КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-15-01290

НазваниеЯдерная ламина как потенциальная мишень для ингибирования метастазирования злокачественных опухолей

РуководительКиреев Игорь Игоревич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова", г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2017 - 2019

КонкурсКонкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-208 - Онкология

Ключевые словаканцерогенез, метастазирование, ядерная оболочка, ламина, прогерия, механотрансдукция, внеклеточный матрикс, металлопротеазы

Код ГРНТИ76.03.33


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Рак является наиболее социально значимым заболеванием и одной из основных причин смерти в мире. Появление дисморфных ядер является обычным признаком злокачественной трансформации, что подчеркивает тесную связь между процессами канцерогенеза и особенностями организации и функционирования ядерной оболочки, и в первую очередь ядерной ламины, одной из основных функций которой является контроль формы и механических свойств ядерной оболочки и клеточного ядра в целом. Другим важным аспектом функционирования ядерной ламины является ее участие в передаче внутриклеточных сигналов посредством механотрансдукции. Кроме того, наиболее негативными последствиями развития рака является метастазирование раковых клеток и их инвазия во внутренние органы – процессы, связанные с миграцией раковых клеток, протекающей в условиях ограниченного пространства, лимитированного наличием фибриллярных структур межклеточного матрикса и тканевых комплексов с узким межклеточным пространством. Эффективность миграции/метастазирования в этих условиях зависит от механической пластичности клеток и их способности геометрически адаптироваться к архитектурным особенностям окружающей среды. Механические свойства ядра как наиболее крупной органеллы клетки, таким образом, оказывают существенное влияние на способность раковых клеток к метастазированию, что делает ядерную ламину и ее молекулярные компоненты потенциально эффективным биомаркером злокачественной трансформации и перспективной мишенью для разработки новых подходов к терапии рака. В настоящем проекте планируется на in vitro-системах, моделирующих процессы метастазирования и инвазии (проточные камеры с микроканалами, Transwell с вариабильным размером пор, коллагеновый 3D-матрикс с различной плотностью) и на in vivo моделях исследовать связь между метастатической активностью раковых клеток и составом и механическими свойствами ядерной ламины, а также изучить влияние искусственного модулирования уровня экспрессии основного структурного компонента ламина – ламина А и его вариантов, в том числе сплайс-изоформы прогерина, ассоциированной с процессами преждевременного и нормального старения, на способность раковых клеток к метастазированию. Мембранная цинк-зависимая металлопротеаза ZMPSTE24 является ключевым элементом процесса формирования ядерной ламины, ответственным за созревание ламина А, нарушение функции которой ведет к накоплению прогерина. Регуляция активности ZMPSTE24 представляет собой особый интерес в связи с возможностью модуляции состава ламины, ее жесткости и динамических свойств. Одной из задач проекта является поиск с использованием методов биоинформатики, молекулярного моделирования и компьютерного скрининга ZMPSTE24-ориентированных селективных ингибиторов как потенциальных средств индукции повышенной механической прочности ядерной ламины и торможения метастазирования опухолей и оценка их эффективности на экспериментальных моделях in vitro и in vivo.

