КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 14-14-00557

НазваниеИзменение скорости диффузии морфогенов как механизм регуляции морфогенетического поля.

РуководительЗарайский Андрей Георгиевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2017 г. - 2018 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-106 - Биология развития

Ключевые словаэмбриональное развитие, эмбриональные регуляции, дифференцировка клеток, морфогены, морфогенетическое поле, диффузия секретируемых белков, визуализация белков in vivo, экспрессия генов.

Код ГРНТИ34.15.49

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
В целом предлагаемый проект направлен на решение одной из важнейших проблем биологии развития - выяснение молекулярных механизмов формирования т.н. морфогенетических полей - крупномасштабных динамических структур, обеспечивающих правильную пространственную разметку эмбриональных зачатков. Одной из двух основных целей проекта будет продолжение изучения обнаруженного в ходе реализации предыдущего проекта (Проект 2014) эффекта влияния на диффузию секретируемых белков-морфогенов их адсорбции на межклеточном матриксе. Данный эффект впервые позволил понять, каким образом за счет разной адсорбции на межклеточном матриксе для разных белков-морфогенов с приблизительно одинаковой гидродинамической подвижностью может достигаться разная скорость диффузии в межклеточном пространстве. Продолжение работы в данном направлении крайне важно, поскольку знание закономерностей адсорбции морфогенных белков на внеклеточном матриксе позволяет строить более реалистичные реакционно-диффузионные модели ранней разметки эмбриона, в том числе, проводить численное моделирования реальных механизмов, обеспечивающих целостность эмбрионального развития. Предполагается, что работа в данном направлении, в свою очередь, будет направлена на решение двух задач. Во-первых, мы планируем исследовать кинетику взаимодействия гепарин-связывающих мотивов морофогенов с гепариновыми полисахаридами, году используя два оригинальных подхода, основанных на смывании соответствующего гепарин-связывающего пептида с иммобиллизованного гепарина и, наоборот, смывании гепарина с иммобилизованного пептида. Во-вторых, предполагается подробное изучение феномена эмбрионального скейлинга и описывающих его моделей с позиций, развитых в ходе выполнения Проекта 2014 года. Способность эмбриона к пропорциональной регуляции своих структур в ответ на изменение общих размеров - т.н. эмбриональный скейлинг - одно из наиболее ярких проявлений феномена эмбриональных регуляций, отражающего уникальное свойство эмбриона быть единым целым. На сегодняшний день в литературе наиболее подробно исследован скейлинг пространственного градиента фактора BMP, дифференциальная экспрессия которого в конечном итоге создает дорcо-вентральную ассиметрию. Наблюдая за градиентом BMP, задачу об исследовании феномена скейлинга можно локализовать до задачи исследования изменения градиента BMP в ответ на изменение размеров эмбриона. В этом направлении разными авторами было предложено несколько математических моделей. Однако, на сколько нам известно, в подобных моделях никогда ранее не учитывалась роль адсорбции морфогенов на компонентах межклеточного матрикса. Между тем, в ходе работы по Проекту 2014 мы показали, что такая адсорбция может играть чрезвычайно важную роль в диффузии морфогенов. Более того, мы выяснили, что интенсивность этой адсорбции сама по себе образует пространственный градиент, который способен регулироваться в ответ на изменение размеров эмбриона. Поэтому одним из перспективных направлений в продолжении нашего Проекта-2014 будет учет пространственно неоднородной адсорбции морфогенов в моделировании скейлинга дорсо-вентрального градиента дифференцировки. Второй основной целью проекта, тесно связанной с его первой целью, будет изучение влияния на пространственное распределение морфогенов белковых продуктов ряда генов, экспрессия которых изменяется при искусственном уменьшении общих размеров эмбриона. В предыдущем проекте (Проект 2014) нам удалось с помощью высокопроизводительного секвенирования идентифицировать ряд генов, экспрессия которых резко меняется в ответ на искусственное уменьшение размеров эмбриона. Было установлено, что один из этих генов, кодирует секретируемую металлопротеиназу ММPЗ, относящуюся к семейству внеклеточных цинк-зависимых эндопептидаз, способных разрушать все типы белков внеклеточного матрикса. В ходе настоящего проекта мы предполагаем изучить влияние этой металлопротеиназы на формирующиеся в ходе развития градиенты некоторых морфогенов и выяснить ее роль в эмбриональном скейлинге. Ожидается, что MMP3 может оказывать как воздействие на внеклеточный матрикс, изменяя параметры адсорбции морфогенов на нем, и как следствие - их диффузию. Другой возможный механизм работы протеиназы — селективное расщепление морфогенов с различной подвижностью. Кроме того, в зависимости от получаемых результатов, может быть изучена роль в эмбриональном скейлинге продуктов некоторых других генов, найденных в предыдущем проекте и изменяющих свою экспрессию в ответ на изменение общих размеров эмбриона. Благодаря уникальности результатов, полученных в ходе работы по Проекту 2014, работа по настоящему проекту будет иметь приоритетный характер, а его реализация позволит продвинуться в решении одной из важнейших фундаментальных проблемы современной биологии - выяснении молекулярных механизмов эмбриональных регуляций.

