КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 16-16-10010

НазваниеОрганизация генома природно-трансгенных растений Linaria и Nicotiana

РуководительМатвеева Татьяна Валерьевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный университет", г Санкт-Петербург

Года выполнения при поддержке РНФ 2016 - 2018 

КонкурсКонкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые словаприродно-трансгенные растения, горизонтальный перенос генов, Т-ДНК, геномное секвенирование, экспрессиия генов

Код ГРНТИ68.03.03 68.03.07


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В большинстве случаев для получения трансгенных растений прибегают к агробактериальной трансформации. В то же время, в природе было обнаружено несколько родов растений, Nicotiana, Ipomea и Linaria, представители которых уже содержат Т-ДНК в своих геномах и передают ее в ряду поколений. Их называют природно-трансгенными растениями. Последовательность, гомологичная Т-ДНК Ri плазмиды Agrobacterium rhizogenes впервые была обнаружена в геноме "нетрансформированного" Nicotiana glauca около30 лет назад и названа клеточной Т-ДНК (клTДНК). Сходные клT-ДНК были найдены в других видах рода Nicotiana . Эти предполагаемые гомологи древних генов Т-ДНК до сих пор экспрессируются, наводя на мысль о том, что онимогут играть рольв эволюции этих видов. Недавно Т-ДНК была описана у представителей родов Linaria и Ipomea. С применением методов секвенирования нового поколения было показано, что некоторые виды Nicotiana были трансформированы не единожды в эволюции. Другие виды табака не трансгенны. Как обстоят дела с представителями рода Linaria пока не известно.Мы предполагаем, что древние растения, трансформированные A. rhizogenes могли обладать селективным преимуществом по сравнению с родительскими видами в борьбе за существование. Таким образом, инсерция Т-ДНК в геном растений могла повлиять на их эволюцию, приведя к образованию новых видов. Поскольку природно-трансгенные растения существуют в экосистемах миллионы лет, они могут быть хорошей моделью для изучения отсроченных экологических рисков ГМО. Суммируя исследования экологических рисков трансгенных растений, можно прийти к заключению, что основные опасения связаны со следующими проблемами 1) возможная утечка трансгенов за счет переопыления нетрансгенных сортов и близкородственных видов сорных растений трансгенной пыльцой; 2) горизонтальный перенос генов от трансгенных растений почвенным микроорганизмам; 3) влияние инсектицидных белков трансгенных растений на нецелевую фауну; 4) риски повторного горизонтального переноса генов к трансгенным растениям. Наиболее существенными из них являются (1) и (4). Исследования по первому направлению ведутся нами в рамках других проектов. Четвертому направлению посвящена данная заявка. Исследование будет сосредоточено на природной системе, описанной в основопологающей работе Матвеевой и др (2012), а именно, примере горизонтального переноса генов агробактерий в эволюции родов Linaria. Помимо Linaria, в работе будет исследован вид Nicotiana glauca, поскольку его геном еще не секвенирован, тем не менее имеются обширные данные о присутствии в нем природных тансгенов. Работа будет включать применение новых подходов высокопроизводительного геномного (NextGen) секвенирования и анализа экспрессии генов. Мы определим, сколько инсерций Т-ДНК имеет место в геноме Linaria vulgaris и Nicotiana glauca, охарактеризуем каждую инсерцию по длине и составу генов, их функциональности, затем проведем анализ экспрессии растительных генов, регулируемых функциональными агробактериальными онкогенами. К настоящему времени у Linaria vulgaris известен один такой ген (Lv rolC). Этот же ген является наиболее консервативным трансгеном у табака. Планируется изучить взаимосвязь экспрессии rolC с усилением образования активных форм кислорода АФК и вторичных метаболитов. Необходимо отметить, что многие вторичные метаболиты являются составляющей частью врожденного конститутивного иммунитета, активируясь ферментами в ответ на повреждения и, обеспечивая, таким образом, определенный уровень защиты растений, приводящий в результате к повышению защитно-адаптивного потенциала растений. Данные исследования проводятся впервые.