Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Противовирусная терапия существует уже более 60 лет. За это время было создано более 90 лекарственных препаратов, применяемых для лечения 9 инфекционных вирусных заболеваний (ВИЧ, гепатит С, гепатит B, грипп, герпес, папиллома, респираторная синцитиальная инфекция, цитомегаловирусная инфекция, ветряная оспа). В то же время количество молекул, противовирусная активность которых хотя бы однажды исследовалась, в тысячи раз больше, что позволяет проводить анализ этого «противовирусного пространства» и поиск в нём соединений, перспективных для дальнейшего исследования, особенно в отношении малоизученных вирусных заболеваний. Данные о биологической активности соединений могут быть извлечены из научной литературы или из специальных баз данных (БД) биологической активности. Одна из крупнейших БД, находящаяся в свободном доступе, ChEMBL, поддерживается Европейским институтом биоинформатики. В ней собрана информация о биологических испытаниях более 1,5 млн соединений, преимущественно извлечённая автоматически из научной литературы и результатов высокопроизводительного скрининга в базе данных PubChem BioAssay. Автоматическое извлечение данных приводит к неточностям и потере аннотаций и структур. Неполные и некорректные аннотации по организмам и мишеням действия осложняют поиск соединений и анализ зависимости «структура — активность». В ходе выполнения проекта проведён подробный анализ информации, содержащейся в ChEMBL, её систематизация и унификация. Итогом этой работы стала база данных ViralChEMBL, содержащая информацию о соединениях, для которых хотя бы однажды тестировалась противовирусная активность. Таких соединений — около 350 тысяч. Для каждого соединения в базе данных приводится стандартизованная структура и информация о результатах биологического тестирования, включающая таксономическое положение вируса (вид согласно стандартной таксономии Международного комитета по таксономии вирусов ICTV), наличие активности (активно/неактивно/не измерено), величину активности в стандартных единицах (обычно мкМ). Для вирусов приводится их полное таксономическое положение и отнесение к классу патогенных для человека. Стандартные средства поиска позволяют осуществлять эффективное извлечение и структурирование информации. Благодаря построению БД ViralChEMBL в ходе выполнения проекта удалось выявить некоторые особенности противовирусного пространства и приступить к его экспериментальному исследованию. Были использованы две основных стратегии. Исследование нуклеозидов в качестве потенциальных ингибиторов репродукции вируса клещевого энцефалита и энтеровирусов может быть рассмотрено как более глубокое изучение хорошо исследованного класса соединений, в то время как для абсолютно новых соединений предложен подход, основанный на параллельном изучении противовирусной активности в отношении структурно и генетически разнообразных вирусов. Аналоги нуклеозидов – известные противовирусные средства. Многочисленные аналоги нуклеозидов изучались в отношении в основном трёх вирусов: ВИЧ, вируса гепатита С, вируса гриппа А. В то же время химическое пространство нуклеозидных ингибиторов флави- и энтеровирусов изучено мало. В отношении флавивирусов изучены в основном 2'-С-замещённые аналоги нуклеозидов; особенно активны 2'-С-этиниладенозин и 7-деаза-2'-С-метиладенозин. Для энтеровирусов ранее было показано ингибирование репродукции в присутствии N6-бензиладенозина. N6-Бензиладенозин также оказался эффективным ингибитором вирусов Ласса и Марбург, таким образом демонстрируя широкий спектр противовирусной активности. Мы изучили спектр активности N6- замещённых аденозинов, 3'-С-замещённых нуклеозидов, а также N2-замещенных гуанозинов и N4-замещённых цитидинов по отношению к репродукции вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), энтеровируса А71 (ЭВ-А71), коксакивируса В1, полиовируса типа 1. Было обнаружено, что только N6-замещённые аденозины проявляют противовирусную активность в отношении ВКЭ либо ЭВ-А71, однако коксакивирус В1 и полиовирус нечувствительны к действию этих соединений. Для ВКЭ были изучены методом докинга возможные молекулярные мишени действия обнаруженных соединений — метилтрансферазный и полимеразный домены белка NS5; показано, что взимодействие с ними принципиально возможно, однако нельзя исключить также действие соединений на стадии проникновения вируса в клетку. В тех случаях, когда данных о противовирусной активности аналогов исследуемого соединения нет, необходимо максимально эффективно распределять ресурсы и в то же время стремиться к увеличению шансов на успех скрининга противовирусной активности. Одним из способов решения этой проблемы является определение противовирусной активности небольших серий соединений в отношении вирусов, различающихся устройством генома, механизмами репликации и структурой. В качестве таких