Ожидаемые результаты
В ходе работы над проектом будут получены следующие результаты: 1) будут установлены закономерности, связывающие особенности структурной организации и белкового состава ядерной оболочки со способностью раковых клеток к миграции в условиях ограниченного пространства; 2) будет исследовано влияние сплайс-изоформ белка ядерной оболочки ламина А, ассоцииированных с нормальным и ускоренным старением, на процессы метастазирования и инвазии раковых клеток; 3) будут разработаны новые методы воздействия на процессы роста и метастазирования раковых опухолей, основанные на модуляции белкового состава ядерной ламины при помощи ингибиторов процессинга преламина А. Полученные результаты могут послужить основой для разработки новых классов антираковых препаратов для терапии высокоинвазивных видов злокачественных опухолей. Полученные в ходе выполнения проекта результаты будут соответствовать международному уровню исследований в данной области науки и будут опубликованы в высокорейтинговых научных журналах, индексируемых с системах WoS и Scopus.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Метастазирование злокачественных опухолей - один из основных факторов, затрудняющих борьбу с раковыми заболеваниями и являющихся причиной смертности. Повышенная пластичность клеточного ядра в раковых клетках за счет снижения экспрессии белков ядерной ламины облегчает их миграцию в условиях ограниченного пространства межклеточного матрикса. Целью настоящего проекта является поиск подходов для ингибирования метастазирования, основанных на увеличении ригидности клеточного ядра за счет экспрессии патологического сплайс-варианта ламина А - прогерина. В 2017 году работы над проектом велись по двум направлениям. Во-первых, разрабатывались модельные системы для исследования роли модуляции структуры и состава ядерной ламина на подвижность клеток и методы визуализации миграции клеток с суперэкспрессией или нокдауном ламинов. Были созданы генетические конструкции для экспрессии GFP-вариантов ламинов А, В1 и прогерина в клетках млекопитающих и на их основе генерированы клеточные линии с разным уровнем экзогенных ламинов. Были оптимизированы условия высокопроизводительного микроскопического скрининга для анализа подвижности клеток на 2D-субстрате и в микроканалах в зависимости от уровня экспрессии белков ламины. Были также оптимизированы протоколы пробоподготовки для иммуноэлектронной микроскопии для изучения взаимодействий специфических фракций хроматина с ядерной оболочкой. Во-вторых, при помощи in silico моделирования структуры ключевого фермента процессинга преламина А Zmpste24 с использованием методов молекулярной динамика были определены ключевые участки фермента, определяющие характер его взаимодействия с мембраной и субстратом - фарнезилированным C-концом преламина А, и создана модель расположения субстрата в активном центре. На основе полученной модели будет в дальнейшем осуществляться виртуальный скрининг библиотек химических соединений для поиска ингибиторов Zmpste24.

 

Публикации


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения проекта в 2018 году: Выявлены различия в структурной организации ядерной ламины Ras-трансформированных фибробластов хомячка HET с различным метастатическим потенциалом in vivo. На моделях миграции клеток в ограниченном пространстве in vitro показано, что экспрессия прогерина и экзогенного ламина А значительно снижает способность трансформированных клеток мигрировать через поры, тогда как нокдаун ламина А не влияет на миграционную активность. Разработаны методические подходы для прямого измерения жесткости ядер в живых культивируемых клетках при помощи сканирующей ион-проводящей микроскопии (SICM) в зависимости от уровня экспрессии сплайс-вариантов ламина А, для микроскопического анализа миграции живых клеток в коллагеновом 3D-геле методом микроскопии планарного освещения (SPIM) с увеличенным полем зрения и гомогенным максимальным аксиальным разрешением. Исследовано влияние прогерина на структуру и позиционирование гетерохроматина. Для искусственных хромосомных локусов, содержащих амплифицированные повторы Lac-оператора, степень компактизации и связь с ядерной оболочкой не нарушаются, тогда как для эндогенного гетерохроматина показано отделение компактных гетерохроматиновых доменов от ядерной оболочки и образование протяженных свободных участков ядерной ламины. Разработан in silico метод поиска сайтов связывания, а также пути доставки молекул из раствора, с учетом как интерфейса фермент-липиды-вода, так и самой динамической структуры фермента и окружающей мембраны. Метод основывается на применении моделирования молекулярной динамики в сочетании с расширенным методом метадинамики. Данным методом исследованы особенности взаимодействия Zmpste24 с лопинавиром и выявлены функционально важные заряженные и гидрофобные группы фермента со специфическим паттерном распределения в пространстве, которые будут использованы для оптимизации структуры новых ингибиторов с более высокой эффективностью проникновения в центр связывания и повышенной селективностью.

 

Публикации

1. Алиева И.Б., Голышев С.А., Жиронкина О.А., Киреев И.И., Курчашова С.Ю., Стрелкова О.С., Узбеков Р.Э. Методы клеточной биологии и цитогенетики Издательство "Перо", Москва, - (год публикации - 2018).

