Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Хромосома 5В мягкой пшеницы примечательна тем фактом, что ее реорганизация в ходе эволюции привела к стабилизации генома первого аллополиплоидного вида пшениц - Triticum dicoccoides, а также других распространенных аллополиплоидных видов Triticum. Проведено комплексное исследование эволюции короткого плеча хромосомы 5B (5ВS) пшеницы в соответствии с данными физического картирования и анализом первичной структуры отдельных районов хромосомы. Физическая карта плеча хромосомы 5BS (290 млн.п.н.) мягкой пшеницы (сорта Чайниз Спринг) была построена по результатам сборки 43 776 BAC-клонов, более чем в 15 раз покрывающих длину 5BS, с использованием методов рестрикционного анализа и программного обеспечения LTC. Полученная физическая карта составляла ~ 99% плеча 5BS и состояла из 111 скаффолдов (N50 = 3.078 млн.п.н.). SSR, ISBP и Zipper-маркеры были использованы для локализации BAC клонов на хромосоме, и из них 722 новых маркеров были разработаны на основе ранее полученных данных частичного секвенирования ВАС-клонов. Три подхода были использованы для локализации BAC контигов на 5BS-хромосоме, скрининг маркерами ВАС-библиотеки, анализ распределения синтенных групп маркеров (GenomeZipper-анализ) и сравнение рестрикционных сайтов BAC-клонов мягкой пшеницы с 5B псевдомолекулой T. dicoccoides методом in silico. Эти подходы позволили достичь высокого уровня локализации BAC контигов на хромосому, для 96% 5BS был определен порядок чередования BAC контигов. Выявлены особенности распределения контигов вдоль хромосомы взависимости от их длины. Короткие контиги (200-999 т.п.н.), чередующиеся с тандемными повторами, были в основном локализованы в субтеломерном районе 5BS; тогда как распределение более крупных 1000-3500 т.п.н. контигов вдоль хромосомы лучше коррелировало с распределением районов, синтенных с рисом, брахиподиумом и сорго. In silico локализация рестрикционных сайтов на псевдомолекуле 5B diccocoides использовалась также для сравнительного анализа 5BS aestivum и 5BS diccocoides (в дополнение к локальным BLAST - сравнениям). Выяснилось, что порядок кластеров контигов (от 5 до 10 контигов в одном кластере) вдоль 5BS aestivum и diccocoides одинаковый. Были обнаружили некоторые различия внутри отдельных кластерах между aestivum и diccocoides. Например, различия в расположении клонов BAC отмечались в дистальной области хромосомы, а именно, в районах между SNP-маркерами BS00083715 - BS00022336 (5BS_SR район). Эти различия были изучены более подробно путем сравнения соответствующих частей псевдомолекул 5BS мягкой пшеницы (сорт Чайниз Спринг - СS) и T. dicoccoides (сорт Завитан - Zv). Сравнение 5BS_SR районов CS и Zv протяженностью 6 млн.п.н. и 7 млн.п.н., соответственно, выявило тандемные повторяющиеся последовательности между маркерами BS00083715 - wsnp_Ex_c2459_4591587 и некоторые участки с очень низким сходством или некартированные на хромосомах CS. Было выявлено три больших участка ~ 0.67, 2 и 0.54 млн.п.н. с очень низким сходством между видами. Взяв референсную последовательность за основу, можно предположить, что ключевыми перестройками хромосомы 5BS в процессе эволюции были инсерции, но не делеции. Детальный анализ этих участков показал в первом случае преобладающие инсерции транспозонных элементов (TE) у CS (общая длина составила 0,39 млн.п.н.) и Zv (0,28 млн.п.н.); во-втором случае преобладающие инсерции крупных кластеров TE были найдены у Zv (общая длина 1,6 млн.п.н.) и CS (длина 0,4 млн.п.н.). Последний участок (длина 0,54 млн.п.