Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017 году успешно проведен сбор губок Halisarca dujardini, Leucosolenia complicata, Sycon ciliatum, отработаны условия их культивирования, проведены эксперименты по репаративной регенерации фрагментов тела, реагрегации клеток, а также фиксации материала для ультраструктурных и молекулярно-биологических исследований. Исследованы морфогенезы и поведение клеток в ходе реагрегации клеток у губок, клеточная пролиферация в ходе реагрегации клеток и регенерации с помощью меченных нуклеотидов (EdU). Проведен биоинформационный анализ транскриптомных баз данных по аннотации компонентов Wnt и FGF/RTK сигналинга у Halisarca dujardini и Platynereis dumerilii с последующим филогенетическим анализом последовательностей и подтверждающим клонированием некоторых наиболее перспективных лигандов и рецепторов. Отработаны условия и методы для (1) прижизненной микрофотосъемки, цейтраферной видеосъемки процессов развития и репаративной регенерации у губок и аннелид, (2) прижизненной флуоресцентной окраски клеток губок с помощью DiI и Hoechst 33342, (3) визуализации клеток в состоянии апоптоза с помощью меток TUNEL и CellEvent Caspase-3/7 Green ReadyProbe, (4) выделения суспензий клеток отдельных типов методами центрифугирования в градиенте плотности и проточной цитометрии с сортировкой у Halisarca dujardini, (5) тестирования имеющихся антител к рекомбинантному бета-катенину H. dujardini с помощью вестерн-блоттинга. В результате первого года работы по проекту получены следующие основные результаты. 1. Описаны основные стадии и динамика процессов реагрегации клеток и последующей регенерации из многоклеточных агрегатов у Leucosolenia complicata, Sycon ciliatum (класс Calcarea) и Halisarca dujardini (класс Demospongiae) что позволило впервые составить общую картину протекания данного процесса у губок. 2. Получены новые сведения о строении и клеточном составе основных стадий реагрегации (первичные многоклеточные агрегаты, ранние примморфы, настоящие примморфы), а также о морфогенезах и поведении клеток, которые сопровождают развитие многоклеточных агрегатов L. complicata. 3. Описаны дифференцировки и трансдифференцировки клеток, а также явления пролиферации и клеточных перемещений на протяжении всего процесса реагрегации клеток H. dujardini и L. complicata. Была выявлена значительная разница в пролиферации клеток в ходе реагрегации этих губок. 4. Оценены морфогенетические потенции и судьба отдельных клеточных типов. 5. Описаны морфогенезы, сопровождающие восстановление целого организма из диссоциированных клеток. На начальных этапах реагрегации характерна массовая дедифференцировка большинства типов клеток губок. Дальнейшее развитие агрегатов сопровождается трансдифференциацией, мезенхимо-эпителиальными переходами и эпителизацией поверхности агрегатов. Морфогенезы, обеспечивающие, эпителизацию поверхности примморфов значительно отличаются у Calcarea и Demospongiae. К их сходствам у Calcarea и Demospongiae можно отнести участие в этом процессе хоаноцитов, трансдифференцирующихся в экзопинакоциты. Интенсивность пролиферации в ходе реагрегации Calcarea и Demospongiae значительно различается: у H. dujardini клетки делятся на всех этапах реагрегации, а у L. complicata клеточная пролиферация не наблюдается ни на одной из стадий развития агрегатов. 6. Подобраны методы изоляции отдельных типов клеток у губки H. dujardini. Наиболее производительным методом является центрифугирование в градиенте плотности перколла со ступенями 10/20/25/30/35/45% и ускорении центрифугирования 800g в течение 20 мин. Это позволит сравнить белковые профили каждого из типов клеток и идентифицировать маркеры каждого из клеточных типов. 7. Получены новые для науки данные по прижизненным наблюдениям над репаративной регенерацией небольших фрагментов тела и проведено стадирование этого процесса у L. complicata и S. ciliatum. Также впервые описаны на электронно-микроскопическом уровнях основные стадии и процессы, проходящие при репаративной регенерации указанных видов. Описаны тонкие механизмы морфогенеза и трансдифференциации клеток при регенерации этих губок. 