между уровня DAS28 в последней точке с титром НАТ (r=0.466, p=0.0355) и обратная корреляция с изменением DAS28 с течением терапии (r=0.451, p=0,034). Помимо этого нами был проведен сравнительный анализ распространенности связывающих антител к ингибиторам ФНО-альфа и сывороточной концентрации препарата в группе с хорошим ответом на терапию и в группе с плохой переносимостью На 24 неделе терапии в группе пациентов 1 и 4 распространенность САТ составила 45%, через 72 недели - 52,5%, что соответствует международным данным, а также ранее полученным нами данным об увеличении доли серопозитивных пациентов с течением терапии. Был обнаружен высокий уровень прямой корреляции между временем терапии и концентрацией САТ. Кроме этого, была обнаружена статистически значимая разница уровня DAS28 в последней временной точке между группами с концентрацией инфликсимаба более 3 мкг/мл и менее 3 мкг/мл (р=0.047). Только у двух пациентов на 72 неделе терапии был обнаружен значимый титр САТ к адалимумабу в группе 2. Нужно отметить, что в среднем у 60% пациентов был обнаружен адалимумаб в сыворотке крови в последующих временных точках. Также была обнаружена статистически значимая разница уровня DAS28 в последней временной точке между группами с концентрацией адалимумаба более 3 мкг/мл и менее 3 мкг/мл (р=0.002). На 24 неделе терапии распространенность САТ к тоцилизумабу в группе 3 составила 20%, через 72 недели - 58%. Данная группа пациентов дополнительно была разделена на две подгруппы: с хорошим ответом на терапию (DAS28 менее 2.8 после 1 года терапии) и с плохим ответом на терапию (DAS28 более 2.8 после 1 года терапии). Концентрация САТ к тоцилизумабу в двух этих группах статистически значимо различалась, что может свидетельствовать о влиянии САТ на эффект от терапии. Кроме этого, была обнаружено прямая корреляция концентрации САТ в последней временной точке и уровнем DAS28 (r=0.5653, p=0.00014), а также обратная корреляция с изменением уровня DAS28 (DAS28 до начала терапии, DS28 в последней точке) (r=-0.4713, p=0.0423). Был обнаружен высокий уровень прямой корреляции между временем терапии и концентрацией САТ. Полученные данные указывают на важность контроля сывороточного уровня МКА в связи с возможностью повышенного клиренса препарата, что может быть связано с синтезом САТ. Отсутствие значимой разницы между концентрацией САТ в подгруппах с высоким уровнем DAS28 и низким уровнем DAS28 может быть объяснено гетерогенностью исследуемой группы. Нами было проведено исследование взаимосвязи связывающих и нейтрализующих антител к МКА. Была обнаружена высокая прямая корреляция между концентрацией САТ к инфликсимабу и титром НАТ к инфликсимабу (r=0.9321, p=0.000015). Кроме этого, было показано, что у всех пациентов, положительных на САТ обнаруживался клинически значимый титр НАТ. В группе 2 у 2-ух одних и тех же пациентов был обнаружен клинически значимый титр НАТ и САТ. В группе 3 была также обнаружена корреляция концентрации САТ и НАТ (r=0.932, p=0.000034). Нами было показано, что связывающие и нейтрализующие антитела вносят значимый вклад в развитие вторичной резистентности к МКА. Было проведено исследование влияния САТ на терапевтический ответ рЭПО у пациентов с ХБП. Из 100 пациентов с ХБП, получавших препараты рЭПО, у 60 (60%) концентрация антител к рЭПО была выше установленных нормальных значений. Обнаружена статистически значимая обратная корреляция между концентрацией анти-рЭПО и средними уровнями гемоглобина и эритроцитов за 12 месяцев (r=-0,423, p=0,015 и r=-0,321, p=0,002 соответственно), которые являются основными показателями ответа на терапию рЭПО. Таким образом, полученные данные указывают на значительную частоту выявления анти-рЭПО и их ассоциацию со снижением терапевтической эффективности препаратов рЭПО. Таким образом, все завяленные задачи были выполнены.

 

Публикации

1. Назаров В.Д., Лапин С.В., Добронравов В.А., Смирнов К.А., Майер Д.А., Мужецкая Т.А., Тотолян А.А. Циркулирующие антитела к эритропоэтину связаны со снижением эффективности лечения анемии рекомбинантными эритропоэтинами у пациентов на гемодиализе Медицинская иммунология, - (год публикации - 2018).

