КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-14-00988

НазваниеМолекулярные механизмы CRISPR/Cas адаптации у бактерий

РуководительСеверинов Константин Викторович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное учреждение Институт молекулярной генетики Национального исследовательского центра "Курчатовский институт", г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2017 - 2018 

КонкурсКонкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-110 - Общая и молекулярная микробиология; вирусология

Ключевые словаCRISPR/Cas адаптация, E.coli, Cas1, Cas2

Код ГРНТИ34.15.23


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
CRISPR-Cas-системы адаптивного иммунитета прокариот состоят из CRISPR-кассет (участков генома с идентичными повторами и разделяющими их уникальными спейсерами) и генов cas. CRISPR-Cas-системы способны обеспечивать устойчивость клеток к бактериофагам и плазмидам. При заражении бактериофагами некоторые клетки, содержащие CRISPR-Cas-системы, встраивают участки фаговой ДНК в CRISPR-кассету в виде спейсеров. Эти участки ДНК фага называют протоспейсерами, а процесс захвата новых спейсеров - CRISPR-адаптацией. В ходе адаптации формируется иммунологическая «память», которая обеспечивает устойчивость за счет направленного уничтожения генетического материала фага при повторном заражении. В результате процессинга первичного транскрипта CRISPR-кассеты, формируются зрелые CRISPR-РНК (крРНК), каждая из которых содержит один спейсер, фланкированный фрагментами повторов. Зрелая крРНК вместе с белками Cas формирует эффекторный комплекс, распознающий чужеродный генетический материал за счёт образования комплементарных пар между спейсером крРНК и протоспейсером мишени. Это приводит к расщеплению и деградации фаговой ДНК (в некоторых случаях РНК) Cas нуклеазами. Процесс уничтожения чужеродных нуклеиновых называется CRISPR-интерференцией. В настоящее время описано 2 класса и, по крайней мере, 6 различных типов. Детали и мишени CRISPR-интерференции и CRISPR-адаптации принципиально различаются в системах разных классов и типов. По-видимому, существенные различия имеются и между системами – представителями одного типа, но вопрос этот в настоящее время изучен недостаточно. Специфичность эффекторного комплекса к той или иной последовательности определяется всего лишь одной молекулой – крРНК. Эта особенность лежит в основе революционной технологии редактирования геномов с помощью CRISPR-Cas систем. Количество статей по использованию CRISPR-Cas систем для редактирования различных геномов растет экспоненциально. Активно ведутся работы по поиску и описанию новых CRISPR-Cas систем, а также выяснению биологической роли и молекулярных механизмов действия различных CRISPR-Cas систем в прокариотах и их роли в ограничении горизонтального переноса генов. Наш проект направлен на уяснение молекулярных деталей процесса CRISPR-адаптации. Проект 2017 является продолжением и развитием Проекта 2014 и предполагает изучение in vivo интермедиатов процесса наивной и праймированной адаптации в различных CRISPR-Cas системах Проект2017 будет выполняться как с использованием подходов, разработанных в ходе проекта 2014, так и с применением нового мощного метода трансформации/адаптации, который появился в середине 2016 года. План работы на дополнительные два года включает в себя два принципиальных направления исследований: первое заключается в развитии понимания детальных механизмов праймированной и наивной адаптации CRISPR-Cas системой типа I-E у Escherichia coli; второе направление ставит целью изучение процесса CRISPR-адаптации в других CRISPR-Cas системах, включая недавно открытые и подтвержденные нами системы второго класса и дополнительные предсказанные системы, которые еще экспериментально не подтверждены. Кроме очевидной фундаментальной значимости наш проект внесет вклад в развитие биотехнологии, так как направлен, в том числе, на изучение новых CRISPR-Cas систем.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения Проекта 2017 планируется получить следующие принципиальные, абсолютно новые результаты: 1. Будут получены данные, подтверждающие выдвинутую нами в ходе выполнения Проекта2014 модель праймированной CRISPR-адаптации в системе типа I-E у E.coli, а именно то, что фрагменты расщепления нуклеазой/хеликазой Cas3 служат субстратом для Сas1-Cas2 адаптационного комплекса. Будут определены границы продуктов расщеплeния Cas3, инициированных из «интерференционного» и «праймирующего» эффекторного комплексов, определена временная динамика накопления различных продуктов и их стабильность, а также получены данные об их структуре (полная или частичная двух/одноцепочечность). 2. Будут определены требования к длине и структуре олигонуклеотидов, способных встраиваться в CRISPR-кассету в условиях праймированной адаптации под действием CRISPR-Cas системы типа I-E у E. coli, и выяснено, как влияет наличие PAM последовательности и ее вариантов, а также продуктов отдельных cas генов на способность к адаптации олигонуклеотидов. 