8. Выявлены клеточные источники регенерации известковых губок и восстановления полноценного тела из экстирпированных оскулярных трубок губки Halisarca dujardini. Оценены способности различных клеточных типов губок к дифференцировкам, трансдифференцировкам, миграциям и пролиферации. Заживление известковых губок включает в себя 3 этапа: 1) выравнивание краев раны, 2) формирование регенеративной мембраны (РМ), 3) восстановление исходного строения стенки тела. Регенерация L. сomplicata и S. ciliatum идет по типу морфаллаксиса, когда утраченные части тела замещаются за счет ремоделлинга оставшихся тканей. Пролиферация клеток не играет важной роли. Основными морфогенетическими механизмами в ходе регенерации являются растягивание, уплощение и слияние эпителиальных пластов. Эта регенерация сопровождается трансдифференциацией дифференцированных клеток в районе раны. Основным источником новой экзопинакодермы является интактная экзопинакодерма, а новой хоанодермы – интактная хоанодерма, окружающие рану. Клетки мезохила не принимают участия в регенерационных процессах. Во время регенерации S. ciliatum проявляется четкая аксиализация, которая проявляется в разной скорости и последовательности морфогенетических процессов на разных полюсах (апикальных и базальных) раны. 9. При регенерации оскулярной трубки Halisarca dujardini пролиферация клеток поддерживается на низком уровне и почти исключительно в хоаноцитах. Данная регенерация происходит с сохранением попавших в регенерат элементов водоносной системы. 10. Нами также впервые изучены и описаны морфогенезы и клеточные источники бесполого размножения по типу почкования у Haliclona fulva (Demospongiae). 11. Проанализирован транскриптом губки H. dujardini: для Wnt-сигналлинга идентифицированы 10 лигандов, 5 рецепторов Frizzled, 3 растворимых формы рецептора – ингибиторы (sFRP), 1 полноценный корецептор LRP и 3 LRP-подобных белка, а также участники внутриклеточного проведения сигнала (dishevelled, axin, APC, GSK3beta, beta-catenin, TCF/Lef, Groucho). Гомологи H. dujardini не кластеризуются с семействами соответствующих Wnt, описанными у других Metazoa. Лигандов типа FGF в транскриптоме не обнаружено, но их рецепторы, имеющие Ig-подобные повторы во внеклеточной части и тирозинкиназный домен – в цитоплазматической, представлены двумя последовательностями. Это позволяет предположить, что лиганды возникли в эволюции позже, как надстройка молекулярного механизма сигнализации. 12 .На полихете A. virens показано участие основных клеточных линий в построении ларвального тела. Особую роль в данном процессе играют бластомеры, называемые первым и вторым соматобластами. Претерпевая череду стереотипных делений на ранних стадиях дробления, они дают клетки основной массы эктодермы и мезодермы туловища. Cледует отметить, что при формировании тела личинки телобластический способ делений бластомеров выражен очень слабо и только на ранних этапах дробления. В результате активной пролиферации потомков второго и третьего квартетов микромеров формируется материал вентральной и латеральных сторон туловища, включая нейроэктодерму, хетоносные мешки и стомодеум. Дальнейшее развитие и метаморфоз состоит в образовании и специализации всех дефинитивных органов и частей тела. Морфогенезы при этом имеют преимущественно эпителиальный характер. 13. Анализ клеточной пролиферации у A. virens показал сложную и быстро меняющуюся картину в ходе личиночного развития. У трохофор и ранних метатрохофор наблюдается более равномерное распределение клеток в S-фазе и митозе с преобладанием метки в покровных тканях вентральной стороны тела. У средних метатрохофор отмечается снижение интенсивности мечения покровов 1го и 2го сегментов, но с активной пролиферацией в задних областях тела. При переходе к стадии нектохеты обособляется медиальная зона меченых ядер нейроэктодермы и развивающейся средней кишки. Наиболее интенсивно у нектохет метка включается в передней части пигидия. Маркеры митоза чаще выявляются в медиальной нейроэктодерме, основании параподий и пигидии. Развитие стомодеума, пигидиальных лопастей и цирр лишь на начальных этапах сопровождается локальной наработкой клеточного материала. Позднее морфогенез указанных зачатков идет в отсутствие активной пролиферации. Рост латеральных