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта впервые будут отсеквенированы геномы Linaria vulgaris и Nicotiana glauca. Сиквенсы будут проанализированы на предмет присутствия среди них агробактериальных генов. На основе анализа этих данных будет оценено количество и состав вставок Т-ДНК в иучаемых геномах. Среди генов агробактериального происхождения будут выбраны потенциально функциональные (не несущие мутаций, которые могли бы нарушить функции гена). К настоящему времени к таким генам у льнянок относится rolC, у табака этот список шире. Поскольку для других объектов показано, что rolC влияет на синтез вторичных метаболитов, а также компонентов ответа на оксидативный стресс, мы планируем оценить экспрессию генов синтеза ферментов оксидативного стресса (каталазу, пероксидазу, супероксиддисмутазу) и синтеза иридоидных гликозидов (антирринозида и его дериватов) и никотина и его дериватов соответственно. Для этого нетрансгенные виды льнянок (L.maroccana) и табака (N.rustica) будут трансформированы конструкциями, содержащими rolC. Анализ экспрессии генов будет проведен методом ПЦР в реальном времени на примере трансгенных и нетрансгенных тканей растений одного генотипа. Количественный анализ вторичных метаболитов будет проведен методом HPLC. В результате мы узнаем, сколько вставок Т-ДНК в геноме L.vulgaris и N. glauca, каков их возраст, возможные функции. Если вставок более одной и возраст их разный, то можно говорить, что склонность к повторной трансформации характерна не только для уже изученных трансгенных видов табака. Этот момент нужно будет учитывать при возделывании современных трансгенных растений. Выяснение функций трансгенов в природно-трансгенных растениях, давших возможность последним так широко распространиться позволит обратить внимание на то, какие современные трансгенные линии должны быть под особым контролем в ходе экологического мониторинга.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В большинстве случаев для получения трансгенных растений прибегают к агробактериальной трансформации. В то же время, в природе было обнаружено несколько родов растений, Nicotiana, Ipomea и Linaria, представители которых уже содержат Т-ДНК в своих геномах и передают ее в ряду поколений. Их называют природно-трансгенными растениями. Последовательность, гомологичная Т-ДНК Ri плазмиды Agrobacterium rhizogenes впервые была обнаружена в геноме "нетрансформированного" Nicotiana glauca около 30 лет назад и названа клеточной Т-ДНК (клTДНК). Сходные клT-ДНК были найдены в других видах рода Nicotiana у представителей родов Linaria и Ipomea. Гомологи древних генов Т-ДНК до сих пор экспрессируются, наводя на мысль о том, что они могут играть роль в эволюции этих видов, придавая им селективные преимущества. У некоторых представителей рода Nicotiana (N. tomentosiformis, N.tabacum) описаны множественные варианты клТ-ДНК. Это сравнительно недавнее открытие, сделанное благодаря применению методов геномного секвенирования. В рамках данного проекта проводится геномное секвенирование N. glauca и L. vulgaris для выяснения, есть ли в геномах данных видов клТ-ДНК помимо уже описанных. Впервые секвенированы геномы природно-трансгенных видов N.glauca и L. vulgaris. В геноме N. glauca новых последовательностей клТ-ДНК не обнаружено. Показано, что в природно-трансгенных видах льнянок повышено содержание ирдоидных гликозидов по сравнению с нетрансгенным видом L. maroccana. При трансформации L. maroccana штаммом дикого типа A4 Agrobacterium rhizogenes в косматых корнях наблюдается повышение уровня ирдоидных гликозидов. Это согласуется с литературными данными, в соответствии с которыми в культурах бородатых корней возрастает количество мажорных метаболитов. В тоже время не всегда можно прогнозировать, содержание какого именно метаболита будет увеличиваться. В нашем же случае, в результате трансформации увеличилось количество антирринозида и антиррида, то есть именно тех соединений, которые являются основными компонентами конститутивного иммунитета растений рода Linaria. Более того, для природно трансгенных видов было показано более высокое содержание этих веществ по сравнению с остальными видами льнянок. Таким образом, было получено косвенное подтверждение того, что привнесение в геном Т-ДНК может, за счет повышения пула вторичных метаболитов, повышающих защитные возможности растения, давать ему эволюционные преимущества.

 

Публикации

1. Матвеева Т.В. Biodiversity of naturally transgenic Linaria plants Biology and Medicine, 8(6) (год публикации - 2016).