типичных представителей разных групп по классификации Балтимора были выбраны вирус клещевого энцефалита (оболочечный вирус с одноцепочечной РНК положительной полярности), энтеровирусы (необолочечные вирусы с одноцепочечной РНК положительной полярности), хантавирус Пуумала (оболочечный вирус с сегментированной РНК отрицательной полярности), аденовирус С5 (необолочечный вирус с двуцепочечной ДНК). Тестирование противовирусной активности в небольших сериях низкомолекулярных соединений позволяет приоритизировать серии в целом и находить для них предварительные соотношения «структура — активность». Применив этот подход, мы идентифицировали новый класс противовирусных соединений — оксаспирододеканы, эффективно и селективно подавляющие репродукцию аденовирусов.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Описание химического пространства противовирусных соединений, проводимое в рамках настоящего проекта, основано на анализе открытых данных о противовирусной активности, содержащихся в базе данных ChEMBL. В рамках настоящего проекта в 2016 году была создана методика эффективного извлечения и корректной таксономической аннотации данных о противовирусной активности низкомолекулярных соединений из ChEMBL, на основе которой была сформирована база данных ViralChEMBL, содержащая 615 029 записей о противовирусной активности 263 093 соединений. В 2017 году база данных ViralChEMBL была проанализирована методами визуализации химического пространства — самоорганизующихся карт Кохонена, анализа главных компонент, графов Rubber Band Scaling. Выявлены наиболее исследованные соединения и вирусы, показано, что значительная доля информации относится к вирусам иммунодефицита человека, гепатита C и гриппа, в то время как для большинства других вирусов число записей о противовирусной активности не превышает нескольких тысяч. Как минимум 20 активных соединений известны лишь для 65 видов вирусов; в отношении этих вирусов определена активность 255 955 соединений. При анализе противовирусного химического пространства, спроецированного на самоорганизующуюся карту Кохонена, были выявлены кластеры соединений, для которых доступна информация о противовирусной активности против представителей отдельных семейств. Такие кластеры подобных структур соответствуют сериям соединений, систематически изучавшихся в рамках программ по разработке противовирусных препаратов, преимущественно против ВИЧ, гепатита С и гриппа. Соединения, для которых изучалась противовирусная активность в отношении представителей различных семейств вирусов, распределены по всей поверхности карты и не формируют отдельных кластеров, что свидетельствует о несистематическом изучении спектра активности. Ограниченность этой информации затрудняет рациональный дизайн противовирусных препаратов широкого спектра действия и подчёркивает необходимость масштабного изучения спектра активности новых соединений. На основе экспериментальных данных ViralChEMBL (4051 соединение) и собственных экспериментальных данных ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова (588 соединений, пересечение с ViralChEMBL — 22 соединения) мы разработали способ прогнозирования противофлавивирусной активности, основанный на использовании карт Кохонена. Благодаря исследованию значительного числа соединений в нашей лаборатории стало возможным значительное расширение области применимости метода и химического разнообразия надёжно прогнозируемых соединений. На основе метода осуществлён прогноз противовирусной активности для известных лекарств и коммерчески доступных соединений, который планируется валидировать в 2018 году. Расширение знаний о спектре противовирусной активности нуклеозидов в рамках проекта достигается благодаря систематическому скринингу активности библиотек впервые синтезированных и ранее исследованных соединений в отношении различных вирусов. Например, в базе данных ViralChEMBL доступна информация об активности 2406 соединений против хотя бы одного энтеровируса, однако лишь для 32 соединений одновременно имеется информация об активности против трёх видов рода Enterovirus. В рамках проекта к настоящему времени исследован спектр активности более чем 70 соединений в отношении представителей рода Enterovirus, что значительно обогащает наши представления о возможном спектре активности либо селективности новых противовирусных препаратов. Ключевой для дальнейшего прогнозирования противовирусной активности на основе данных ViralChEMBL является информация не только о видах вируса, против которых проявляет активность соединение, но и о конкретной молекулярной мишени его действия. В то время как для самой базы данных анализ этой информации запланирован на 2018 год, для соединений, идентифицированных в рамках проекта, эту информацию мы получаем на основе метода индуцированных мутаций. В 2017 году нами были реализованы методики выявления устойчивых клонов, возникающих при пассировании вируса клещевого энцефалита и энтеровирусов в присутствии ингибиторов репродукции. Получены устойчивые к действию ингибитора клоны вируса клещевого энцефалита, на основе секвенирования генома которых возможно установление предполагаемой мишени действия ингибиторов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