участков простомиума, нейроэктодермы, кишки и параподий на всем протяжении личиночного развития связан с локальными центрами вступления клеток в митоз. У нетохет перед завершением метаморфоза метка ДНК встречается почти исключительно в предпигидиальной области, вероятно, отражая появление материала новых постларвальных сегментов. Т. о., наши данные говорят о существовании транзиторных зон активных клеточных делений, которые обуславливают формообразовательные процессы и по-разному соотносятся с ними во времени. В случае регенерации A. virens метка предшественников ДНК активно включается в ткани прилежащего к ране сегмента уже в первый день, а затем и регенерата. Т. о, процессы закрытия раны не связанны с интенсивной пролиферацией покровных клеток. Клетки бластемы, вероятно, происходят из прилежащих к ране мезодермальных тканей. Дальнейшее развитие регенерата идет преимущественно за счет локальных делений клеток бластемы и покровов. 14. Анализ постэмбриональных морфогенезов у олигохеты P. longiseta говорит о возможном участии на начальных этапах формирования зоны паратомии мигрирующих клеток и значительной роли покровного эпителия. В зоне деления мышечная система претерпевает локальные изменения, образуя бреши. Клетки покровов теряют признаки дифференцированных и переходят в вентролатеральные бластемные скопления, с клетками которых они обнаруживают значительное сходство на уровне ультраструктуры. 15. Результаты анализа in silico говорят о сохранении анцестрального репертуара участников Wnt и FGF/RTK сигналинга у P. dumerilii. Дополнительно к данным открытых баз данных об основных участниках канонического Wnt - beta-catenin сигналинга, в неаннотированной базе транскриптомных и черновых геномных данных нам удалось идентифицировать и охарактеризовать последовательности, кодирующие гомологи Dickkopf и Groucho/TLE. Гомологов Cerberus и Shisa, ингибиторов Wnt пути, известных только для позвоночных, нами обнаружено не было. При поиске компонентов слабо изученного у беспозвоночных FGF/RTK пути обнаружены еще два паралога FGFR, вероятно FGFR2 и FGFR3. 16. Секвенирован и собран транскриптом олигохеты E. coronatus, позволяющий в дальнейшем анализировать различными методами возможное участие целого набора генов в реализации механизмов морфогенезов. В ходе первого года, опубликовано две статьи в международных журналах WoS/Scopus, две статьи в материалах всероссийской конференции, две он-лайн публикации в интернет-журнале, а также 6 тезисов докладов на международных конференциях. Подготовлено две рукописи к публикации в международных журналах WoS/Scopus, по восстановительным морфогенезам у губок, обе из которых будет входить в квартиль Q1 WoS/Scopus. Полученные материалы доложены на двух международных конгрессах, всероссийской конференции с международным участием и на двух всероссийских конференциях в одном приглашенном докладе, 8 устных и 5 стендовых сообщениях.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Активность пролиферации и ее значение было подробно изучено в экспериментах по удалению заднего конца тела полихеты Alitta virens. Мы наблюдали эпиморфное развитие новых терминальных структур исключительно за счет размножения примыкающих к ране клеток. Статистический анализ показал наиболее интенсивный прирост количества клеток в первые 3 дня после ампутации. Формирование регенерационной почки (1-2 дня) связано с появлением в области раны активно делящихся клеток покровного эпителия и бластемы. Изменение характера мечения на этом сроке сопровождается массовым вступлением в митотический цикл клеток в покровах животного на границе раны. На основе полученных данных можно предположить наличие у A. virens процессов локальной дедифференцировки клеток, входящих в состав старого сегмента. Этот процесс, равно как и активизация движения клеток по митотическому циклу, скорее всего, обусловлен появлением сигнального центра на месте смыкания кишечного и покровного эпителиев. 2. Гомеодомен-содержащие транскрипционные факторы играют важнейшую роль в развитии многоклеточных животных путем регуляции экспрессии тысяч других генов. Гомеодомен – консервативный участок пептидной цепи протяженностью 60 аминокислотных остатков. Гомеодомен высококонсервативен, т.