2. Матвеева Т.В., Сокорнова С.В. Agrobacterium rhizogenes Mediated Transformation of Plants for Improvement of Yields of Secondary Metabolites Reference Series in Phytochemistry. Bioprocessing of Plant in vitro Systems, Springer, - (год публикации - 2016).

3. Матвеева Т.В., Хафизова Г.В., Лутова Л.А. Молекулярно-генетические подходы к изучению разнообразия клТ-ДНК природно-трансгенных видов растений на примере Linaria и Nicotiana Вестник защиты растений, 3(89) (год публикации - 2016).

4. Хафизова Г.В. Study of sequences in Nicotiana genomes acquired from Agrobacterium by horizontal gene transfer Biology and Medicine, 8:6(Suppl) (год публикации - 2016).

5. Хафизова Г.В., Добрынин П.В., Матвеева Т.В. Поиск клТ-ДНК в растительном геноме с помощью метода полногеномного выравнивания Вестник защиты растений, 89(3) (год публикации - 2016).


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В большинстве случаев для получения трансгенных растений прибегают к агробактериальной трансформации. В то же время, в природе было обнаружено несколько родов растений, Nicotiana, Ipomea и Linaria, представители которых уже содержат Т-ДНК в своих геномах и передают ее в ряду поколений. Их называют природно-трансгенными растениями. Последовательность, гомологичная Т-ДНК Ri плазмиды Agrobacterium rhizogenes впервые была обнаружена в геноме "нетрансформированного" Nicotiana glauca около 30 лет назад и названа клеточной Т-ДНК (клTДНК). Сходные клT-ДНК были найдены в других видах рода Nicotiana у представителей родов Linaria и Ipomea. Гомологи древних генов Т-ДНК до сих пор экспрессируются, наводя на мысль о том, что они могут играть роль в эволюции этих видов, придавая им селективные преимущества. У некоторых представителей рода Nicotiana (N. tomentosiformis, N.tabacum) описаны множественные варианты клТ-ДНК. Это сравнительно недавнее открытие, сделанное благодаря применению методов геномного секвенирования. В рамках данного проекта проведено геномное секвенирование и сборка геномов двух природно-трансгенных видов: N. glauca и L. vulgaris. В геноме N. glauca новых последовательностей клТ-ДНК не обнаружено. В то же время у L. vulgaris выявлены последователности, отличающиеся на нуклеотидном уровне от описанных ранее. Они требуют дополнительного изучения. Ранее нами показано, что в природно-трансгенных видах льнянок повышено содержание иридоидных гликозидов по сравнению с нетрансгенным видом L. maroccana. При трансформации L. maroccana штаммом дикого типа A4 Agrobacterium rhizogenes в косматых корнях наблюдается повышение уровня ирдоидных гликозидов. Из литературы известно, что в косматых корнях табака повышается содержание никотина. Эти соединения являются основными компонентами конститутивного иммунитета растений исследуемых родов, что является косвенным подтверждением участия Т-ДНК в повышении пула вторичных метаболитов, активирующих защитные возможности растения, давая ему эволюционные преимущества. Однако, механизм регуляции вторичного метаболизма посредством Т-ДНК не изучен. В рамках данного проекта мы исследуем экспрессию генов, влияющих на синтез алкалоидов табака. На данном этапе создана диагностическая панель для изучения экспрессии генов методом высокопроизводительной РВ-ПЦР. Кроме того, для изучения иммунитета растений требуются коллекции патогенов, различающихся вирулентностью. В рамках данного проекта выявлены штаммы Boeremia exigua различающиеся вирулентностью в отношении льнянок.

 

Публикации

1. Владимиров И. А. , Матвеева Т. В. , Лутова Л. А. МЕТОД ТРАНСФОРМАЦИИ МАРОККАНСКОЙ ЛЬНЯНКИ (Linaria maroccana Hook F.).x Генетика, 2018 (год публикации - 2018).

2. Матвеева Т. В., Богомаз О. Д., Голованова Л. А., Ли Ю. С., Димитров Д. ГОМОЛОГИ ГЕНА ROLC ПРИРОДНО-ТРАНСГЕННЫХ ЛЬНЯНОК LINARIA VULGARIS И LINARIA CRETICOLA ЭКСПРЕССИРУЮТСЯ IN VITRO Вавиловский журнал генетики и селекции, - (год публикации - 2018).

