КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 16-15-00242

НазваниеФотоактивные ионные каналы для оптогенетики

РуководительБюльдт Георг , Доктор физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2016 г. - 2018 г.

Конкурс№11 - Конкурс 2015 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-106 - Нейробиология

Ключевые словаоптогенетический контроль, нейрообиология, светоактивируемые мембранные белки, оптическая спектроскопия, структурная биология мембранных белков, экспресcия белка, кристаллизация мембранных белков, рентгеновская кристаллография, компьютерное моделирование мембранных белков

Код ГРНТИ34.15.43

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Одним из важнейших технологических достижений для решения проблем современной нейробиологии является разработка принципа управления нервными клетками с помощью света. Этот метод получил название «оптогенетика». Возможность изучать механизмы процессов в нейрональных сетях и влиять на них создает задел для новых подходов к лечению различных нейродегенеративных заболеваний открывает новые возможности для изучения механизмов сложных процессов в нейрональных сетях, каких как обучение и моторная функции. В связи с появлением оптогенетики научным сообществом ожидаются принципиально новые подходы к восстановлению функции нейронов нарушенной при слепоте и глухоте, дегенерации мозга, к лечению различных других неврологических и психических расстройств, а так же к управлению поведением животных. Это область междисциплинарных исследований: здесь объединены электрофизиология, структурная биология, оптическая спектроскопия, электроника, генная и белковая инженерия (A history of optogenetics: the development of tools for controlling brain circuits with light. Edward S. Boyden. Biology Reports, 3:11. 2011). Оптогенетика позволяет в реальном времени вызывать и контролировать де-/ре-поляризацию мембран нейронов и других клеток с помощью фотоактивируемых белков, которые изменяют мембранный потенциал или вызывают внутриклеточные сигналы. Основные инструменты оптогенетики — это светочувствительные ретинальсодержащие мембранные белки, вставленные в клеточную мембрану нейронов, например посредством экспрессии с заданной локализацией. К сожалению, в настоящее время известно лишь несколько ретинальных белков пригодных для оптогенетики. К ним относятся: канальный родопсин 2 из Chlamydomonas reinhardtii (ChR2) - это неспецефичный катионный канал, который способен активировать нейроны при освещении голубым светом; галородопсин из Natronomonas pharaonis (NphR) - Cl- насос осуществляющий деактивацию нейронов с помощью желтого света и археородопсин из Halorubrum sodomense (Arch3) - H+ насос, вызывающий угнетение нейронов при желто-зелёном освещении. Так же используются H+ насос Mac из Leptosphaeria maculans и Jaws (Сruxhalorhodopsin) - Cl- насос из Haloarcula salinarum (Microbial rhodopsins in the spotlight. Christian Bamann, Georg Nagel and Ernst Bamberg. Current Opinion in Neurobiology 20:610–616. 2010). Важным аспектом для будущего прогресса является выявление и/или проектирование новых светочувствительных белков транспортёров ионов и каналов с новыми свойствами. Для развития методов оптогенетики необходимы каналы и ионные помпы с высокой селективностью и проводимостью для определённых ионов. Так ионы Na+, Ca2+, важны для функционирования нейронов, но соответствующих оптогенетических инструментов для них не существует. Так же для нужд оптогенетики крайне желателен селективный канал и помпа для К+, который является основным ионом для реполяризации и гипперполяризации нейронов (Recent advances in engineering microbial rhodopsins for optogenetics. R. Scott McIsaac et al. Current Opinion in Structural Biology. 33:8–15. 2015). Попытки изменить катионную селективность ChR2 имели ограниченный успех (Channelrhodopsin unchained: Structure and mechanism of a light-gated cation channel. Víctor A. Lórenz-Fonfría, Joachim Heberle. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Bioenergetics. Volume 1837, Issue 5, May 2014). Проводимость иона натрия составляет максимум 2x10^4 ионов/сек. ChR2 является одним из наименее эффективных каналов, несмотря на широкое использование в оптогенетике. Одной из причин ограниченности успеха является то, что молекулярный механизм прохода иона через пору, образованную аминокислотными остатками ChR2, недостаточно изучен. В настоящий момент известна лишь структура химерного ионного канала образованного пятью трансмембранными спиралями канального родопсина 1 и двумя канального родопсина 2 (С1С2, структура 3ug9 в PDB.org, Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Kato H. et al. Nature. 22;482(7385):369-74. Jan 2012). Нашей целью является изучение межатомных взаимодействий иона и аминокислотных остатков ионного канала и его мутантов с использованием методов структурной биологии и молекулярного моделирования. С помощью этих методов можно понять, как повлиять на селективность процесса и получить знание того, какие мутации нужны для придания каналу строгой ионной селективности. Важной задачей на этом пути является получение структуры высокого разрешения нативного ChR2, его промежуточных состояний ChR2 и его катион-селективных мутантов.