2. Киреев И., Лаврушкина С., Александрова А., Любошенко И. Light-sheet microscopy with synchronized multidirectional laser beam waist sweeping Optics Express, - (год публикации - 2019).

3. Лаврушкина С.В., Овсянникова Н.Л., Юдина А.С., Стрелкова О.С., Жиронкина О.А., Киреев И.И. Канцерогенез и старение: взгляд со стороны ядерной ламины Цитология, том 60, №11, стр.892-894 (год публикации - 2018).

4. Лаврушкина С.В., Овсянникова Н.Л., Юдина А.С., Стрелкова О.С., Жиронкина О.А., Перепелина К.И., Малашичева А.Б., Киреев И.И. Роль механических свойств ядра в поддержании гомеостаза тканей Цитология, т.60, №11, стр.911-914 (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В качестве отправной точки для оптимизации моделей взаимодействия ингибиторов с ферментом ZMPSTE24 был использован класс молекул, применяемых в антиретровирусной терапии пациентов с ВИЧ, в качестве побочного эффекта которых обнаруживается липодистрофия. Обнаружилось, что липодистрофия возникает в результате нецелевого связывания этих молекул с ZMPSTE24. При этом наиболее эффективным образом показал себя ингибитор протеазы ВИЧ лопиновир, для которого экспериментально показан конкурентный механизм ингибирования ZMPSTE24. К сожалению, получить структуру комплекса методом рентгеноструктурного анализа пока не удалось, поэтому для изучения связывания лопинавира с ZMPSTE24 была создана модель ингибитора с использованием квантового моделирования. Используя новую модель лопинавира, проведено компьютерное моделирование молекулярной динамики, расширенное методом метадинамики, для поиска состояний ингибитора в ZMPSTE24, находящегося в составе мембраны, и ранжирование этих состояний по энергии. Наиболее выгодное положение лопинавира оказалось на интерфейсе между белком и мембраной, в месте около канала в активный центр. Анализ показывает, что в данном месте за счет взаимодействия с белком мембрана прогибается, что позволяет ингибитору проще проникать в пространство между липидами и белком. Найденное положение лопинавира позволило разработать метод идентификации и подобрать более селективные ингибиторы с таким же механизмом действия. Эксперименты по влиянию лопинавира на клеточные культуры показали накопление непроцессированной формы ламина А и, как следствие этого, ингибирование миграции клеток через узкие каналы из-за повышения жесткости ядерной оболочки в кратковременных (до двух суток) экспериментах. В то же время, значительных изменений общей морфологии ядер в клетках, обработанных лопинавиром, а также изменений подвижности на свободном субстрате не наблюдалось, что может говорить о сравнительно низкой эффективности действия лопинавира. Этот факт подчеркивает необходимость дизайна более селективных ингибиторов ZMPSTE24 для применения в антираковой терапии (https://academia.interfax.ru/ru/news/articles/3243/; https://www.gazeta.ru/science/news/2019/07/12/n_13203367.shtml; https://www.mk.ru/science/2019/07/12/uchenye-mgu-nashli-sposob-priblizit-starost-rakovykh-kletok.html; https://nauka.tass.ru/nauka/6658786; https://indicator.ru/biology/rossijskie-biologi-predlozhili-sostarit-rakovye-kletki-12-07-2019.htm; https://ria.ru/20190712/1556460126.html; https://www.poisknews.ru/news/obmanut-rak-uchenye-predlozhili-novyj-metod-borby-s-metastazami/).

 

Публикации

1. - Ученые предложили "состарить" раковые клетки для предотвращения их распространения Интерфакс, Москва. 12 июля. ИНТЕРФАКС (год публикации - ).

2. - Российские биологи предложили «состарить» раковые клетки для предотвращения метастазов Газета.ру, АО «Газета.Ру» (1999-2019) - Главные новости дня, 12.07.2019 (год публикации - ).