3. Матвеева Т.В., Сокорнова С.В, Доморацкая Д.А., Богомаз О.Д. Secondary metabolites in different Linaria species Chinese medicine, - (год публикации - 2017).

4. Матвеева Т.В., Сокорнова С.В. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРИРОДНО-ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ И ИХ РОЛЬ В ЭВОЛЮЦИИ Физиология растений, 64(5):323-336 (год публикации - 2017).

5. Сокорнова С.В., Матвеева Т.В. Natural fungicides obtained from Linaria species Chineese Medicine, - (год публикации - 2017).

6. СокорноваС.В., ГасичЕ.Л., БемоваВ.Д., МатвееваТ.В., Поиск и видовая идентификация патогенов природно-трансгенного вида Linaria vulgaris Экологическая генетика, - (год публикации - 2018).

7. Хафизова Г.В., Добрынин П.В., Полев Д.Е., Матвеева Т.В. Whole-genome sequencing of Nicotiana glauca bioRxiv, - (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Секвенирование геномов растений является перспективным направлением генетики и селекции растений, поскольку анализ геномов позволяет отвечать на многие вопросы, связанные со структурой и функционированием генов, эволюцией растений и отдельных семейств генов, дает массу полезной информации для разработки молекулярных маркеров так необходимых в селекции, открывает новые перспективы для более осмысленного редактирования геномов, метаболической инженерии. В рамках данного этапа проекта мы отсеквенировали геном Nicotiana noctiflora и обнаружили в нем гены гомологичные Т-ДНК агробактерий, как результат горизонтального переноса. Исходя из набора генов и на основании анализа нуклеотидного сходства некоторых из них с таковыми из N. glauca мы сделали вывод о независимых актах трансформации в эволюции N. glauca и N. noctiflora. Нами была проведена сборка генома Linaria vulgatis и обнаружены в ней новые фрагменты Т-ДНК агробактерий. По данным анализа генома выявлены ключевые гены, контролирующие синтез иридоидов и флавоноидов у льнянки. На основе их сиквенсов создана диагностическая панель для высокопроизводительного анализа экспрессии данных генов на Fluidigm Biomark. Показано повышенное содержание иридоидных гликозидов у растений льнянки, экспрессирующих ген rolC, а также а также увеличение активности ферментов, участвующих в нейтрализации АФК у этих растений. Механизмы этого еще предстоит изучить. Полученные результаты важны в контексте обоснования идеи о биобезопасности трансгенных технологий. Данные секвенирования геномов могут дать много полезной информации для фундаментальной науки и прикладной селекции (поиск новых механизмов устойчивости к патогенам и вредителям, изучение инсектицидных свойств растений и многие другие).

 

Публикации

1. Коадаптация и эволюция в растительно-микробных системах Editorial: Cooperative adaptations and evolution in plant-microbe systems, Frontiers in Plant science, 2018, V. 9, https://doi.org/10.3389/fpls.2018.01090 (год публикации - 2018).

2. Матвеева Т.В. Agrobacterium-mediated transformation in the evolution of plants. Agrobacterium Biology. Gelvin S. (eds). Current Topics in Microbiology and Immunology, V.148, 421-441 (год публикации - 2018).

3. Матвеева Т.В., Хафизова Г.В., Добрынин П.В., Полев Д.Е, Лутова Л.А. Секвенированиие нового поколения в изучении природно-трансгенных растений. Сборник тезисов. Международный форум "Биотехнология: состояние и перспективы развития.", Выпуск 16, C.39-40 (год публикации - 2018).

4. Сокорнова С.В., Богомаз О.Д., Матвеева Т.В. Природно-трансгенное растение Linaria vulgaris, как источник природных гликозидов. Сборник тезисов. Международный форум "Биотехнология: состояние и перспективы развития.", Выпуск 16, С. 35-37 (год публикации - 2018).

5. Хафизова Г., Добрынин П., Полев Д., Матвеева Т. Nicotiana glauca whole-genome investigation for cT-DNA study BMC Research notes, 11(1): 18. (год публикации - 2018).