Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Целью данного проекта является исследование структуры и динамики рибосомы в процессе отдельных реакций синтеза белка. В этом году было запланировано биохимическое и структурное изучение рибосомы в процессе транслокации. Транслокация – это сложный процесс, включающий в себя перемещение транспортных РНК (тРНК) и матричной РНК (мРНК) после присоединения очередной аминокислоты на рибосоме. Движение тРНК происходит благодаря постепенной замене контактов с рибосомой и элонгационным фактором EF-G, однако это очень быстрый процесс, вследствие чего структурно охарактеризованы только начальная и конечная конформации рибосомного комплекса. Одной из основных задач проекта этого года стал подбор условий, при которых реакция транслокации значительно замедляется, что позволило бы получить образцы рибосомных комплексов в процессе транслокации во время перемещения тРНК внутри рибосомы. В качестве специфических ингибиторов реакции транслокации использовались амикумацин А и спектиномицин. Второй основной задачей проекта стала визуализация структуры рибосомных комплексов при помощи метода криоэлектронной микроскопии (криоЭМ). Выбор данного метода обусловлен тем, что криоЭМ позволяет получать трехмерную структуру биологической макромолекулы в физиологических условиях. Решение выше описанных задач позволило бы детально охарактеризовать структуру и динамику рибосом на разных этапах биосинтеза белка. В ходе выполнения работ по проекту в этом году были получены и охарактеризованы индивидуальные компоненты для точного воссоздания процесса синтеза белка, происходящего в бактериальных клетках. В необходимых количествах были получены функционально активные рибосомы, тРНК, доставляющие аминокислоты к рибосомам, мРНК, содержащие запись последовательности аминокислот в белке, и белковые факторы (EF-Tu и EF-G), катализирующие отдельные реакции, происходящие на рибосоме. К тРНК были присоединены флуоресцентные метки для последующего наблюдения за траекторией и скоростью перемещения тРНК внутри рибосомы. При помощи спектрофлуориметра остановленного потока было охарактеризовано перемещение тРНК внутри рибосомы. Было показано, что изменение буферных условий, а также добавление антибиотиков спектиномицина и амикумацина А приводит к значительному (более, чем в 200 раз) снижению скорости протекания реакции транслокации. Были подобранны временные «окна», в которых тРНК находятся в определенных положениях, представляющих интерес для изучения. Для адгезии исследуемых образцов необходимо было подготовить микроскопические углеродные сетки. Для этого была отработана методика термического напыления сплошной пленки аморфного углерода толщиной около 15 нм на подложку из слюды с последующим переносом пленки в очищенной высокоомной воде на микроскопические углеродные сетки. Для придания поверхности углеродных сеток необходимых свойств и желаемой толщины, они обрабатывались тлеющим разрядом. Подбор времени обработки сетки с пленкой в плазме позволил достичь конечной толщины пленки менее 10 нм. Таким образом, удалось совместить в едином технологическом процессе преимущества, связанные с удобством и надежностью переноса относительно толстых (около 15 нм) пленок и получить конечную толщину пленки менее 10 нм, что является оптимальным для задач криоэлектронной микроскопии. Образцы наносили на сетки и мгновенно замораживали в жидком этане, охлажденном до температуры жидкого азота (-196 ˚C). В результате образцы были зафиксированы в тонком слое аморфного льда, что позволило исследовать рибосомные комплексы в нативном состоянии. Реконструкция трехмерной структуры рибосомных комплексов с антибиотиками проводилась в несколько этапов. Два раунда двухмерной классификации позволили выделить частицы, не содержащие явные следы загрязнений льдом или краями поддерживающей углеродной сетки, для дальнейшего анализа. На следующем этапе была произведена реконструкция трехмерной структуры с использованием выделенного набора изображений и последующая трехмерная классификация по ряду признаков. Дальнейшая работа по реконструкции структуры проводилась по следующим направлениям: получение структуры рибосомного комплекса в начальном, конечном и промежуточных состояниях в ходе транслокации. Анализ данных о локальном разрешении показывает, что значительный объем рибосомного комплекса реконструирован с разрешением лучше 2,8 Å. На следующем этапе производилось уточнение полноатомных моделей рибосомных комплексов. Было получено изображение электронной плотности, соответствующей спектиномицину, с вписанной в нее полноатомной моделью. Дальнейший анализ конформационной динамики тРНК при транслокации и окончательная сортировка позволили вписать в экспериментальную электронную плотность трехмерных структур полноатомные модели тРНК. Суперпозиция всех положений тРНК, обнаруженных в данном эксперименте, позволила визуализировать малейшие передвижения тРНК. Так, в эксперименте были обнаружены тРНК в начальном, конечном и двух различных промежуточных положениях тРНК в процессе транслокации.