Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017 г. были продолжены исследования по синтезу и изучению биологической активности новых конъюгатов пурина. В соответствии с планом проведены исследования по разработке методов синтеза новых конъюгатов пурина и 2-аминопурина с глицил-дипептидами, содержащими фрагменты аминокислот L- и D-ряда (серин, тирозин, оксипролин); с (S)-аланил-(S)-глутаминовой кислотой; конъюгатов 9-бензилпурина и 2-амино-9-бензилпурина с глицином и глицил-(S)-глутаминовой кислотой, исходя из специально полученных защищенных аминокислот и дипептидов. Соединения наработаны в количествах, достаточных для тестирования их антимикобактериальной активности в опытах in vitro. В 2017 г. проведены исследования по разработке методов синтеза конъюгатов пурина с рацемическим 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2Н-[1,4]бензоксазином и его (S)-изомером, присоединенным через линкеры различной длины (фрагменты омега-аминокислот: глицина, аминомасляной, аминовалериановой, аминооктановой кислот), разработаны методы анализа энантиомерного состава синтезированных соединений. Исходные энантиомерно чистые гетероциклические амины получены методом кинетического разделения рацематов в результате диастереоселективного ацилирования хлорангидридами оптически чистых кислот. Проведены работы по синтезу конъюгатов пурина с фторсодержащими анилинами. По разработанному нами ранее методу хемоэнзиматического трансгликозилирования получены новые рибозиды на основе конъюгатов 2-аминопурина с (R)- и (S)-энантиомерами 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2Н-[1,4]бензоксазина. Соединения наработаны в количествах, достаточных для тестирования их противогерпетической активности в опытах in vitro. В отчетный период проведено изучение туберкулостатической активности 40 новых конъюгатов пурина и 2-аминопурина в опытах in vitro в отношении лабораторного штамма микобактерий туберкулеза H37Rv. Большинство из изученных производных проявили умеренную активность, а три соединения продемонстрировали высокую антимикобактериальную активность. Одно из наиболее активных соединений (Nε-[2-амино-9-(2-гидроксиэтоксиметил)пурин-6-ил]-(S)-лизин) проявило также высокую антимикобактериальную активность в отношении штаммов микобактерий: M. avium, M. terrae, МЛУ (клинический штамм с множественной лекарственной устойчивостью). Проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что введение бензильного заместителя в 9-е положение пуриновой системы не приводит к увеличению туберкулостатической активности конъюгатов пурина и 2-аминопурина с глицином и дипептидом глицил-(S)-глутаминовая кислота. Особо следует подчеркнуть, что конфигурация хирального центра в остатке аминокислоты имеет решающее значение для проявления антимикобактериальной активности. Два соединения, содержащие фрагмент (S)-аланина: N-(2-ацетамидопурин-6-ил)-(S)-аланин и конъюгат пурина с дипептидом (S)-аланил-(S)-глутаминовая кислота обладали достаточно высокой активностью. В отчетный период проведен молекулярный докинг 10 соединений, проявивших высокую туберкулостатическую активность, в активный центр глутаминсинтазы M. tuberculosis. Структуры наиболее активных конъюгатов, содержащих фрагмент дипептида глицил-(S)-глутаминовой кислоты, докируются с наилучшим значением оценочной функции из рассмотренной выборки, что коррелирует с их высокой активностью. Полученные данные, в целом, подтверждают высказанное нами ранее предположение, что туберкулостатическая активность конъюгатов пурина с аминокислотами и пептидами связана с их способностью ингибировать глутаминсинтазу M. tuberculosis. Проведено изучение противоопухолевой активности 9 конъюгатов пурина и 2-аминопурина на клеточных линиях опухолей человека (МТТ-тест). Установлено, что ни одно из исследованных соединений не обладает цитотоксической активностью в отношении клеточных линий опухолей человека А549, РС-3, НСТ-116, MCF-7 и Jurkat. В 2017 г. протестировано 15 соединений в отношении вируса герпеса простого типа 1 (ВПГ-1) на эталонном штамме L2 и штамме ВПГ-1/L2/R, глубоко резистентном к действию противогерпетического препарата ацикловир. Установлено, что введение остатка рибозы не приводит к увеличению противогерпетической активности синтезированных нуклеозидов по сравнению с соответствующими исходными пуриновыми основаниями. Производные (S)-ряда были в 4 и более раз эффективнее, чем (R)-энантиомеры, что еще раз подтверждает значительную роль стереоконфигурации биологически активных соединений. По материалам исследования в 2017 г. опубликовано три статьи в журналах, индексируемых базой данных Web of Science Core Collection и имеющих импакт-фактор от 0,445 до 3,902; одна статья (обзор) принята к публикации в журнале Успехи химии, индексируемом базой данных Web of Science Core Collection (импакт-фактор 4,058). Результаты работ по проекту были представлены на трех российских и международных конференциях в виде стендовых сообщений, устных и приглашенных докладов. В отчетный период получено решение о выдаче патента на изобретение, созданное во время выполнения проекта; патент РФ, оформленный в ходе выполнения проекта, вошел в номинацию «100 лучших изобретений России-2016».