к. отвечает за связывание транскрипционного фактора с ДНК. Среди гомеодомен-содержащих белков выделяют множество семейств, наиболее известно среди которых Antennapedia, объединяющее классы генов Hox, ParaHox и NKL. Эти гены отвечают за спецификацию передне-задней оси и дифференцировку разных клеточных типов у билатерально-симметричных животных. Многие из генов Antennapedia локализованы в кластер в составе генома, что во многом отражает их эволюционную историю. Для губок, низших многоклеточных, информация о наборе генов Antennapedia, их организации в геноме, и предположительных функциях, известна лишь для демоспонгии Amphimedon queenslandica. Мы предприняли попытку охарактеризовать набор и экспрессию этих генов, управляющих развитием, у демоспонгии Halisarca dujardinii с целью прояснить ранние этапы эволюции программ развития. Было обнаружено, что в транскриптоме у H. dujardinii присутствуют продукты экспрессии 58 гомеобокс-содержащих генов, из которых пятнадцать относятся к классу Antennapedia. Среди них обнаружены представители кластеризованных и диспергированных генов семейства NKL. Hox-гены не были обнаружены, как и у других губок, что говорит об их появлении у стрекающих, либо об их вторичной утрате у губок. 3. Поиск потенциальных участников индукционных процессов был продолжен биоинформационными методами. Анализ геномных и транскриптомных данных у модельных объектов настоящего проекта выявил богатство и ряд уникальных особенностей в наборе многих важнейших генов-регуляторов морфогенеза. У олигохеты Enchytraeus coronatus выявлено не менее 59 генов, относящихся ко всем группам подклассов HOXL (Hox и Parahox) и NKL (Nkx) класса ANTP. В большинстве случаев для E. coronatus показано существование нескольких паралогов. В ряде случаев определена вероятность существования нескольких изоформ гена. Полученные нами новые приоритетные данные (в совокупности с находящимися в открытых базах и ранее опубликованными) говорят о ярко выраженной тенденции к увеличению в геноме числа генов класса ANTP в ряду олигохеты-пиявки, в отличие от разнообразных таксонов полихет. Для нереидных полихет показано наличие гомологов 12 типов лигандов Wnt (Козин и др., 2019), тогда как у олигохеты E. coronatus обнаружено только 7. При этом для всех групп, кроме Wnt1 и Wnt2 у E. coronatus обнаружено по 2-3 паралога. В результате выполнения проекта нами были идентифицированы и частично клонированы гены, кодирующие компоненты Wnt и FGF/RTK сигналинга у аннелид. Для нереидных полихет выявлено по 2 гена-кандидата FGF (отнесенных по филогенетическому анализу к семейству FGF8/17/18), а также по 1 участку FGF-like в протяженных мультидоменных последовательностях. Наши результаты позволяют сделать вывод о преимущественно независимой эволюции FGF-лигандов у крупных таксонов Metazoa. Набор соответствующих генов мог пополняться или претерпевать вторичные утраты у каждого типа животных. Это утверждение удалось подкрепить новыми данными и распространить на всех первичноротых, включая Spiralia. Вместе с тем, филогенетические отношения и известные функциональные данные свидетельствуют о принципиальной роли семейства FGF8/17/18 в эволюции морфогенетических процессов. 4. Экспрессия Wnt1 и его консервативного гена-мишени FoxA, а также комплементарные результаты по распределению белка beta-катенина были описаны у нереидных полихет на протяжении эмбрионального и личиночного развития (Козин и др., 2019; Kostyuchenko et al., 2018). Обнаружена приуроченность канонического Wnt сигналинга к вегетативному/заднему полюсу тела. Ингибиторным анализом установлено принципиальное значение Wnt в определении переднезадней полярности и управлении морфогенезом эктодермальных производных. 5. В ходе развития и регенерации у губок происходят такие процессы, как дедифференцировка клеток, их миграции, апоптоз, фагоцитоз и снова дифференцировка. В связи с изменением морфологии клеток и их перемещением, отследить их судьбу и поведение в морфогенезе невозможно без специфичных молекулярных маркеров. Такими маркерами могут быть белки, специфически синтезируемые в том или ином типе клеток. С помощью сравнения транскриптомов клеток разных типов губки H. dujardinii были выявлены гены, специфически экспрессирующиеся в хоаноцитах, археоцитах и гранулярных клетках. Отдельные типы клеток изолировали диссоциируя губку на клетки в бескальциевой морской воде с последующим центрифугированием в градиенте плотности. Та же задача параллельно решалась с помощью разностного электрофореза (2D-DIGE) и масс-спектрометрии белков, выделенных из тех же фракций клеток. Были отобраны кандидаты на роль маркеров разных клеточных типов. 