База данных (БД) ViralChEMBL, содержащая аннотированные по видам вирусов записи о противовирусной активности низкомолекулярных соединений, была создана в 2016-2017 году на основе общедоступных данных ChEMBL и разработанного в ходе выполнения проекта алгоритма идентификации вида вируса в произвольном тексте. Оригинальная версия БД ViralChEMBL была основана на ChEMBL версии 20 (опубл. 2015). Поскольку данные в ChEMBL постоянно добавляются, к 2018 году появилась необходимость обновления БД ViralChEMBL для более корректного отображения современного состояния противовирусного химического пространства. Алгоритмы извлечения и аннотации данных о противовирусной активности были применены к ChEMBL версии 24 (опубл. 2018), что позволило создать обновлённый набор данных, ViralChEMBL 0.2. Этот набор данных лёг в основу прототипа общедоступного веб-интерфейса базы данных о противовирусной активности, который будет расположен по адресу http://viraldb.org. Веб-интерфейс предоставляет базовый функционал доступа к ViralChEMBL 0.2, позволяя извлекать профиль противовирусной активности для конкретного соединения и подобных ему, а также список соединений, активных либо экспериментально исследованных в отношении конкретного таксона вирусов. В 2018 году продемонстрирована возможность эффективного использования данных ViralChEMBL для построения прогностических моделей методами машинного обучения и картирования химического пространства. Были построены модели методами SOM (самоорганизующиеся карты Кохонена) и GTM (генеративное топографическое картирование), позволяющие прогнозировать активность низкомолекулярных соединений в отношении флавивирусов и энтеровирусов. Экспериментальная валидация прогноза путём определения противовирусной активности приоритизированных соединений привела к диаметрально противоположным результатам. Если для флавивирусов доля активных соединений среди отобранных составляет 30-50% в зависимости от метода, для энтеровирусов практически все исследованные соединения оказались неактивными. Активность была обнаружена у описанных ранее соединений, использованных в качестве положительного контроля, поэтому на основании полученных результатов можно выдвинуть предположение о недостаточной изученности противовирусного химического пространства в окрестности известных ингибиторов репродукции энтеровирусов. Для повышения предсказательной способности SOM была разработана её модификация, позволяющая ранжировать соединения в соответствии с значением оценки, зависящей от числа и распределения как активных, так и неактивных соединений в их окружении в координатах SOM. Построенные модели обладают высокой прогностической способностью по результатам валидации методом скользящего контроля. С целью повышения изученности химического пространства ингибиторов репродукции флавивирусов и энтеровирусов нами было проведено экспериментальное исследование противовирусной активности соединений различных классов в отношении типичных представителей указанных родов вирусов. Были исследованы соединения, относящиеся к классам 5-аминоизоксазолов, феноксазиновых нуклеозидов и нуклеозидов с гидрофобными заместителями, всего более 250 соединений. Среди них обнаружены эффективные ингибиторы репродукции вируса клещевого энцефалита и/или энтеровирусов, пригодные для дальнейшей оптимизации структуры при разработке лекарств либо для использования в качестве фармакологических инструментов, селективно действующих на определённые виды вирусов. Впервые проведено систематическое исследование активности более чем 90 аналогов нуклеозидов против энтеровирусов, относящихся к трём наиболее клинически значимым видам — Enterovirus A, Enterovirus B, Enterovirus C. Полученные данные открывают путь к созданию более эффективных и надёжных моделей для прогнозирования противовирусной активности не только за счёт исследования новых классов, но и за счёт обогащения обучающей выборки отрицательными примерами. Недостаток отрицательных примеров в ViralChEMBL является следствием значительного публикационного смещения в область положительных примеров. Для отдельных соединений методом индуцированных мутаций были установлены потенциальные мишени действия. Разработана также схема аннотации данных о противовирусной активности на основе мишени действия, однако при анализе данных ViralChEMBL выявлено, что аннотации, содержащиеся в ChEMBL, чаще всего недостаточны для корректного отнесения мишени. Таким образом, для эффективного анализа мишеней действия противовирусных соединений требуется привлечение внешних данных.