Ожидаемые результаты
Развитые в рамках Проекта 2014 года наработки планируется продолжить в ходе проекта 2017. Прежде всего, в результате сопоставления данных запланированных in vivo и in vitro экспериментов предполагается найти параметры адсорбции морфогенов на внеклеточном матриксе. Далее с учетом, во-первых, зависимости скорости диффузии морфогенов от адсорбции на компонентах внеклеточного матрикса, во-вторых, гетерогенности распределения адсорбционной способности самого матрикса, будет предложена модель регуляции морфогенетического градиента в раннем развитии эмбриона шпорцевой лягушки. Модель будет строиться таким образом, чтобы воспроизводить эффект регуляции градиента в зависимости от размеров эмбриона. С помощью модели будет показано, каким образом влияние матрикса на диффузию морфогенов отражается в разметке морфогенетических полей. Поскольку, на сколько нам известно, роль адсорбции морфогенов на межклеточном матриксе в их диффузии и самоорганизации концентрационных градиентов систематически не изучается нигде в мире, кроме нашей лаборатории, результаты работы по проекту будут иметь приоритетное значение для понимания одной из фундаментальных проблем современной биологии - выяснении молекулярных механизмов эмбриональных регуляций. Одним из важных результатов Проекта 2014 было установление того факта, что экспрессия гена секретируемой металлопротеиназы ММPЗ, фермента отвечающего за деградацию внеклеточного матрикса, резко уменьшается в ответ на искусственное уменьшение размеров эмбриона. В ходе настоящего проекта с помощью различных методов молекулярной биологии и биологии развития планируется изучить роль ММPЗ в скейлинге структур осевого комплекса эмбриона шпорцевой лягушки при искусственном уменьшении его общих размеров. В том числе, с помощью разработанного в ходе Проекта 2014 комплекса методов планируется исследовать влияние этого фермента на диффузию и скорость деградации некоторых секретируемых белков-морфогенов (семейства Noggin, Chordin и BMP) в межклеточном пространстве эктодермы эмбриона шпорцевой лягушки. В результате предполагается установить один из механизмов, отвечающий за фундаментальное свойство эмбрионального развития - способность зародыша к скейлингу своих структур. Кроме того, изучение свойств металлопротеиназы ММPЗ в вышеуказанном, ранее не изучавшемся, аспекте имеет важное прикладное значение и ввиду того, что данная металлопротеиназа принимает активное участие в разрушении белков внеклеточного матрикса при регенерации, а также в процессах заболеваний, таких как артрит и метастазы опухолей. Полученные результаты будут опубликованы в виде статей в ведущих мировых научных журналах соответствующего профиля и доложены на конференциях.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе работы по проекту в 2017 г. проводились эксперименты по двум направлениям, связанным с проблемой эмбрионального скейлинга. Во-первых, изучали механизмы адсорбции и диффузии эмбриональных белков-морфогенов, а также моделировали образование их градиентов в эмбриональном развитии. Во-вторых, исследовали роль секретируемой металлопротеазы MMP3 в регуляции эмбрионального скейлинга. В рамках первого направления, Синтезирован биотинилированый пептид с первичной последовательностью гепарин-связывающего домена Noggin1. Измерено характерное время жизни комплекса гепариновый пептид - гепарин, которое составило порядка 10 секунд. Установлено, что в условиях in vivo при диффузии сквозь межклеточное пространство быстрая фаза кинетики восстановления флюоресценции после фотоотбеливания соответствует характерному времени десорбции с гепариновых углеводов межклеточного матрикса. Проведен анализ известных моделей эмбриональной регуляции установления градиента активности BMP каскада на примере зародышей Drosophila и Xenopus. Анализ показал, что только модель Мейнхарта 90-го года, одна из самых слабо проработанных, предполагает неустойчивость Тьюринга. Остальные же модели такой неустойчивостью не обладают и относятся к классу source-sink моделей. Мы показали, что в большинстве случаев эти модели имеют решение в форме бегущей волны, распространяющейся в направлении вентрализации всей поверхности эмбриона. Взяв за основу модель Inomata-Sasai, мы показали, что в простой системе, включающей только BMP, ADMP и Chordin, система формирует бегущую волну самоактивации BMP-каскада, которая останавливается, когда приходит в равновесие с хордином, синтезирующимся в организаторе. В ходе работы по второму направлению исследований были проведены эксперименты по ингибированию трансляции и по оверэкспрессии MMP3 в эмбрионах шпорцевой лягушки. В результате установлено, что подавление трансляции MMP3 вызывает ряд эффектов, аналогичных наблюдаемым в искусственно уменьшенных эмбрионах: уменьшение размеров нервной пластинки и сомитной мезодермы. Совместно с тем фактом, что уровень экспрессии MMP3 в искусственно уменьшенных эмбрионах существенно ниже, чем в норме, эти результаты указывают, что данная металлопротеаза играет одну из ключвых ролей при эмбриональном скейлинге. По материалам работы опубликована одна статья и две статьи приняты к печати. Все эти статьи индексируются в WoS, Scopus и РИНЦ.