н.) отличался между Cs и Zv в результате инсерции у CS последовательности ДНК, содержащий множественные повторы разной длины, большинство из которых вложены друг в друга. Zv также содержит повторяющиеся последовательности ДНК в этой области, однако, они отличаются от последовательностей ДНК CS. Выявленные в первом и втором InDels- участках мобильные элементы были сгруппированы и классифицированы. Во всех случаях преобладали TEs LTR-содержащие ретротранспозоны, суперсемейства Gypsy и Copia. Хромосома 5В известна тем, что несет также кластер тандемно организованных генов, это гены 5S РНК. Анализ положения этих генов на псевдомолекуле 5B сорта CS показал, что последовательности 5S рДНК расположены в позиции 83427367 с числом копий равным 21. Учитывая, что при секвенировании и сборке последовательностей ДНК, участки, несущие протяженные кластеры тандемных повторов, в том числе и гены, кодирующие 5S рРНК, остаются в значительной степени неохваченными, были проведены работы по дополнительному изучению этого района хромосомы. Три BAC-клона, содержащие 5S рДНК, были идентифицированы в 5BS BAC-библиотеке T. aestivum. Пиросеквенирование ВАС-клонов и последующая сборка позволило отобрать шесть контигов, содержащих 5S рДНК, общей длиной 140417 н.п. и два набора (пула) индивидуальных последовательностей 5S рДНК, принадлежащих отдельным, но близко расположенным участкам 5BS-хромосомы. Оба участка характеризовались наличием приблизительно 70-80 копий 5S рДНК, однако полностью различались по своей структурной организации. Первый пул содержал короткий тип единицы 5S рДНК с высоким уровнем дивергенции, которые прерывались множественными вставками мобильных элементов. Второй пул содержал более консервативный длинный тип единицы 5S рДНК, организованный в виде протяженных тандемов. FISH с использованием зондов, специфичных для обоих типов единиц 5S рДНК, показал различия в распределении и интенсивности сигналов на хромосомах полиплоидных видов пшеницы и их диплоидных предшественников. Различия в организации как в 5S рДНК, так и в прилегающих к ним участках, состоящих из мобильных элементов, подразумевает различные пути эволюции локусов 5S рДНК.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Завершены работы по построению референсной последовательности хромосомы 5В (протяженностью 870 млн. п.н.) мягкой пшеницы в рамках международного консорциума по секвенированию генома пшеницы (http://science.sciencemag.org/ content/361/6403/eaar7191/, https://academcity.org/content/o-chem-rasskazal-genom-pshenicy). Для этой работы были использованы данные секвенирования, физического и генетического картирования хромосомы 5В мягкой пшеницы и T. dicoccoides, полученные в ходе выполнения проекта. Референсная последовательность хромосомы 5B была включена в анализ транскрипционной активности генов, расположенных на хромосоме 5В мягкой пшеницы и T. dicoccoides и контролируемых генами с хромосомы 5B, но локализованных в других областях генома (1); для анализа генов устойчивости к бурой ржавчине, расположенных в субтеломерном районе короткого плеча хромосомы 5В (5BS), методом целевого секвенирования (2); для изучения особенностей структуры и эволюции генов 5S рРНК мягкой пшеницы и T. dicoccoides, расположенных, в том числе, на хромосоме 5ВS (3); для анализа участка хромосомы 5BS T. dicoccoides и мягкой пшеницы, маркированного ВАС клоном 029E07, длиной 93,576 п.н., для которого ранее показана дифференциальная in situ гибридизация на хромосомах полиплоидных видов пшеницы (4). 1. Сборка и анализ транскриптомов (полученных с использованием высокопроизводительного секвенирования транскриптомов, RNA-Seq) мягкой пшеницы сорта Чайниз Спринг (CS) и замещенной линии, несущей хромосому 5В от T. dicoccoides (CS-5Bdic), позволили выявить дифференциально экспрессирующиеся гены (ДЭГ) и аннотировать их по генной онтологии (молекулярная функция, биологический процесс, клеточный компонент). Впервые исследована суточная динамика транскрипционной активности индивидуальных генов, расположенных на хромосоме 5В мягкой пшеницы и T. dicoccoides, и последовательностей, контролируемых этими генами. Показано, что паттерны экспрессии ряда генов сорта CS и замещенной линии CS-5Bdic различаются. Определены гены, дифференциально экспрессирующиеся в замещенной линии и сорте CS для каждой временной точки сбора материала. Выявлены районы хромосом, где локализованы гены, характеризующиеся дифференциальной экспрессией. По результатам функциональной аннотации и оценки достоверности различия экспрессии ДЭГ, были отобраны 5 генов с хромосомы 5B и 17 генов с остального генома для верификации различий степени и паттернов экспрессии генов CS и CS-5Bdic. Гены-кандидаты