Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В первый год исследований (2016 г.) была сформирована коллекция из 182 образца различного эколого-географического происхождения, представляющих 52 различных вида злаковых являющихся дикорастущими сородичами пшеницы. Проведена верификация образцов коллекции на видовую принадлежность видов Th. bessarabicum, P. spicata, D. villosum и Th. intermedium путём ДНК-баркодинга, подсчёта хромосом и проведения геномной гибридизации in situ. Показано, что не все образцы, полученные из международных коллекций принадлежат к заявленным видам. Показана необходимость обязательной верификации образцов дикорастущих злаков перед включением их в исследовательские работы. В результате анализа репитома пшеницы были выявлены 4 ранее не изученных тандемных повтора, что является перспективным направлением для дальнейших исследований. Разработан алгоритм использования биоинформационного анализа данных полногеномного сиквенирования одного из видов (пшеница) для создания молекулярно-цитогенетических маркеров отдельных хромосом и/или субгеномов родственных ему видов (Th. bessarabicum, Ps. spicata, D. villosum, Th. intermedium). При наличии полногеномных сиквенсов любого из видов, данный подход по подбору и разработке новых цитогенетических маркеров для мало изученных видов значительно дешевле, чем другие алгоритмы по поиску и выявлению новых тандемных повторов. С использованием данного подхода получены новые данные об организации геномов с использованием методов молекулярной цитогенетики на видах Thinopyrum bessarabicum (Jb), Pseudoroegneria spicata (St), Dasypyrum villosum (V) путем использования тандемных повторов, выявленных в результате биоинформационного анализа репитома пшеницы. Проведено полногеномное секвенирование Thinopyrum intermedium, Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria spicata и Dasypyrum villosum, данные которого в дальнейшем будут использованы для анализа репитома этих видов. В результате проведенной апробации молекулярных маркеров PLUG нам удалось выявить полиморфизм между T.aestivum и рядом видов злаков. Фрагменты, характерные для дикорастущих видов могут детектироваться в генетическом бэкграунде мягкой пшеницы с помощью этого типа молекулярных маркеров. Предложен наборы хромосом специфичных PLUG маркеров, способных выявлять генетический материал D.villosum, T.timopheevii, T.boeoticum, Ae.speltoides, Ae.tauschii, T.durum, S.cereale в геноме мягкой пшеницы.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В результате исследований в 2017 году были получены данные о репитоме Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria spicata, Dasypyrum villosum. Показано, что на долю повторяющихся последовательностей в геномах Dasypyrum villosum, Pseudoroegneria spicata, Thinopyrum bessarabicum приходится 74,6%, 66,9%, и 73,4%, соответственно. При этом значительную долю занимают ретроэлементы (около 50%). Наибольшую долю нанимает семейство ретроэлентов Ty3 приходится около 35-40% в зависимости от генома. В этом семействе были выявлены конкретные типы ретроэлементов, такие как Ogre/Tat, chromovirus, Athila, и др. На долю другого представителя ретротранспозонов, Ty1 семейства, приходится значительно меньшая доля 4-8,5%. Здесь выявлены такие элементы, как Angela, Maximus/SIRE, Ale, Tar и др. Показано, что ДНК-транспозоны занимают до 10,5% генома. Сателлитная ДНК занимает от 0,9% генома у D.villosum до 2,4% у P.spicata. Изучены высокопийные кластеры несущие сателлитную ДНК и ретроэлементы. Часть этих повторов была использована в работе по FISH анализу по их локализации на хромосомах изучаемых видов. Выявлены ряд видоспецифичных повторяющихся сиквенсов относящихся как к сателлитной ДНК, так и к ретроэлементам. После проведения анализа и подбора праймеров была показана возможность видоспецифичной амплификации. Получены данные цитогенетического картирования видов Thinopyrum bessarabicum, Pseudoroegneria spicata, Dasypyrum villosum, Thinopyrum intermedium с использованием повторяющихся последовательностей изучаемых видов и созданы их кариотипы. Разработан набор из 12 PLUG маркеров для идентификации хромосом дикорастущих сородичей в геномном окружении