 

Публикации

1. Иванова А.С., Ермакова Г.В., Зарайский А.Г., Терёшина М.Б. Паттерны митозов и активации МАР-киназного каскада в ходе регенерации хвоста у головастиков Xenopus laevis и в рефрактерный период Онтогенез, - (год публикации - 2018)

2. Мартынова Н.Ю., Ерошкин, Ф.М., Зарайский А.Г. Влияние гетеродимерного комплекса транскрипционных факторов SoxD (Sox15) И Xanf1 на формирование зоны экспрессии гена Xanf1 в раннем развитии переднего мозга у шпорцевой лягушки. Биоорганическая химия, - (год публикации - 2018)

3. Мартынова Н.Ю., Ерошкин, Ф.М., Орлов Е.Е., Зарайский А.Г. HMG-box factor SoxD/Sox15 and homeodomain-containing factor Xanf1/ Hesx1 directly interact and regulate the expression of Xanf1/Hesx1 during early forebrain development in Xenopus laevis. Gene, 638 (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.gene.2017.09.024

4. Нестеренко А.М., Кузнецов М.В., Короткова Д.Д., Зарайский А.Г. Morphogene adsorption as a Turing instability regulator: Theoretical analysis and possible applications in multicellular embryonic systems PLOS ONE, 2017 Feb 7;12(2):e0171212 (год публикации - 2017) https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171212

5. Нестеренко А.М., Орлов Е.Е., Ермакова Г.В., Мартынова Н.Ю., Белогуров А.В., Иванов И.А., Зарайский А.Г. MOBILITY OF MORPHOGENIC SECRETED PROTEINS IN THE INTERCELLULAR SPACE OF DEVELOPING EMBRYO IS DETERMINED BY INTERACTION TO HEPARIN MATRIX Scientific Program & Abstract Book of 19th European Carbohydrate Symposyum Eurocarb, p. 413. http://www.eurocarb2017.com/images/site/book/LIBRO_COMPLETO_EUROCARB.pdf, - (год публикации - 2017)

6. - Российские учёные объяснили неравномерную окраску пятнистых животных Сайт РНФ, 20 февраля 2017метки: СМИ о Фонде и грантополучателях (год публикации - )

7. - Объяснено появление сложных узоров у животных Lenta.ru, 15:11, 20 февраля 2017 (год публикации - )