с хромосомы 5B являются транскрипционными факторами, которые могут регулировать активность других генов. Гены-кандидаты с остального генома представляют собой разнородную группу, включающую в себя транскрипционные факторы; гены, связанные с ответом на свет; гомологи известных генов путей цветения; и гены метаболизма азота, которые, как было показано в некоторых исследованиях, также могут влиять на время цветения. Паттерны экспрессии генов, выявленные в результате количественной ПЦР, совпадают с паттернами, полученными на основании данных секвенирования транскриптома как для генов, локализованных на хромосоме 5B, так и для генов из других областей генома. Таким образом, можно говорить о подтверждении данных, полученных в результате секвенирования транскриптома. Среди изученных генов, наибольший интерес представляет ген TraesCS5B01G075300, локализованный на хромосоме 5B, демонстрирующий дифференциальную экспрессию во всех четырех временных точках (две из них достоверно подтверждены количественной ПЦР) и кодирующий транскрипционный фактор семейства Myb. Предполагается участие этого гена в регуляции развития флоральных меристем и времени цветения. Интересным также является подтверждение дифференциальной экспрессии генов CS и CS-5Вdic, вовлеченных в процессы усвоения и обмена азота, а также метаболизма АТФ, что может быть одной из причин замедления темпа развития и смещения времени колошения у замещенной линии CS-5Bdic. 2. Проведено целевое секвенирование района 5BS протяженностью 25Mb, с использованием SeqCap EZ Target Enrichment System (Roche) на материале 10 растений популяции F4 от скрещивания восприимчивых и устойчивых к бурой ржавчине сортов пшеницы. Данные растения различаются по степени устойчивости к бурой ржавчине и присутствию в изучаемом районе хромосомы гена, контролирующего устойчивость к этому заболеванию. Использование различных биоинформатических подходов позволило идентифицировать гены, которые могут активироваться в ответ на поражение растения фитопатогенами. 3. Для изучения особенностей структуры и эволюции генов 5S рРНК, расположенных на хромосоме 5ВS, проведено секвенирование 52 образцов различных видов пшеницы. В анализ были отобраны тетраплоидные виды двух эволюционных линий пшеницы (T. dicoccoides, T. araraticum, T. timopheevii) и их диплоидные предшественники (T. urartu, T. monococcum, T. boeoticum, Ae. speltoides). Секвенирование проводили на платформе Illumina NextSeq 550 (центр коллективного пользования ИЦиГ СО РАН). Анализ полученных последовательностей выявил внутривидовые различия в численности рибосомальных генов, содержащих короткие и длинные нетранкрибируемые спейсеры. Несмотря на это, существенных различий в филогенетических деревьях, построенных по этим двум группам последовательностей, выявлено не было. Используемый подход позволил выявить рибосомальную ДНК с коротким нетранскрибируемым спейсером у диплоидных предшественников А-генома, который не выявлялся ранее методом in situ гибридизации. 4. Идентифицирован участок на референсной последовательности хромосомы 5B мягкой пшеницы T. aestivum сорта CS и T. dicoccoides образца Zavitan, маркированный ВАС клоном 029E07, который демонстрирует дифференциальную in situ гибридизацию на хромосомы полиплоидных видов пшеницы. В результате дополнительного аннотирования выявлен новый тандемный повтор с длиной мономера 646 п.н. (646_029E07), протяженностью около 10063 п.н. у T. aestivum сорта CS и 20026 п.н. у T. dicoccoides образца Zavitan. С помощью ПЦР-анализа изучено присутствие данного повтора в 194 образцах 9 видов пшеницы (T. monococcum, T. boeoticum, T. urartu, Ae. speltoides, T. dicoccoides, T. durum, Т. dicoccum, T. timopheevii, T. araraticum, T. aestivum). Показано отсутствие данного повтора у диплоидных, и дифференциальное присутствие повтора в геномах тетраплоидных и гексаплоидных пшениц. Полученные данные указывают на то, что в ходе эволюции произошла амплификация последовательности 646_029E07 у T. dicoccoides с формированием области тандемного повтора более 20 т.п.н., протяжённость которого изменялась в процессе эволюции полиплоидных пшениц.