3. - Ученые МГУ нашли способ приблизить «старость» раковых клеток Московский комсомолец, "Московский комсомолец" №28023 от 16 июля 2019 (год публикации - ).

4. - В России разрабатывают метод борьбы с метастазами с помощью состаривания раковых клеток ТАСС, МОСКВА, 12 июля. /ТАСС/ (год публикации - ).

5. - Российские биологи нашли способ «состарить» раковые клетки INDICATOR.RU, - (год публикации - ).

6. - Ускоренное старение поможет победить рак, заявляют российские ученые РИА Новости, - (год публикации - ).

7. - Обмануть рак. Ученые предложили новый метод борьбы с метастазами Поиск, - (год публикации - ).

8. Ашапкин В.В., Кутуева Л.И., Курчашова С.Ю., Киреев И.И. Are There Common Mechanisms Between the Hutchinson–Gilford Progeria Syndrome and Natural Aging? Frontiers in genetics, 10:455 (год публикации - 2019).

9. Игнатова А., Демина И., Птушкин В., Хаспекова С., Шустова О., Панкрашкина М., Рябых А., Обыденный С., Стрелкова О., Полохов В., Серегина Е., Полетаев А., Атаулханов Ф., Киреев И., Мазуров А., Масчан А., Новичкова Г., Пантелеев М. Evolution of platelet function in adult patients with chronic immune thrombocytopenia on romiplostim treatment British Journal of Haematology, - (год публикации - 2019).

10. Киреев И.И., Закиров А.Н., Сосновская С.Ю.,Стрелкова О.С., Жиронкина О.А. Looking for an order in chaos: approaches to mapping chromosomal loci for cryo-EM studies. International Journal of Biomedicine, 9(S1):8 (год публикации - 2019).

11. Колмогоров В., Алова А., Юдина А., Гаранна А., Ерофеев А., Киреев И., Мажуга А., Эдвардс С., Корчев В., Новак П., Клячко Н. Effect of therapeutic agents on tumor cell compartments studied by local measurement of cell stiffness via Scanning Ion-Conductance Microscopy EUROPEAN BIOPHYSICS JOURNAL WITH BIOPHYSICS LETTERS, 48(S1):S101-S101 (год публикации - 2019).

12. Колмогоров В., Алова А., Юдина А., Ерофеев А., Горелкин П., Клячко Н., Киреев И., Мажуга А., Эдвардс С., Корчев В., Новак П. Drug-induced alterations in cancer cell compartments studied by local stiffness measurement via Scanning Ion-Conductance Microscopy FEBS open bio, 9 (S1):168-169 (год публикации - 2019).

13. Лаврушкина С., Овсянникова Н., Юдина А., Стрелкова О., Жиронкина О., Перепелина К., Малашичева А., Киреев И. The Role of Mechanical Properties of the Nucleus in Maintaining Tissue Homeostasis Cell and Tissue Biology, 13(3):237-241 (год публикации - 2019).

14. Лаврушкина С., Овсянникова Н., Юдина А.,Колмогоров В., Горелкин П., Стрелкова О., Жиронкина О., Перепелина К., Малашичева А., Киреев И. Mutations in different domains of lamin A change the mechanical properties of the nucleus Biopolymers and cells, 35(3):220-221 (год публикации - 2019).

15. Обыденный С., Артеменко Е., Свешникова А., Игнатова А,, Варламова Т,, Гамбарян С., Ломакина Г., Угарова Н., Киреев И., Атауллханов Ф., Новичкова Г., Масчан А., Щербина А., Пантелеев М. Mechanisms of increased mitochondria-dependent necrosis in Wiskott-Aldrich syndrome platelets Haematologica, 104 (год публикации - 2019).

16. Овсянникова Н., Лаврушкина С., Юдина А., Стрелкова О., Жиронкина О., Киреев И. The role of the nuclear lamina in cell migration: the connection with aging and metastasis Biopolymers and cells, 35(3):227-228 (год публикации - 2019).