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Целью данного проекта является исследование структуры и динамики рибосомы в процессе отдельных реакций синтеза белка. В предыдущем году было начато биохимическое и структурное изучение рибосомы в процессе транслокации. Транслокация – это сложный процесс, включающий в себя перемещение транспортных РНК (тРНК) и матричной РНК (мРНК) после присоединения очередной аминокислоты на рибосоме. В прошлом году были подобраны условия, при которых реакция транслокации значительно замедляется, в результате чего удалось получить образцы рибосомных комплексов в процессе транслокации во время перемещения тРНК внутри рибосомы. В качестве специфических ингибиторов реакции транслокации использовались амикумацин А и спектиномицин. Криоэлектронно микроскопическое (криоЭМ) исследование позволило получить структуры рибосомных комплексов с высоким разрешением в процессе транслокации. В этом году было продолжено изучение транслокации с целью детальной характеристики молекулярного механизма действия ингибиторов транслокации амикумацина А и спектиномицина, а также описания перемещения тРНК в процессе транслокации. Дополнительные эксперименты по изучению престационарной кинетики транслокации показали, что основной механизм ингибирования биосинтеза белка антибиотиком амикумацином А связан с подавлением стадии транслокации, на которой он понижает не только скорость перемещения тРНК, но и ее количество, а также уменьшает долю рибосом, способных перейти на следующий цикл элонгации. В ходе структурной части исследования было идентифицировано новое промежуточное положение тРНК, которое является переходным при перемещении тРНК из А в Р сайт рибосомы в процессе транслокации. В этом году был проведен рентгеноструктурный анализ рибосомного комплекса, содержащего тРНК в А, Р и Е сайтах, мРНК и антибиотик спектиномицин. Разрешение рибосомного комплекса превысило разрешение ранее опубликованных данных и составило 2,6 Å. Спектиномицин связывается на малой субъединице рибосомы на небольшом расстоянии от антикодоновых областей А- и Р-сайтовых тРНК и соответствующих кодонов мРНК, однако непосредственных контактов с этими РНК не образует. При этом присутствие тРНК и мРНК не приводит к изменению положения связывания антибиотика. Лизин 25 белка S5 значительно приближается к антибиотику, однако в данной конформации контактов с ним не образует. Конформационные изменения, вызываемые или фиксируемые спектиномицином, могут приводить к изменению взаимодействий мРНК и рибосомы, что выражается в изменении геликазной активности рибосомы и нарушении транслокации. Второй изучаемой в данном проекте реакцией элонгации является аккомодация. Элонгационный фактор EF-Tu в ГТФ связанном состоянии доставляет аминоацилированную тРНК в А сайт рибосомы, где, после распознавания кодона мРНК происходит гидролиз ГТФ и EF-Tu теряет аффинность к тРНК и рибосоме. Происходит диссоциация фактора, а высвободившаяся тРНК аккомодируется в А сайте рибосомы и участвует в пептидилтрансферазной реакции. При помощи спектрофлуориметра остановленного потока было охарактеризовано перемещение тРНК при аккомодации. Было показано, что изменение буферных условий и использование бесфакторной доставки тРНК к рибосоме, а также добавление антибиотика тетрациклина приводит к значительному (более, чем в 200 раз) снижению скорости протекания реакций в А сайте. Были подобранны временные «окна», в которых тРНК находятся в определенных положениях, представляющих интерес для изучения. Также было показано, что наличие модифицированных оснований в составе тРНК влияет на скорость аккомодации. Методами времяразрешенной криоэлектронной микроскопии были подготовлены образцы, а также был осуществлен набор данных для анализа интермедиатов аккомодации для рибосомных комплексов в следующем году. Было проведено криомикроскопическое исследование претранслокационного рибосомного комплекса, содержащего антибиотик диритромицин. Интерес к структурным особенностям связывания данного антибиотика обусловлен его более высокой прочностью связывания по сравнению с предшественником эритромицином. Результаты показали, что, несмотря на наличие боковой цепи диритромицина, которая потенциально могла бы образовать дополнительные контакты с рибосомой и тем самым увеличить прочность связывания, боковая цепь антибиотика не увеличивает количество связей ни с основаниями рРНК, ни и с рибосомными белками. Скорее всего, повышение аффинности взаимодействия диритромицина с рибосомой является результатом модификации лактонового кольца, приводящей к его стабилизации в результате возникновения устойчивого и жесткого шестичленного кольца. Это, в свою очередь, приводит к снижению возможных конформационных состояний антибиотика и стабилизации его связывания в пептидном канале.