пшеницы. (1 маркер на хромосому 1V, 2- на 2V, 1- на 3V, 2- на 4V, 3- на 5V,1- на 6V, 2- на 7V). Показано, что все 12 PLUG маркеров локализованы на тех же гомеологичных группах хромосом D. villosum, что и у T. аestivum. Секвенированы нуклеотидные последовательности генов-ортологов DREB1 у Thinopyrum intermedium, Th. ponticum, Th. bessarabicum, Dasypyrum villosum, Pseudoroegneria spicata. Показана их высокая степень гомологии к генам TaDREB мягкой пшеницы. Нами разработан CAPS маркер P18_FokI, который в большинстве случаев может дифференцировать гены-ортологи DREB1 пшеницы и дикорастущих сородичей. Ген-ортолог DREB1 с помощью P18_FokI и с использованием серии дополненных линий мягкой пшеницы с хромосомами Th. elongatum был локализован на третьей гомеологичной группе Th. elongatum. Анализ 10 пшенично-пырейных гибридов выявил наличие как TaDREB мягкой пшеницы, так и гена-ортолога DREB1 пырея у всех проанализированных образцов. С использованием разработанных нами маркеров Vivip и Vp1BB4_HaeIII специфичных для гена Viviparous дикорастущих сородичей изучена коллекция пшенично-пырейных гибридов. Показана высокая эффективность маркеров для выявления чужеродного хроматина в геномном окружении пшеницы. Благодаря этому изучена коллекция пшенично-пырейных гибридов на устойчивость к предуборочному прорастанию. Показана связь между аллельным состоянием этих генов и устойчивостью образцов к предуборочному прорастанию на корню. Результаты опубликованы в журнале Plos one, входящий в первый квартиль. На основе полиморфизма NTS 5S рДНК создан молекулярный ДНК-маркер, с высокой эффективностью идентифицирующий геномы St, J и V трибы Triticeae. Данный маркер является весьма перспективным инструментом, который может применяться для анализа и верификации образцов создаваемых коллекций видов Triticeae, быстрого скрининга материала для гербариев и депозитариев живых систем (например, депозитарий «Ноев ковчег»), а также в селекционном улучшении пшеницы с привлечением её дикорастущих сородичей.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В результате исследований в 2018 году были получены данные о репитоме Thinopyrum intermedium. Был проведен сравнительный анализ репитома мягкой пшеницы и дикорастущих видов злаков трибы Triticea (Thinopyrum bessarabicum, Pseudorogneria spicata, Dasypirum villosum). Кластеризация сиквенсов Thinopyrum intermedium показала, что на долю повторяющихся последовательностей ДНК приходится около 76%. На долю ретроэлементов в геноме Th. intermedium приходится порядка 50,4%, из них на долю Ty1 семейства 12,2%. Наиболее представленными являются Angela (28,5%), Maximus/SIRE (10,7%), Ale (4,6%), Tar (2,6%). На долю других представителей Ty1 приходится 53,6%. Семейство Ty3 занимает 38,2 %. Наиболее представленными являются Ogre/Tat (25,3%), chromovirus (14,1%), Athila (6,2%). На долю других представителей семейства Ty3 приходится 54,34%. На долю ДНК-транспозонов приходится 10,4%. Наиболее представленным является ДНК-транспозон CMC.EnSpm, как и у предполагаемых диплоидных видов. Сателлитная ДНК составляет 0,92% от общего количества повторяющихся последовательностей. В ходе анализа результатов RepeatExplorer было выявлено 8 кластеров, несущих в себе тандемные повторы. Анализ сиквенсов, входящих в вышеуказанные кластеры показал гомологию к ранее изученным повторам Secale cereale, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Secale vavilovi. При проведении сравнительного анализа репитомов, как по нуклеотидным последовательностям консервативных участков, так и по оценки копийности мобильных элементов или тандемных повторов Thinopyrum intermedium, Thinopyrum bessarabicum, Pseudorogneria spicata, Dasypirum villosum нами было показано, что большинство мобильных элементов у всех геномов находятся примерно на одном уровне копийности. Таким образом можно предположить, что амплификация данных элементов в геноме происходило у общей предковой формы данных геномов (J, V и St). Наиболее существенные отличия были выявлены у генома J Th. bessarabicum (наибольшее содержание повторяющейся ДНК в геноме) – значительное увеличение копийности отдельных мобильных элементов, относящихся к Ty1-Copia. В большинстве