6. При диссоциации взрослой губки, полученные клетки способны формировать агрегаты – примморфы, развивающиеся впоследствии во взрослую губку. Молекулярно-генетические механизмы, регулирующие этот сходный с развитием процесс, неизвестны. Нами впервые были секвенированы транскриптомы примморф на разных стадиях развития, выявлены количественные отличия в экспрессии генов на разных стадиях. Показано, что наибольшая разница в профилях экспрессии наблюдается через 24 ч и 7 дней после диссоциации губки H. dujardinii на клетки. Морфологическими методами показано, что на этих стадиях происходят события апоптоза/дедифференцировки и дифференцировки клеток, соответственно. 7. В рамках выполнения проекта в 2018 году были исследованы разнообразные восстановительные процессы у известковых губок. Впервые был исследован процесс репаративной регенерации стенки тела губки Clathrina arnesenae с использованием гистологических и ультраструктурных методов; получены первые данные по морфогенезам и поведению клеток, лежащих в основе этого процесс. Также впервые был проведен детальный анализ процесса реагрегации клеток и восстановления исходной организации животного после диссоциации тканей у двух видов губок – Sycon ciliatum и Clathrina arnesenae. Сравнение этих данных с ранее полученными данными по реагрегации клеток Leucosolenia variabilis позволит выявить общие закономерности протекания морфогенезов и поведения клеток при реагрегации у представителей класса известковых губок. В сотрудничестве со специалистами из l’Institut des Sciences de l’Evolution de Montpellier, Université de Montpellier (университет Монпелье, Монпелье, Франция) был отработан протокол и начаты исследования роли апоптоза в восстановительных процессах у известковых губок.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году нами были получены следующие приоритетные научные результаты. Для исследуемых аннелид (полихеты Alitta virens и олигохеты Enchytraeus coronatus) идентифицированы в транскриптомах, аннотированы и клонированы дополнительные компоненты и вероятные гены-мишени Wnt и FGF/RTK, кодирующие ТФ-регуляторы морфогенезов (En, Bra, Rnt, Twi). Анализ экспрессии отдельных гомологов cdx, передних, средних и задних Hox-генов, а также Nk-генов методом гибридизации in situ для E. coronatus показал, что ни один из них не экспрессируется на стадиях дробления, до начала гаструляции. Наиболее ранняя экспрессия отмечена для ортолога cdx в районе бластопора. Экспрессия Нох-генов, за несколькими исключениями, происходит с соблюдением принципа колинеарности. Большинство исследованных Нох-генов экспрессируется в материале нервной системы, начиная задолго до ее формирования на вентральной стороне. Таким образом, экспрессия Нох-генов сопровождает процессы массового перемещения клеток в ходе гаструляции и органогенеза. При этом наблюдается переднезадний градиент величины доменов и активности экспрессии. Некоторые гены, главным образом из средней группы, начинают экспрессироваться в мезодерме, демонстрируя сходный градиент. При этом они активируются и в эктодерме, но с задержкой во времени. Практически все исследованные средние и задние гены, активны в зоне роста в конце эмбрионального развития. Сравнивая паралогичные гены можно сделать вывод, что у них могут быть разные функции во времени и пространстве. У ювенильных животных уровень экспрессии резко падает, однако он вновь возрастает в ходе передней и/или задней регенерации. Большинство генов активируются в материале бластемы, как передней, так и задней, а также в зоне роста. Данные об экспрессии Нох-генов при передней регенерации аннелид являются приоритетными. В продолжение исследований по определению роли Wnt у полихеты A. virens было описано распределение эффекторного белка