Ожидаемые результаты
Основными ожидаемыми результатами данного проекта являются: новые оптогенетические молекулярные инструменты (фотоактивируемые трансмембранные белки), на основе канального родопсина 2. Будут получены данные о структуре канального родопсина 2, как результат его микробиологического синтеза, выделения и очистки, кристаллизации в липидной кубической фазе, получения дифрагирующих кристаллов и реконструкции структуры атомарного разрешения: - будут собраны генно-инженерные векторы для экспрессии мутантов ChR2 - будет синтезировано не менее 3-ёх мутантов канального родописна 2 с изменёнными характеристиками проводимости и селективности (E90А, C128T, C128A, C128S, D156A) с большим потенциалом для оптогенетики. - будут подготовлены препараты мутантов ChR2 чистоты достаточной для дальнейших исследований и кристаллизации - будут получены экспериментальные данные характеризующие мутанты ChR2, в частности электрофизиологические эксперименты с экспозицией белков встроенных в липидные мембраны клеток и искусственные липидные системы (мицеллы, липосомы, нанодиски) электромагнитным излучением определённой длины волны - будет проведена оптимизация условий кристаллизации мутантов ChR2 - с помощью полученых кристаллов будут получены структуры атомарного разрешения мутантов ChR2. Согласно предварительным данным мутации C128A, C128S, D156A приводят к агрегации белка при его выделении и очистке, поэтому их кристаллизация затруднена и получение структур атомарного разрешения представляется сложной задачей. Но информация о структуре ионных каналов с данными мутациям весьма ценна для понимания молекулярных механизмов ионной проводимости, поэтому, не смотря на трудности, будет сделано всё возможное для получения структурной информации - будут исследованы конформационные изменения в этих белках методами нейтронного/рентгеновского малоуглового рассеяния (SAXS/SANS), а также спектроскопией с разрешением по времени - на основе структурных данных ChR2 и полученных структур его мутантов будет проведён дальнейший анализ возможных мутаций, с целью придания ионному каналу других свойств селективности и проводимости. - методами компьютерного моделирования будет проведён анализ возможных мутаций с целью изменения проводимости и селективности других ионных каналах и ионных траспортёрах, а именно бактериородопсина (bR), галородопсина (NphR), ксенородопсина (XeR) из Candidatus Nanosalina sp. J07AB43, археародопсина (ArCH3) и натриевого насоса KR2 из Krokinobakter eikastus и др. Описанные результаты исследований, в долгосрочной перспективе послужат основой для создания новых терапевтических подходов к лечению различных заболеваний связанных с дисфункцией нейронных тканей. Мы ожидаем, что в среднесрочной перспективе описанные результаты приведут к значительному прогрессу в понимании механизмов функционирования сетей образованных нейронами, в конструировании таких сетей, управлению ими, их обучении (Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Jacob G. Bernstein and Edward S. Boyden. Cell Press. Trends in Cognitive Sciences, Vol. 15, No. 12. December 2011). В краткосрочной перспективе результаты заявляемых исследований приведут к детальному пониманию молекулярного механизма работы канального родопсина 2 по транспорту катионов (и анионов в случае мутантов) через плазматическую мембрану клетки. Таким образом, мы ожидаем, что результаты реализации данного проекта будут стратегически важными для прогресса в современной нейробиологии и медицины во всём мире. Маленький выбор белков, подходящих для оптогенетики, создаёт ограничения для раскрытия всего её потенциала. Так, например, на сегодняшний день не существует оптогенетических инструментов для ионов K+ и Ca2+ важных для нейронной функции. Даже самый распространённый инструмент оптогенетики — ChR2, как