случаев мы наблюдали достаточно высокую сходимость копийности МЭ и тандемных повторов у диплоидных видов и аллополиплоида Th. intermedium. Также была проведена разработка молекулярных маркеров для идентификации J, V и St субгеномов, распространённых у ряда пыреев и их сородичей. Предложена система из двух CAPS маркеров. Предложены праймеры для амплификации фрагмента NTS 5’-CGTGTTGCTGCGGTATAGAG-3' и 5’-GTCCCTTATGCTTGCCАCTC-3’. Рестриктаза для первого маркера – SmiMI (сайт рестрикции CAYNN↑NNRTG), для второго маркера – Hpy166II (сайт рестрикции GTN↑NAC). Созданная в ходе представленной работы система CAPS маркеров может послужить в качестве перспективного инструмента для анализа и верификации образцов при создании коллекций представителей трибы Triticeae, скрининга материала при изучении гербариев, а также в селекционном процессе, направленном на улучшение пшеницы путём вовлечения в скрещивания её дикорастущих сородичей. На основании анализа репитомов исследуемых видов, нами были выделены ряд повторяющихся последовательностей с высокой копийностью для генома St. На отобранные повторы были подобранны праймеры и проведено тестирование амплификации методами рутинной ПЦР и количественной ПЦР. В случае положительных результатов по амплификации и уникальности полученных фрагментов (или значительном превышении копийности) по сравнению с другими геномами мы проводили локализацию пробы на хромосомах. Нами были найдены новые тандемные повторы специфичные для генома St. Было показано, что при использовании комбинации новых цитогенетических маркеров CL149, CL178, CL232 и маркеров, найденных нами на предыдущих этапах работы CL1 и CL3, можно идентифицировать все хромосомы, принадлежащие P. spicata. С учетом того, что при амплификации с праймерами на последовательности CL99, CL149, CL178, CL232 наблюдалась достаточно высокая специфичность для генома St, то их можно также использовать в качестве полуколичественных ПЦР-маркеров для идентификации наличия хроматина P. spicata в отдаленных гибридах или интрогрессивных формах. При сравнительном анализе репитомов нами был выявлен уникальный для Dasypyrum villosum (V, 2n=14) повтор CL127 относящийся к классу ДНК транспозонов. У других видов данный МЭ не обнаруживался. При амплификации данного повтора была выявлена высокая специфичность для D. villosum и Th. intermedium. На остальных видах, амплификация практически отсутствовала. При анализе FISH данного ДНК транспозона было выявлено, что он локализуется в субтеломерной части хромосом. Таким образом, можно предположить, что данный ДНК транспозон колонизировал субтеломерную часть хромосом генома V. Как и в случае St генома, праймеры для амплификации CL127 можно использовать в качестве полуколичественного ПЦР-маркера для идентификации наличия хроматина D. villosum в отдаленных гибридах или интрогрессивных формах. На пырее среднем проводилась амплификация и локализация все повторяющихся последовательностей (CL99, CL149, CL178, CL232, CL127), как и на диплоидных донорах его субгенома. Все выявленные на данном этапе работ нами последовательности, так же подходили и для работы с идентификацией хроматина пырея среднего и его субгеномов как методами цитогенетики, так и методами ПЦР. Нами были проведены работы по переводу найденных нами тандемных повторов (CL149, CL178, CL232, CL2 и CL4), которые позволяют идентифицировать хромосомы различных геномов, в флуоресцентные олигонуклеотидные пробы, подходящие для проведения безденатурационной флуоресцентной in situ гибридизации (ND-FISH). Создан набор молекулярных и цитогенетических маркеров для идентификации генетического материала дикорастущих видов злаков трибы Triticea в геноме пшеницы. Получены новые данные по филогении и эволюции геномов видов злаков трибы Triticea, основанные на сравнительном анализе репитомов изучаемых видов и молекулярно-цитогенетического анализа организации их геномов с использованием вновь выявленных высококопийных повторов, включая видоспецифичные. Получены новые данные о возможном происхождении субгеномов аллополиплодного вида Thinopyrum intermedium и участия в его формировании видов Thinopyrum bessarabicum, Pseudorogneria spicata, Dasypirum villosum.