Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Метастазирование злокачественных опухолей - один из основных факторов, затрудняющих борьбу с раковыми заболеваниями и являющихся причиной смертности. Повышенная пластичность клеточного ядра в раковых клетках за счет снижения экспрессии белков ядерной ламины облегчает их миграцию в условиях ограниченного пространства межклеточного матрикса. Целью настоящего проекта является поиск подходов для ингибирования метастазирования, основанных на увеличении ригидности клеточного ядра за счет экспрессии патологического сплайс-варианта ламина А - прогерина. В 2017 году работы над проектом велись по двум направлениям. Во-первых, разрабатывались модельные системы для исследования роли модуляции структуры и состава ядерной ламина на подвижность клеток и методы визуализации миграции клеток с суперэкспрессией или нокдауном ламинов. Были созданы генетические конструкции для экспрессии GFP-вариантов ламинов А, В1 и прогерина в клетках млекопитающих и на их основе генерированы клеточные линии с разным уровнем экзогенных ламинов. Были оптимизированы условия высокопроизводительного микроскопического скрининга для анализа подвижности клеток на 2D-субстрате и в микроканалах в зависимости от уровня экспрессии белков ламины. Были также оптимизированы протоколы пробоподготовки для иммуноэлектронной микроскопии для изучения взаимодействий специфических фракций хроматина с ядерной оболочкой. Во-вторых, при помощи in silico моделирования структуры ключевого фермента процессинга преламина А Zmpste24 с использованием методов молекулярной динамика были определены ключевые участки фермента, определяющие характер его взаимодействия с мембраной и субстратом - фарнезилированным C-концом преламина А, и создана модель расположения субстрата в активном центре. На основе полученной модели будет в дальнейшем осуществляться виртуальный скрининг библиотек химических соединений для поиска ингибиторов Zmpste24.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения проекта в 2018 году: Выявлены различия в структурной организации ядерной ламины Ras-трансформированных фибробластов хомячка HET с различным метастатическим потенциалом in vivo. На моделях миграции клеток в ограниченном пространстве in vitro показано, что экспрессия прогерина и экзогенного ламина А значительно снижает способность трансформированных клеток мигрировать через поры, тогда как нокдаун ламина А не влияет на миграционную активность. Разработаны методические подходы для прямого измерения жесткости ядер в живых культивируемых клетках при помощи сканирующей ион-проводящей микроскопии (SICM) в зависимости от уровня экспрессии сплайс-вариантов ламина А, для микроскопического анализа миграции живых клеток в коллагеновом 3D-геле методом микроскопии планарного освещения (SPIM) с увеличенным полем зрения и гомогенным максимальным аксиальным разрешением. Исследовано влияние прогерина на структуру и позиционирование гетерохроматина. Для искусственных хромосомных локусов, содержащих амплифицированные повторы Lac-оператора, степень компактизации и связь с ядерной оболочкой не нарушаются, тогда как для эндогенного гетерохроматина показано отделение компактных гетерохроматиновых доменов от ядерной оболочки и образование протяженных свободных участков ядерной ламины. Разработан in silico метод поиска сайтов связывания, а также пути доставки молекул из раствора, с учетом как интерфейса фермент-липиды-вода, так и самой динамической структуры фермента и окружающей мембраны. Метод основывается на применении моделирования молекулярной динамики в сочетании с расширенным методом метадинамики. Данным методом исследованы особенности взаимодействия Zmpste24 с лопинавиром и выявлены функционально важные заряженные и гидрофобные группы фермента со специфическим паттерном распределения в пространстве, которые будут использованы для оптимизации структуры новых ингибиторов с более высокой эффективностью проникновения в центр связывания и повышенной селективностью.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В качестве отправной точки для оптимизации моделей взаимодействия ингибиторов с ферментом ZMPSTE24 был использован класс молекул, применяемых в антиретровирусной терапии пациентов с ВИЧ, в качестве побочного эффекта которых обнаруживается липодистрофия. Обнаружилось, что липодистрофия возникает в результате нецелевого связывания этих молекул с ZMPSTE24. При этом наиболее эффективным образом показал себя ингибитор протеазы ВИЧ лопиновир, для которого экспериментально показан конкурентный механизм ингибирования ZMPSTE24. К сожалению, получить структуру комплекса методом рентгеноструктурного анализа пока не удалось, поэтому для изучения связывания лопинавира с ZMPSTE24 была создана модель ингибитора с использованием квантового моделирования. Используя новую модель лопинавира, проведено компьютерное моделирование молекулярной динамики, расширенное методом метадинамики, для поиска состояний ингибитора в ZMPSTE24, находящегося в составе мембраны, и ранжирование этих состояний по энергии. Наиболее выгодное положение лопинавира оказалось на интерфейсе между белком и мембраной, в месте около канала в активный центр. Анализ показывает, что в данном месте за счет взаимодействия с белком мембрана прогибается, что позволяет ингибитору проще проникать в пространство между липидами и белком. Найденное положение лопинавира позволило разработать метод идентификации и подобрать более селективные ингибиторы с таким же механизмом действия. Эксперименты по влиянию лопинавира на клеточные культуры показали накопление непроцессированной формы ламина А и, как следствие этого, ингибирование миграции клеток через узкие каналы из-за повышения жесткости ядерной оболочки в кратковременных (до двух суток) экспериментах. В то же время, значительных изменений общей морфологии ядер в клетках, обработанных лопинавиром, а также изменений подвижности на свободном субстрате не наблюдалось, что может говорить о сравнительно низкой эффективности действия лопинавира. Этот факт подчеркивает необходимость дизайна более селективных ингибиторов ZMPSTE24 для применения в антираковой терапии (https://academia.interfax.ru/ru/news/articles/3243/; https://www.gazeta.ru/science/news/2019/07/12/n_13203367.shtml; https://www.mk.ru/science/2019/07/12/uchenye-mgu-nashli-sposob-priblizit-starost-rakovykh-kletok.html; https://nauka.tass.ru/nauka/6658786; https://indicator.ru/biology/rossijskie-biologi-predlozhili-sostarit-rakovye-kletki-12-07-2019.htm; https://ria.ru/20190712/1556460126.html; https://www.poisknews.ru/news/obmanut-rak-uchenye-predlozhili-novyj-metod-borby-s-metastazami/).