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В этом году была завершена работа по изучению механизма взаимодействия антибиотика диритромицина (ДИР) с рибосомными комплексами E. coli и T. thermophilus. Методом рентгеноструктурного анализа был обнаружен дополнительный контакт гидрофобного радикала ДИР, являющийся основной отличительной особенностью ДИР от его предшественника эритромицина (ЭРИ), с гистидином 69 рибосомного белка uL4. Методом крио-ЭМ было установлено, что в случае рибосом E. coli гидрофобный радикал ДИР направлен в просвет выходного тоннеля рибосомы E. coli и не образует дополнительные контакты. Данные биохимического анализа показали, что ни наличие гидрофобного радикала, ни образование дополнительного контакта не приводят к повышению прочности связывания ДИР с рибосомами. При этом ДИР продемонстрировал почти двукратное увеличение ингибиторной активности по сравнению с ЭРИ в случае использования рибосом E. сoli. Основываясь на данных, полученных при помощи метода криоэлектронной микроскопии, мы предполагаем, что более выраженное ингибирование биосинтеза белка является следствием расположения гидрофобного радикала ДИР: он направлен в просвет выходного тоннеля, частично его закрывает, что приводит к нарушению нормального прохождения растущего пептида сквозь тоннель, ингибируя синтез полипептидной цепочки. Разрешение полученного комплекса 2,1 Å является на сегодняшний день рекордным среди опубликованных крио-ЭМ структур рибосомных комплексов и может явиться фундаментом для дальнейших исследований рибосомных комплексов, содержащих более длинные пептиды, простирающихся на различную глубину выходного тоннеля рибосомы. В этом году была проведена дополнительная верификация репортерной системы, использованной в прошлом году для анализа престационарной кинетики реакции аккомодации. Было показано, что обе системы (с метками BODIPY FL на акцепторном конце и профлавин в области локтя инициаторной тРНК) могут использоваться для характеристики реакции аккомодации. Результирующая скорость данной реакции, определенная этими системами, находится в близком, указывая на взаимозаменяемость обеих репортерных систем. Было показано, что антибиотик амикумацин А не влияет на этап доставки тРНК в А сайт, однако несколько изменяет аккомодацию тРНК в А сайте. Использование метки профлавин в составе тройного комплекса (EF-Tu·ГТФ·Phe-tRNAPhe(Prf16/17)) позволило установить ускорение аккомодации при добавлении антибиотика, что потенциально может приводить к не совсем корректному позиционированию тРНК. Это предположение находится в соответствии с данными второй репортерной системы (с меткой BODIPY FL на акцепторном конце инициаторной тРНК), продемонстрировавшими снижение амплитуды сигнала, то есть снижение эффективности образования конечного продукта. Можно заключить, что молекулярный механизм действия амикумацина достаточно сложный. Помимо эффекта, который данный антибиотик оказывает на транслокацию (описано в промежуточных отчетах за 2017-2018 годы), нами было обнаружено дополнительное ингибирующее действие этого агента на синтез белка на этапе аккомодации тРНК в А сайте бактериальной рибосомы. В условиях стресса в бактериальных клетках резко возрастает уровень алармонов (p)ppGpp, что приводит к переориентированию белкового синтеза. Ранее считалось, что подобное влияние происходит исключительно на этапе транскрипции. В нашей работе мы показываем, что эта регуляция осуществляется также и на этапе трансляции, в частности, на этапе инициации. Инициирующая рибосома детектирует клеточный пул гуаниновых нуклеотидов и регулирует свое продвижение в направлении синтеза белка. Было показано, что гуаниновые нуклеотиды действуют как кофакторы инициаторного фактора 2 (IF2), модулируя его способность позиционировать инициаторную тРНК во время инициации трансляции (GTP/GDP) или в случае строго ответа (GTP/pppGpp/ppGpp). Более того, наши результаты показывают, что сродство к GTP и ингибирующая концентрация ppGpp для IF2, связанного с 30S рибосомной субъединицей, варьируются в зависимости от мРНК, которая участвует в образовании рибосомного комплекса. мРНК TufA увеличивает сродство к GTP для 30S инициаторных комплексов, что приводит к повышению толерантности к ppGpp и обеспечивает эффективный синтез белка. И наоборот, мРНК InfA позволяет ppGpp конкурировать с GTP за IF2, нарушая формирование продуктивного 30S инициаторного комплекса. Данные моделирования нетранслирующего участка мРНК mTufA позволяют утверждать, что данная область мРНК образует пространственные структуры, которые обеспечивают повышенную толерантность к ppGpp рибосомных комплексов с мРНК mTufA. В дальнейшем мы собираемся изучить данный аспект при помощи метода криоЭМ. Впервые в этой работе мы показываем, что IF2 может использовать pppGpp для обеспечения образования 30S инициаторных комплексов, хотя это требует более высокой концентрации фактора и приводит к более медленному переходу к элонгации трансляции. В целом наши данные раскрывают новый регуляторный механизм, действующий во время инициации синтеза белка. Реализация этого механизма позволяет бактериям использовать разные физиологические концентрации ppGpp для модуляции своего протеома в стрессовых условиях.