3. Будут определены детерминанты нуклеотидной последовательности, определяющие предпочтительность выбора протоспейсеров для встраивания в CRISPR-кассету в качестве будущих спейсеров. 4. Будут получены данные об эффективности процесса CRISPR-адаптации, ориентации встроенных спейсеров и их структуре в системе типа II из Streptococcus pyogenes (Cas9 эффектор), системе типа V из Alicyclobacillus acidoterrestris (C2c1 эффектор) и работающей по РНК мишеням системе типа VI из Leptotrichia shahii (C2c2 эффектор), а также возможно в системе типа III, данные по CRISPR-адаптации в которой вообще отсутствуют. 5. Будет оценено влияние эффектора/компонентов интерференционного комплекса на CRISPR-адаптацию в системах типов II, V, VI. Имеющиеся данные позволяют утверждать, что в системах типа II эффектор Cas9 участвует в выборе PAM последовательностей протоспейсеров, которые используются для встраивания в кассету [Marrafini,2016]. Будет ли наблюдаться что-то подобное в экспериментах по трансформации/адаптации не известно. Данных по системам с эффекторами C2c1 и C2c2 не имеется, наши результаты, таким образом, будут совершенно новыми и могут привести к самым неожиданным открытиям. 6. Будет проведена проверка возможности CRISPR-адаптации в результате естественной трансформации клеток T. thermophilus и S. thermophilus. Если нам удастся показать попадание внеклеточной ДНК в CRISPR-кассеты, результат окажет значительное влияние на понимание возникновения и экспансии CRISPR-кассет. Полученные результаты будут новыми и оригинальными и, несомненно, будут иметь принципиальное значение для понимания фундаментальных аспектов процесса CRISPR-адаптации и его связи с CRISPR-интерференцией в разных CRISPR-Cas системах. Результаты так же позволят разработать подходы для слежения за судьбами отдельных бактерий в популяции по наличию у них индивидуальных спейсеров, что может иметь важное значение в биотехнологии, в частности для обеспечения сохранения объектов интеллектуальной собственности на бактериальные штаммы продуценты. В целом, результаты Проекта 2017 года будут являться естественным продолжением Проекта 2014 года, они разовьют полученный ранее задел с учетом новых данных и закрепят лидирующее положение российской группы в стремительно развивающейся области.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Конкретные научные результаты по проекту отражены в трех научных публикациях в рейтинговых международных журналах. B работе Savitskaya и сотр. показано, что в отличие от ожидаемого быстрого кругооборота CRISPR-спейсеров, приобретенных в ходе локальной адаптации бактерий к вирусам, в случае E. coli свидетельств существенного изменения набора спейсеров не обнаруживается даже при сравнении спейсеров современных изолятов и образцов, извлеченных из кишечника мамонта, погибшего около 42 тысяч лет назад. Полученный результат позволяет предполагать, что имеется коровый набор спейсеров, который сохраняется на длительных интервалах и, по-видимому, не связан с адаптацией к вирусам и другим мобильным генетическим элементам. Практическое отсутствие среди спейсеров E. coli последовательностей, соответствующим последовательностям известных на сегодня бактериофагов, заражающих эту бактерию, согласуется с такой точкой зрения. В работе Strotskaya и сотр. была систематически исследована способность клеток E. coli, содержащих генноинженерно полученные спейсеры, специфичные к различным участкам геномов “классических” бактериофагов, таких, как лямбда, Т4, Т5 и Т7, ограничивать течение инфекции. Были получены оригинальные результаты, показывающие, что стратегия развития фага может влиять на эффективность действия CRISPR-интерференции даже в отсутствии специализированных анти-CRISPR белков. Кроме того, был получен принципиальный результат, показывающий, что при заражении клеток E. coli литическими фагами, зараженные клетки погибают даже в присутствие CRISPR ответа. Однако, в отличие от ситуации в отсутствие активации CRISPR, зараженные клетки не производят вирусного потомства. Таким образом, CRISPR-Cas системы не являются иммунными системами, а представляют собой частный случай альтруистических систем абортивной инфекции. Полученный результат обьясняет отмеченное выше отсутствие следов адаптивных (происходящих из вирусов) спейсеров, так как их носители, которые приобрели такие спейсеры в ходе заражения, оказываются не способны передать их потомству. Заключительная опубликованная работа про проекту, Musharova и сотр., описывает результаты анализа процесса праймированной адаптации в E. coli. В работе охарактеризованы интермедиаты, возникающие из ДНК-мишени в ходе интерференции и в ходе адаптации. Получен неожиданный результат о том, что фрагменты протоспейсеров, выбранные для встраивания в CRISPR-кассету, не представляют собой стандартную двуцепочечную ДНК. Этот результат не вполне согласуется с имеющимися данными, полученными in vitro и требует дальнейшего уточнения. Работы в этом направлении будут вестись в 2018 году.

 

Публикации

1. Мушарова О. С., Климук Е. И., Даценко К., Метлицкая А. З., Логачева М., Семенова Е., Северинов К. В., Савицкая Е. Е. Spacer-length DNA intermediates are associated with Cas1 in cells undergoing primed CRISPR adaptation Nucleic Acids Research, Vol. 45, No. 6 3297–3307 (год публикации - 2017).

2. Савицкая Е. Е., Лопатина А., Медведева С., Капустин М., Шмаков С., Тихонов А., Артамонова , Северинов К. В. Dynamics of Escherichia coli type I-E CRISPR spacers over 42 000 years Molecular ecology, 26(7):2019-2026 (год публикации - 2017).

3. Строцкая А. В., Савицкая Е. Е., Метлицкая А. З., Морозова Н., Даценко К., Семенова Е., Северинов К.В. The action of Escherichia coli CRISPR–Cas system on lytic bacteriophages with different lifestyles and development strategies Nucleic Acid Reseach, 45(4):1946-1957. (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Изучено влияния последовательности протоспейсера на эффективность его использования в качестве спейсера в условиях праймированной и наивной CRISPR адаптации E. coli. Для этого проведен исчерпывающий биоинформатический анализ спейсеров, встраиваемых в CRISPR кассеты с различной эффективностью, и определена эффективность встраивания отдельных членов библиотек трансформируемых олигонуклеотидов-преспейсеров, созданных на основе последовательностей “горячих" протоспейсерах с введением различных замен. Также проведен «обратный» анализ “холодного", мало используемого протоспейсера для выявления изменений последовательности, которые приводят к повышенной эффективности адаптации. Кроме того, на основании полученных результатов и методов машинного обучения создана модель, которая надежно предсказывает эффективность адаптации различных последовательностей в CRISPR кассеты E. coli. Проведены опыты по трансформации Е. coli с индуцированной CRISPR-Cas системой продуктами деградации ДНК под действием нуклеазы-хеликазы Cas3 и проведен анализ спейсеров, встроившихся в CRISPR-кассету после такой трансформации. Анализ спейсеров, встроенных в кассету после трансформации, показал, что они не имеют отношения к продуктам деградации Cas3, детектированным in vitro. Полученный результат дает основания утверждать, что продукты деградации ДНК под действием нуклеазы-хеликазы Cas3 не могут рассматриваться, как прямые источники (преспейсеры) для комплекса Cas1-Cas2, осуществляющего инсерцию новых спейсеров в CRISPR кассеты. С использованием оригинальной системы CRISPR-интерференции, в ходе которой эффекторный комплекс Cascade узнает протоспейсер, расположенный в геноме E. coli, проведено высокоэффективное секвенирование коротких фрагментов ДНК, накапливающихся в клетках, в которых происходит праймированная адаптация. Работа выполнена в сотрудничестве с профессором Bryce Nickels из университета Ратгерса, США. В результате установлена точная структура преспейсеров, накапливающихся в цитоплазме клеток в процессе праймированной адаптации. В сотрудничестве с группой Michael Terns (университет Джорджии в Атланте, США) проведен анализ малых фрагментов ДНК в клетках археи Pyrococcus furiosus, в которых идет праймированная адаптация системой типа I-B. Также подготовлены к анализу образцы