2. Ткаченко О.Ю., Лапин С.В., Мазинг А.В., Лазарева Н.М., Шмонин А.А,, Соловьева Л.Н., Бондарева Е.А., Сельков С.А., Чепанов С.В., Тотолян А.А. Сравнительный анализ иммунологических методов детекции антифосфолипидных антител Клиническая лабораторная диагностика, 62(1),2017, 40-44 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) представляют собой хронические, рецидивирующие, идиопатические расстройства желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). При этом БК характеризуется иммунным, трансмуральным, сегментарным, гранулематозным воспалением ЖКТ различной протяженности от полости рта до анального отверстия, с развитием местных и системных осложнений, а ЯК - поражением только толстой кишки с обязательным вовлечением прямой, и воспаление при этом чаще всего ограничивается слизистой оболочкой кишечника и носит диффузный характер. На данный момент наиболее эффективным подходом лечения воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) является применение различных форм моноклональных антител (МКА). Как и к другим генно-инженерным биологическим к препаратам МКА образовываются антитела, которые могут влиять на их терапевтическую активность. В ходе выполнения исследования был собран биобанк материалов 100 пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, проходящих терапию анти-ФНО-альфа препаратами (инфликсимаб, тоцилизумаб), в который входят образцы кала, сыворотка, цельная кровь, а также образцы биопсийного материала. Хранение и идентификация образцов проводилась в соответствие с международными рекомендациями. У всех пациентов в течение 1,5 лет терапии ГИБП раз в полгода производился забор сыворотки крови непосредственно перед следующим введением препарата (точки 0-2,5). Производился сбор следующих клинических и лабораторных данных: уровень CDAI при начале терапии ГИБП и при последнем осмотре, изменение уровня CDAI (CDAI при первичном осмотре, CDAI при последнем осмотре), уровень C-реактивного белка, лейкоцитов, тромбоцитов, кальпротектина, циркулирующих иммунных комплексов при последнем осмотре, анти-флагеллиновые, анти-гликановые, ASCA-антитела, АНЦА, антитела к ацинарным клеткам, анти-GP2, анти-CUZD1, антитела к бокаловидным клеткам и энтероцитам. Кроме этого, была исследована концентрация ФНО-альфа с использванием метода ИФА. В зависимости от получаемого препарата все пациенты были разделены на следующие подгруппы: пациенты, принимающие инфликсимаб (П-ИНФЛ) n=50; пациенты, принимающие адалимумаб (П-АДА) n=50. Кроме этого, в исследовании участвовали 81 пациентов с подтвержденным диагнозом ревматоидного артрита, принимающие ГИБП более 1 года. У всех пациентов в течение 2,5 лет терапии ГИБП раз в полгода производился забор сыворотки крови непосредственно перед следующим введением препарата (точки 0-2,5). Кроме этого, производился сбор следующих клинических и лабораторных данных: уровень DAS28 при начале терапии ГИБП и при последнем осмотре, изменение уровня DAS28 (DAS28 при первичном осмотре, DAS28 при последнем осмотре), уровень C-реактивного белка, лейкоцитов, тромбоцитов, ревматоидного фактора и циркулирующих иммунных комплексов при последнем осмотре. В данной работе распространенность антител к ИНФЛ у пациентов с болезнью крона и язвенным колитом на 24 неделе терапии составила 35%, а на 72 неделе – 67%. У пациентов в группе П-АДА антитела на 24 и 72 неделе не определялись. У пациентов в группе П-ТОЦ распространённость антител в последней точке исследования составила 70,5%. Распространённость клинически значимого титра ИНФЛ наблюдалось в исследуемых точках у 80% в точке 0.5, у 73% в точке 1, у 65% в точке 1.5, у 62% в точке 2. Полученные данные сопоставимы с результатами исследований ряда авторов. Такая высокая распространённость антител к ИНФЛ объясняется химерностью белковой молекулы и наличием мышиного ксеногенного участка, который ответственен за повышение уровня иммуногенности препарата. Так, у пациентов, получавших полностью гуманизированный препарат АДА, антитела не определялись, что, также, сопоставимо с рядом зарубежных работ. У всех пациентов во всех исследованных группах концентрация ГИБП и концентрация антител к препаратам не определялись в точке 0. Для подтверждения специфичности связывания антител с ГИБП была проведена реакция нейтрализации. Высокие концентрации ГИБП (100 мкг/мл), инкубированные с положительными образцами, вызывали связывание антител с препаратами, что в свою очередь вызывало ингибирование хромогенной реакции при проведении ИФА. С увеличением концентрации ГИБП уменьшалась активность хромогенной реакции и при максимальной концентрации полностью отсутствовала. В группе ИНФ-П была обнаружена прямая корреляция уровня анти-ИНФ-антител с уровнем CDAI в последней точке исследования (r=0.3326, p=0,0256) и с уровнем лейкоцитов (r=0.2983, p=0,0465) . Также была показана обратная корреляция уровня анти-ИНФ-антител в последней точке и концентрации ИНФ в последней точке (r= -0.4732, p=0,0009). Со всеми остальными показателями статистически значимой корреляции уровня анти-ИНФ-антител получено не было. Дополнительно, была обнаружена обратная корреляция между уровнем ИНФ в последней точке и CDAI в последней точке исследования (r= -0.2997, p=0,0455), уровнем СРБ (r= -0.3477, p=0,0207) и уровнем лейкоцитов (r= -0.3356, p=0,0242). Со всем остальными показателями статистически значимой корреляции анти-ИНФ-антител получено не было. Была показана прямая корреляция между концентрацией препарата и концентрацией антител АНЦА (r=0.454, p=0.003), а также обратная корреляция между концентрацией антител к МКА и АНЦА-антителами (r=-0.356, p=0.002). Кроме этого, было показано, что пациенты положительные на ASCA-антитела хуже отвечали на проводимую терапию даже при присутствии высоких титров препарата в крови. Нами не была показана статистически значимая корреляция между концентрацией препарата, концентрацией антител к препарату и анти-флагеллиновыми, анти-гликановыми, анти-GP2, анти-CUZD1 антителами, а также антителами к ацинарным клеткам, бокаловидным клеткам и энтероцитам. Дополнительно, было показано, что концентрация ФНО-альфа в сыворотке не коррелировала с уровнем ИНФ и антител к ИНФ. В группе ТОЦ-П была обнаружена прямая корреляция уровня анти-ТОЦ с уровнем DAS28 в последней точке исследования (r=0.5653, p=0,0180) и с уровнем лейкоцитов (r=0.6720, p=0,0031), а также обратная корреляция уровня ТОЦ в последней точке исследования и уровня СРБ (r= -0.6417, p=0,0055). Была также показана обратная корреляция среднего уровня ТОЦ за все время исследования и уровнем DAS28 в последней точке (r= -0.701, p=0,0017) и уровнем СРБ (r= -0.6548, p=0,0043). Со всем остальными показателями статистически значимой корреляции уровня анти-ТОЦ и ТОЦ получено не было. Связи между дозой вводимого препарата и уровнем синтезирующихся антител к ИНФ и ТОЦ обнаружено не было. Кроме этого, не было обнаружено разницы между уровнем антител к ИНФ и ТОЦ, концентрации ТОЦ и ИНФ у пациентов, находящихся на монотерапии ГИБП и комбинированной с метотрексатом терапии. В данной работе была показана обратная зависимость между уровнем ИНФЛ и концентрацией анти-ИНФЛ-антител (r= -0.4732, p=0.0009), что полностью соответствует парадигме выявления данных биомаркеров, а также ряду международных исследований. Нужно отметить, что в данном исследовании не была показана связь между сывороточным уровнем ТОЦ и анти-ТОЦ антителами, что, возможно, объясняется другим подходом выявления антител к ТОЦ. С первых клинических исследований ГИБП было обнаружено, что 30-40% пациентов резистентны к проводимой терапии с самого начала. Данные больные имеют так называемую первичную резистентность (ПР), при которой ответ на лечение ГИБП не наблюдался непосредственно после начала терапии в течение первых 12 недель. Со временем лечения у пациентов может развиваться так называемая вторичная резистентность к проводимой терапии. Вторичной резистентностью (ВР) называют снижение терапевтической активности препарата, что ведет к рецидиву и ухудшению течения заболевания и возникает после первичного периода хорошо клинического ответа. Нужно отметить, что ВР наблюдается в среднем у 30% пациентов, длительно получающих ГИБП, и, кроме этого, коррелирует с длительность проводимого лечения. Развитие ВР объясняют снижением сывороточной концентрации ГИБП в связи с усиленной деградацией белковой молекулы ретикулоэндотелиальной системой, а также в связи с иммуногенностью препарата. В данном исследовании было убедительно показано, что антитела к ТОЦ и антитела к ИНФ способны снижать клинический ответ проводимой терапии и уменьшать противовоспалительные характеристики препарата. Также было показано, что концентрация препарата ТОЦ и ИНФ, которая остается в сыворотке пациента непосредственно перед следующей инъекцией, является одним из маркеров мониторирования эффективности терапии. В ходе наших исследований были получены данные о клинической значимости концентрации антител к МКА у пациентов с ВЗК. Полученные данные указывают на значительное влияние сывороточного уровня ТОЦ и ИНФ, а также концентрации антител к этим препаратам на терапевтический эффект проводимой терапии РА и ВЗК. На основе полученных данных можно говорить о важности двухстадийного лабораторного подхода с определением концентрации МКА и антител к МКА при разувающейся резистентности к проводимой терапии. Мониторирование концентрации данных биомаркеров позволяет не только персонализировать подходы к лечению хронических пациентов, но и избежать рецидивов и прогрессии данных заболеваний и характеризовать причины резистентности к данным ГИБП.

 

Публикации

1. - Найдена причина бесполезности дорогих лекарств от заболеваний иммунной системы Индикатор — информационно-сервисный портал, посвященный науке, - (год публикации - ).

2. Потапенко В.Г., Первакова М.Ю., Лапин С.В., Титов А.К., Суркова Е.А., Петрова Н.Н., Черноокая Н.Ю., Миронова О.П., Потихонова Н.А., Узденова Е.И., Афанасьев Б.В. Роль фракционного анализа ферритина в диагностике вторичного гемофагоцитарного синдрома. Клиническая лаборатрная диагностика, № 1, Т. 63, С. 21-27 (год публикации - 2018).

3. Ткаченко О.Ю. Лапин С.В., Шмонин А.А., Соловьева Л.Н., Бондарева Е.А., Сельков С.А., Чепанов С.В., Тотолян Арег А., Роггенбук Дирк Анализ спектра антифосфолипидных антител у пациентов с тромбозами и привычным невынашиванием беременности. Медицинская иммунология, №5,Т. 20, С.753-762 (год публикации - 2018).


Возможность практического использования результатов
не указано