8. - Ученые из России выяснили, как возникли пятна на шкурах животных РИА Новости, 13:4020.02.2017 (обновлено: 17:37 20.02.2017) (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В отчетный период работа по проекту проводилась в основном в четырех направлениях. Во-первых, проверялась гипотеза от том, что обнаруженная ранее матриксная металлопротеиназа ММР3, экспрессия которой демонстрирует выраженную зависимость от общего размера эмбриона, ремоделируя внеклеточный матрикс влияет на диффузию морфогенов в межклеточном пространстве. Во-вторых, in silico было проведено исследование модели "expansion-repression". В-третьих, изучался механизм влияния ММР3 на эмбриональные индукторы и морфогены - Noggin и Chordin. В-четвертых, проводился анализ промоторной области гена ММР3 с целью выявления регуляторных элементов, ответственных за размер-зависимую экспрессию ММР3. По этим направлениям были получены следующие результаты. I. Используя две сильно отличающихся схемы измерения подвижности EGFP-меченного гепарин-связывающего пептида, нам не удалось зафиксировать изменения коэффициента диффузии этой конструкции ни в случае искусcтвенного уменьшения эмбриона, ни в случае нокдауна MMP3. Таким образом, мы установили, что (1) ремоделирование матрикса в результате действия MMP3 не затрагивает центры адсорбции, за счет которых происходит замедление движение большинства белков-морфогенов; (2) обнаруженные нами процессы скейлинга, происходящие в искуcственно уменьшенном эмбрионе осуществляются НЕ за счет изменения коэффициентов диффузии. II. С помощью компьютерного моделирования было проведено исследование широко обсуждаемой в литературе способной к скейлингу т.н. expansion-repression-модели. В результате было установлено, что в том случае, если такая модель проявляет способность к скейлингу, в ее состав всегда входят компоненты, концентрация которых резко меняется при изменении размеров системы. Данный вывод служит обоснованием подхода к поиску генов, регулирующих скейлинг, путем сравнения транскриптомов эмбрионов разного размера. III. Было установлено, что MMP3 "спасает" морфоген и эмбриональный индуктор осевых структур - Chordin от его деградации в результате действия другой металлопротеиназы - Xolloid. Поскольку в уменьшенных эмбрионах экспрессия MMP3 резко снижается и, следовательно, снижается интенсивность протекторного действия MMP3 на Chordin, это должно приводить к снижению количества белка Chordin, что неминуемо приведет к уменьшению масштаба дорсо-вентральной разметки эмбриона, определяемого количеством Chordin. Тем самым было подтверждено, что MMP3 действительно функционирует как регулятор эмбрионального скейлинга. IV. Были локализованы два участка промоторной области гена ММР3 (-500-376 и -376-200), ответственные за размер-зависимую регуляцию этого гена. Внутри первого участка был выявлен сайт связывания для транскрипционного фактора TCF3, являющегося участником бета-катенинового сигнального каскада. За отчетный период опубликовано две стати, одна из них в журнале квартили Q2, индексируемых в WoS, Scopus и РИНЦ. Кроме того, три статьи находятся на рецензии в журналах квартили Q1.

 

Публикации

1. А.М. Нестеренко, А. Г. Зарайский Mechanisms of embryonic scaling Russian Journal of Developmental Biology, - (год публикации - 2019)

2. Короткова Д.Д., Любецкий В.А., Иванова А.С., Рубанов Л.И., Селиверстов А.В., Зверков О.А., Мартынова Н.Ю., Нестеренко А.М., Терешина М.Б., Пешкин Л., Зарайский А.Г. Bioinformatic screening of genes present only in well regenerating vertebrates reveals novel FGF and purinergic signaling modulator - c-Answer. Cell Reports, - (год публикации - 2019)

3. Н.Ю. Мартынова, Е.А. Паршина, Л.В. Ермолина, А.Г. Зарайский The cytoskeletal protein Zyxin interacts with the zinc-finger transcription factor Zic1 and plays the role of a scaffold for Gli1 and Zic1 interactions during early development of Xenopus laevis Biochemical and Biophysical Research Communications, 504(1):251-256. (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2018.08.164.

4. Орлов Е.Е., Нестеренко А.М., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г. Targeted finding of size-sensitive genes by transcriptome profiling: matrix metalloproteinase-3 regulates scaling of the Xenopus laevis embryo Nature Communication, - (год публикации - 2019)

5. Терешина М.Б., Ерошкин Ф.М., Иванова А.С., Короткова Д.Д., Нестеренко А.М., Мартынова Н.Ю., Байрамов А.В., Соловьева Е.А., Зарайский А.Г. Xenopus laevis Prod1-like protein interacting with Agr2 is necessary for early forebrain and eye development as well as for the tadpole's body appendages regeneration. Genesis, - (год публикации - 2019)

6. - Ученые из России выяснили, как возникли пятна на шкурах животных РИА Новости, 20 февраля 2017, 13:40 (год публикации - )

7. - Ученые из России выяснили, как возникли пятна на шкурах животных Рамблер, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта имеют в основном научный фундаментальный характер и могут быть использованы в учебном процессе в вузах соответствующего профиля.