ультракоротких ДНК в клетках Thermus thermophilus, зараженных выделенным в нашей лаборатории фагом phiKo, и находящихся в состоянии адаптации под действием системы типа III. Проведен исчерпывающий in vitro и in vivo анализ праймирующих и интерферирирующих комплексов Cascade E. coli с различными протоспейсерами и последовательностями PAM для выяснения, существуют ли недавно предложенная группой Финнерана (Peter Finneran) особая форма адаптации, не связанная с интерференцией, или же праймированная адаптация есть простое следствие замедленного накопления продуктов интерференции в условиях неполного узнавания мишени, как предложено в наших работах. Полученные результаты позволяют уверенно утверждать, что праймированная адаптация, вызванная интерференцией, является единственной формой адаптивного и направленного встраивания спейсеров из чужеродной ДНК. Для изучения действия CRISPR-Cas системы типа III у Т. thermophilus созданы новые экспериментальные модели на основе инфекции бактериофагами клеток, содержащих введенные генноинженерными методами спейсеры, специфичные к этим бактериофагам. Показано, что в зараженных культурах происходит адаптация в кассеты системы типа III, что впервые открывает возможности для механистического изучения этого процесса.

 

Публикации

1. Krivoy A., Rutkauskas M., Kuznedelov K., Musharova O., Rouillon C., Severinov K., Seidel R. Primed CRISPR adaptation in Escherichia coli cells does not depend on conformational changes in the Cascade effector complex detected in Vitro Nucleic Acids Reseach, 46(8):4087-4098. (год публикации - 2018).

2. Martynov A., Severinov K., Ispolatov I. Optimal number of spacers in CRISPR arrays PLOS COMPUTATIONAL BIOLOGY, 13(12): e1005891. (год публикации - 2017).

3. Musharova O., Vyhovskyi D., Medvedeva S., Guzina J., Zhitnyuk Y., Djordjevic M., Severinov K., Savitskaya E. Avoidance of Trinucleotide Corresponding to Consensus Protospacer Adjacent Motif Controls the Efficiency of Prespacer Selection during Primed Adaptation MBio, 9(6). pii: e02169-18 (год публикации - 2018).

4. You L., Ma J., Wang J., Artamonova D., Wang M., Liu L., Severinov K., Zhang X.,Wang Y. Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference Cell, Available online 29 November 2018 (год публикации - 2018).

5. Лопатина А.А., Медведева С.А., Артамонова Д.Н., Колесник М., Ситник В., Исполатов Я., Северинов К.В. Natural Diversity of CRISPR Spacers of Thermus: Evidence of Local Spacer Acquisition and Global Spacer Exchange Philisophical transactions of the royal society B, - (год публикации - 2019).

6. Савицкая Е.Е., Выговский Д.Р., Мушарова О.С., Медведева С.A., Северинов К.В Специфичность выбора спейсеров при CRISPR-адаптации в CRISPR-Cas системе I-E типа у Escherichia coli Молекулярная генетика, микробиология, вирусология, №1, 51-52 (год публикации - 2018).


Возможность практического использования результатов
В настоящее время получают технологии хранения информации на биологических носителях, в частности в виде спейсеров CRISPR-кассет. Полученные нами данные о деталях механизмов CRISPR-адаптации в системах разных типов будут лежать в основе развития и усовершенствования данных технологий.