β-катенина на ранних этапах эмбриогенеза (Козин и др., 2019а, б), а также проведены комплементарные эксперименты по модуляции Wnt/beta-cat с подсчетом соотношения фенотипов. Обнаруженная нами асимметричная локализацией β-катенина во время спирального дробления имеет существенное значение для детерминации клеточной судьбы, закладки дефинитивных осей симметрии и, в меньшей степени, для паттернирования осей и зачатков. Выявленные на предшествующем этапе проекта гены-кандидаты FGF-сигналинга (Шалаева и др., 2019) были изучены на предмет экспрессии после ампутации заднего конца тела у A. virens. Лиганд и рецепторы FGF активировали свою транскрипцию уже в первые сутки после ампутации. Преимущественно экто- или мезодермальная тканеспецифичность сигнала мРНК позволяет говорить о потенциальной компетенции к FGF всех тканей, вовлеченных в эпиморфную регенерацию. В экспериментах по ингибированию сигнала FGF было отмечено, что подавление пролиферации имеет дозозависимый и обратимый эффект (Шалаева, Козин, 2019). Полученные данные являются первым в мире свидетельством функционирования FGF у представителей клады Spiralia. На пролиферацию у регенератов и личинок A. virens также влияет путь Wnt. В экспериментах с фармакологическими ингибиторами был достигнут ярко выраженный разнонаправленный эффект (Козин, 2019, Козин и др., 2019). Наиболее существенное значение регуляция со стороны Wnt имеет в производных гипосферы, т.е. сегментах туловища и пигидии, и к тому же зависит от положения клетки вдоль переднезадней оси. Полученные на регенерирующих червях количественные данные по динамике пролиферации говорят о значительной гетерогенности клеточных популяций в раневой зоне. Была изучена экспрессия гомеобокс-содержащих генов класса POU у губки Halisarca dujardini (кл. Demospongiae), гомологов одного из регуляторов плюрипотентности – Oct4. Показаны различия в уровнях экспрессии данных генов в разных частях губки, в клеточных типах (хоаноцитах, археоцитах, сферульных клетках), и их изменение в ходе развития примморф из диссоциированных клеток. Обнаружены POU-гены, экспрессия которых ощутимо меняется в ходе развития примморфы. Аннотированы транскрипты, специфичные для разных клеточных типов губки – хоаноцитов, археоцитов, сферульных клеток. Показано, что в разных клеточных типах по числу экспрессирующихся генов преобладают гены с разными функциями. Так, в хоаноцитах большинство транскриптов среди наиболее представленных, связаны с регуляцией клеточного цикла, митозом и структурами ядра. Для многих белков губок в ходе анализа не удается установить гомологию с описанными последовательностями, или найти консервативные домены. Это продукты taxon-restricted genes – генов, получивших экспансию в разных типах беспозвоночных, и, возможно, послуживших основой их разнообразию. Также нами описан на структурном уровне ранее неизвестный мажорный белок поверхностных клеток личинки губки H. dujardini (Borisenko et al. 2019). Белок участвует в энергетическом метаболизме, способен связывать кальций, и распространен среди животных от губок до иглокожих, хотя ранее его гомологи не описывались. Мы предполагаем его участие в метаморфозе личинки, связывая с активностью жгутиковых клеток. Было показано, что восстановление скелета на поздних стадиях регенерации C. arnesenae происходит иначе, чем у ранее изученной Leucosolenia variabilis. Так, скелет C. arnesenae в месте ранения восстанавливается не за счет синтеза новых спикул, а за счет перемещения в раневую область ранее синтезированных спикул из прилежащих интактных тканей. Участие апоптоза в восстановительных процессах было исследовано на двух видах губок - Leucosolenia variabilis и Aplysina cavernicola с разными типами регенерации (морфаллаксисом и эпимирфозом, соответственно). Апоптотирующие клетки присутствуют в районе раны у обоих видов, однако изученные виды различаются количеством и временем появления апоптотирующих клеток. У L. variabilis апоптоз происходит на всех изученных стадиях регенерации, но остается на очень низком уровне в том время, как у A. cavernicola имеют место 2 волны апоптоза клеток: на ранней стадии регенерации, когда происходит элиминация поврежденных клеток, и на поздней стадии – вероятно, для