и его производные, имеет существенные недостатки в том, что ток ионов через канал не селективен и зависит от электрического потенциала на мембране. Для развития методов оптогенетики необходимы новые селективные светочувствительные ионные каналы и транспортёры лишённые этих недостатков. Нехватка структурной и функциональной информации о различных фотоактивируемых белках пока не позволяет рационально конструировать их мутанты. До недавнего открытия родопсинов, светозависимых селективных транспортёров иона натрия (A light-driven sodium ion pump in marine bacteria. Keiichi Inoue. Nature Communications. 4, Article number: 1678. 2013), были известны только протонные и анионные насосы. Таким образом, структура и принципы работы катионного насоса не были ясны. Совсем недавно мы получили структуру фотоактивируемого натриевого канала KR2 с разрешением 2.2 Ангстрема (Crystal structure of a light-driven sodium pump. Ivan Gushchin et al. Nature Structural & Molecular Biology 22, 390–395. 2015). Эта структура существенно отличается от ранее опубликованных структур других ретинальных белков. Белок существует в виде пентамера, и структура высокого разрешения позволяет с помощью методов молекулярного моделирования проследить путь перемещения иона, на котором идентифицируются полость забора иона, открывающаяся на поверхность белка; гидрофобный барьер, предотвращающий свободную диффузию ионов в отсутствии света; карман связывания ретиналя и группа аминокислот, высвобождающая ион на поверхность белка. Структура позволяет предсказать путь транспорта иона и открывает возможность рационального дизайна катионных насосов с желаемыми свойствами для целей оптогенетического контроля. Чтобы проектировать белки с заданной селективностью для нужд оптогенетического контроля, нужно иметь подходящую исходную структуру белка и в этом году она появилась. В настоящий момент исследования по данной теме активно ведутся за рубежом. Например, самые последние обзоры отмечают важность создания новых мутантов ChR2 - Recent advances in engineering microbial rhodopsins for optogenetics. R. Scott McIsaac et al. Current Opinion in Structural Biology. 33:8–15. 2015. Конкуренция в данной области исследований чрезвычайно высокая: только за последний год двумя независимыми научным группами была создана серия мутантов ChR2 с изменёнными параметрами селективности и времени нахождения в открытом состоянии. Так же результаты поиска самых свежих научных публикаций за 2015-ый год показывают, что созданы ещё несколько мутантов фотоактивируемого ChR2 с изменёнными оптическими характеристиками, например (Expanding the optogenetics toolkit. A naturally occurring channel for inhibitory optogenetics is discovered. Andre Berndt and Karl Deisseroth. Science. Vol 349, issue 6248. 7 august 2015), и каналов вообще, например лиганд-активируемых (A change in the ion selectivity of ligand-gated ion channels provides a mechanism to switch behavior. Jennifer K. Pirri et al. PLOS Biology. September 8, 2015). Данные факты свидетельствуют об актуальности нашего проекта для оптогенетики. Отметим, что детальные экспериментальные данные о структуре перспективных мутантов в научных публикациях не приводятся, а результаты молекулярного моделирования и иллюстрации в публикациях основаны на известной структуре химерного белка С1С2, а не нативного ChR2. Этот факт является существенным недостатком существующих на настоящее время исследований, который мы планируем исправить в предлагаемом проекте. Коллектив исполнителей, обладающий уникальным опытом в области структурной биологии ретинальных белков, имеет все шансы достичь успеха и внести существенный вклад в развитие оптогенетики. Мы считаем данный проект чрезвычайно актуальным для сегодняшнего дня оптогенетики.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---