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 г. продолжены исследования по разработке методов синтеза конъюгатов пурина и 2-аминопурина с короткими дипептидами различного строения. Были разработаны методы получения конъюгатов N-(пурин-6-ил)глицина, содержащих фрагменты диаминокислот ((S)-лизина и (S)-орнитина) со свободными альфа-амино- и карбоксильными группами. Разработаны методы получения конъюгатов пурина и 2-аминопурина с короткими пептидами: глицил-глицином, глицил-(S)-глутамином, (S)-фенилаланил-(S)-глутаминовой кислотой и валил-(S)-глутаминовой кислотой. Все соединения наработаны в количествах достаточных для тестирования их антимикобактериальной активности. Изучена возможность гликозилирования производных 2-аминопурина, замещенных по положению 6 остатками аминокислот (глицина, аланина, валина, фенилаланина и пролина). Показано, что рекомбинантная пуриннуклеозидфосфорилаза (PNP) E. coli является подходящим катализатором для получения нуклеозидов на основе N-(2-аминопурин-6-ил)аминокислот, а также трет-бутиловых эфиров (2-ацетамидопурин-6-ил)аминокислот. Установлено, что трет-бутиловый эфир N-(2-ацетамидопурин-6-ил)пролина не подвергался гликозилированию в присутствии PNP E. coli. Проведено хемо-энзиматическое гликозилирование энантиомерно чистых конъюгатов 2-аминопурина с 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазином, присоединённым напрямую и через остаток 6-аминогексановой кислоты. Изучена зависимость эффективности ферментативного гликозилирования от структуры субстрата, его пространственной конфигурации, а также от природы донора углеводного фрагмента. В отчетный период изучена специфическая туберкулостатическая активность 35 конъюгатов пурина и 2-аминопурина, синтезированных в рамках выполнения проекта в 2017-2018 гг., в отношении лабораторного штамма Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Большинство из изученных производных проявили низкую активность (МИК 12,5 мкг/мл); четыре соединения: проявили умеренную антимикобактериальную активность (МИК 6,2 мкг/мл). Наиболее высокую ингибирующую активность (МИК 3,1 мкг/мл) в изученном ряду соединений показал конъюгат пурина с глицилглицином. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейшего поиска соединений, обладающих туберкулостатической активностью в изучаемом ряду соединений. В результате тестирования антимикобактериальной активности 35 новых конъюгатов пурина, соединений, обладающих активностью, превосходящей таковую для синтезированных ранее N-(2-аминопурин-6-ил)глицил-(S)-глутаминовой кислоты и N-(пурин-6-ил)глицил-(S)-глутаминовой кислоты выявлено не было. В связи с этим, были выполнены дополнительные расчеты по молекулярному докингу соединений, проявивших наибольшую антимикобактериальную активность, в активный центр глутаминсинтазы M. tuberculosis, уточняющие ранее полученные результаты. Дополнительные расчеты подтвердили высказанное нами ранее предположение о механизме антимикобактериального действия конъюгатов пурина с глутаминовой кислотой, обусловленного ингибированием глутаминсинтазы (ГС), что является серьезной научной основой для целенаправленного поиска новых противотуберкулезных агентов. Проведено изучение ингибирующей активности синтезированных соединений, проявивших наибольшее антимикобактериальное действие, в отношении ГС (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, г. Москва). Установлено, что в изученной концентрации наиболее активные соединения, N-(2-аминопурин-6-ил)глицил-(S)-глутаминовая кислота и N-(пурин-6-ил)глицил-(S)-глутаминовая кислота, ингибируют активность ГС почти также сильно, как стандартный ингибитор ГС L-метионинсульфоксимин. Таким образом, впервые экспериментально установлена способность наиболее активных