восстановление нормального физиологического состояния тканей в раневой области. Впервые была исследована пролиферация клеток в ходе реагрегации клеток губок на примере известковых губок L. variabilis и Sycon sp. Клетки в многоклеточных агрегатах обоих видов способны синтезировать ДНК и делиться митозом. Количество пролиферирующих клеток на ранних стадиях реагрегации значительно выше, чем в агрегатах на более поздних стадиях. Как и в интактных тканях, в агрегатах и примморфах хоаноциты демонстрируют пролиферативную активность, но их доля не такая значительная; в то же время пролиферация присутствует в клетках других типов, которые не удалось идентифицировать из-за отсутствия специфических маркеров. Также было показано, что по крайней мере часть хоаноцитов L. variabilis и Sycon sp. способны сохранять свою исходную дифференцировку в течении всего процесса реагрегации клеток. Эти данные указывают на неодинаковые потенции хоаноцитов известковых губок, отличаются от потенций хоаноцитов Demospongiae, которые полностью дедифференцируются к моменту формирования настоящих примморфов. Закончено и уточнено описание морфогенезов и трансформации клеток в ходе репаративной регенерации стенки тела асконоидной известковой губки Clathrina arnesenae (подкласс Calcinea), а также впервые описан ее клеточный состав. Впервые выявлены специализированные септированные межклеточные контакты. В отличие от известковых губок из подкласса Calcaronea единственным источником «эндопинакодермы» регенеративной мембраны (РМ) C. arnesenae являются пороциты. При трансформации пороциты, имеющие цилиндрическую форму, сперва замыкают наружное отверстие (в экзопинакодерме) и теряют связь с экзопинакоцитами. Затем принимают подковообразную на срезе форму. При этом они не теряют связь с внутренней средой. Далее эти клетки выселяются на внутреннюю поверхность трубки, расправляются, уплощаются и подстилают хоанодерму. Здесь они формируют между собой контакты, образуя сплошной монослой плоских «эндопинакоцитов» РМ. Хоаноциты при этом дедифференцируются, теряют межклеточные контакты и поклеточно вселяются в мезохил (также как они это делают при сокращении губки). В ходе дальнейшей регенерации, при восстановлении хоанодермы, с пороцитами происходит обратная трансформация, когда они сокращают свою поверхность и втягиваются в мезохил. Таким образом, этот процесс формирования внутренней выстилки РМ можно расценивать как своеобразный эпителиальный морфогенез, сопровождающийся сортировкой клеток, известной как радиальная интеркаляция. Этот механизм увеличения площади поверхности эпителиального слоя описан нами впервые для Porifera. Дедифференцированные хоаноциты, после полного формирования РМ, вновь вселяются во внутреннюю стенку РМ и редифференцируются в нормальные хоаноциты. Это тот же механизм, что при ритмичном сокращении и расслаблении рубки. То есть, это нормальный ее механизм. Возможно, что параллельно хоаноциты, окружающие РМ, начинают активно пролиферировать, заселяя РМ с периферии. Для более глубокого понимания клеточных и морфогенетических механизмов, сопровождающих регенерацию у демоспонгий, нами была изучена регенерация у средиземноморской губки Aplysina cavernicola. В ходе регенерации A. cavernicola мы выявили два основных клеточных источника новой экзопинакодермы: археоциты и хоаноциты. Восстановление хоаноцитных камер осуществляется, главным образом, за счет редифференциации хоаноцитов и, возможно, благодаря дифференциации археоцитов. Регенерационные процессы у этой губки сопровождаются двумя волнами апоптоза и изменением в пролиферативной активности клеток. Показано, что в отличие от известковых губок, у которых регенерация идет по типу морфаллаксиса, заживление раневой поверхности у демоспонгии A. cavernicola, включает элементы эпиморфоза. Этот тип регенерации характеризуется тем, что включает два основных процесса: (1) трансдифференцировку клеток, с их последующей редифференцировкой, (2) активное участие полипотентных клеток, мигрирующих к раневой поверхности (в данном случае, археоцитов и хоаноцитов) и (3) формирование бластемы. Морфогенез по типу мезенхимо-эпителиального перехода, является основным при регенерации эктосомы A. cavernicola.