соединений ингибировать фермент ГС. Важным результатом выполнения проекта стала передача на доклинические исследования в рамках Программы ФАРМА-2020 соединения, проявившего наибольшую противотуберкулезную активность. Разработаны методы синтеза конъюгатов пурина с фторсодержащими гетероциклическими аминами: 5-фториндолином и 7-трифторметил-1,2,3,4-тетрагидро-хинолином. Синтезированы структурные аналоги (RS)-3,4-дигидро-3-метил-4-[6-(пурин-6-ил)аминогексаноил]-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина (ранее проявившего высокую противовирусную активность), содержащие фрагменты различного строения вместо пуриновой системы. Разработаны методы синтеза производного, в котором фрагмент пурина заменен на ацетильный остаток, фрагменты анилина, 1-нафтиламина и пиримидина. В отчетный период синтезированы новые 6-замещенные производные пурина, содержащие фрагменты хиральных гетероциклических аминов и (2S,4R)-4-гидроксипролина. Строение и стереоизомерная чистота полученных соединений установлено методами ЯМР спектроскопии и ВЭЖХ. Проведено изучение противовирусной активности 20 конъюгатов пурина, синтезированных в 2017-2018 гг., в отношении вируса простого герпеса типа 1 на эталонном штамме L2 (ВПГ-1/L2) и штамме ВПГ-1/L2/R, глубоко резистентном к действию противогерпетического препарата ацикловир. Установлено, что наибольшей противогерпетической активностью обладают рибозиды конъюгатов 2-аминопурина с (S)- и (R)-изомерами 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина (химиотерапевтический индекс >32 и 23 соответственно) и 4-[8-(пурин-6-иламино)октаноил]-3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазин (ХТИ 39). На основании проведенных исследований выявлены связи «структура-активность», которые позволяют сделать вывод о том, что противогерпетическая активность синтезированных конъюгатов пурина обусловлена не наличием какой-либо одной фармакофорной группы, а сочетанием трех структурных фрагментов: пурина, омега-аминоалкановой кислота (содержащая более пяти метиленовых групп) и 3,4-дигидро-3-метил-7,8-дифтор-2H-[1,4]бензоксазина. Проведено тестирование 10 конъюгатов пурина, различающихся длиной линкерного фрагмента и строением гетероциклического амина, в отношении вирусов другого типа: вируса осповакцины и трех штаммов вируса гриппа. Установлено, что ни одно из исследованных соединений не проявило противовирусной активности в отношении вируса осповакцины in vitro. В результате изучения противовирусной активность в отношении вирусов гриппа, выявлены соединения, обладающие высокой активностью в отношении всех трех штаммов вируса гриппа. Полученные результаты позволяют сделать выводы о соотношении «структура-активность» в ряду изученных соединений: противогриппозной активностью обладают соединения, в которых длина линкера - омега-аминоалкановой кислоты составляла не менее 5 метиленовых групп, имея тенденцию к увеличению с ростом цепи. Полученные в ходе выполнения настоящего проекта научные результаты дают основания считать перспективным дальнейшее исследование соединений указанной группы и их аналогов в качестве эффективных противовирусных препаратов. По материалам исследования в 2018 г. опубликовано или принято в печать восемь статей в журналах, индексируемых базой данных Web of Science Core Collection и имеющих импакт-фактор от 0,580 до 2,882 (одно издание: European Journal of Organic Chemistry (импакт-фактор 2017 2,882) входит в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору JCR Science Edition). Результаты работ по проекту были представлены на 4-х российских конференциях (в том числе с международным участием) в виде стендовых сообщений, устных, приглашенных и пленарных докладов. В отчетный период получен патент РФ RU2644351.